全 文 ：工 艺 技 术
2014年第4期
Vol . 35 , No . 04 , 2014
响应面法优化山稔叶总黄酮
提取工艺的研究
吴萍萍，赖曼萍，尹艳艳，黄儒强
（华南师范大学，广东广州 510631）
摘 要：在提取温度、乙醇体积分数、液固比、提取时间4个单因素实验基础上，利用响应面分析法对回流法提取山稔
叶总黄酮的最佳工艺进行了研究。结果表明，最优提取条件为提取温度73℃、乙醇体积分数50%、液固比19∶1（mL/g）、
提取时间124min，总黄酮提取率为5.426%，与模型预测值基本相符。山稔叶总黄酮对DPPH自由基清除作用呈一定的
量效关系，其半数抑制浓度为9.797μg/mL。
关键词：山稔叶，总黄酮，响应面，二苯基苦味酰基苯肼
Optimization of extracting total flavonoids from leaves of
Rhodomyrtus tomentosa（Ait.） Hassk by response surface methodology
WU Ping-ping，LAI Man-ping，YIN Yan-yan，HUANG Ru-qiang
（College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631，China）
Abstract：Based on single factor experiments，extraction conditions concluding extraction temperature，ethanol
concentration，liquid-solid ratio and extraction time were optimized using response surface methodology. The
results showed that the optimal extraction conditions were as follows：extraction temperature 73℃ ，ethanol
concentration 50%，liquid-solid ratio 19∶1（mL/g） and extraction time 124min，resulting in an extraction efficiency
of 5.426% for total flavonoids which was consistent with the predicted value. In addition，total flavonoids from
leaves of R. tomentosa had scavenging effect on DPPH with a dose-effect relationship，and the IC50 was
9.797μg/mL.
Key words：leaves of R. tomentosa；total flavonoids；response surface；DPPH
中图分类号：TS255.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2014）04-0223-06
收稿日期：2013－08－02
作者简介：吴萍萍（1988-），女，硕士研究生在读，研究方向：天然产物
研究与开发。
基金项目：广东省农业攻关计划（2006B20401017）。
山稔（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk），为桃
金娘科植物，主要分布在中国、日本、泰国等东南亚
地区[1]。传统医学认为，山稔叶味甘、涩，性平，可用于
治疗痢疾、泄泻、极性肠胃炎、外伤出血等[2]。现代药
理研究表明山稔叶提取物具有抗氧化、抑菌、消炎、
保护胃肠消化系统、降血压、促进成骨细胞增长等功
效[3-7]。已有研究表明山稔叶中含有黄酮类化合物[4，8]，
而黄酮类化合物具有广泛的生理和药理功能，是目
前国内外重点研究和应用的天然植物功能性成分，
被广泛应用于食品、保健品、医药、化妆品等领域。
黄酮类化合物的提取方法有很多，如水提法、有
机溶剂提取法、超临界CO2萃取法、微波法、超声波
法、高速逆流色谱法（HSCCC）等 [9]。响应曲面法
（Response Surface Methodology，RSM），是一种囊括
了众多实验和统计技术的实验优化方法，它可以建
立连续变量曲面模型，对实验的各个水平进行分析，
确定最佳水平范围[10]。
目前，国内外对山稔叶药理活性方面的研究较
多，但是有关山稔叶中总黄酮的提取鲜有报道，因
此，本文对山稔叶总黄酮的提取工艺进行研究，采用
乙醇回流法，用单因素实验对提取温度、乙醇体积分
数、液固比、提取时间4个因素进行分析，并通过响应
曲面法优化得到其最佳提取工艺，同时研究了山稔
叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力，以期为山稔叶
黄酮资源的开发与综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山稔叶 于2012年10月8日采自广东省河源市；
芦丁标准品 中国药品生物制品检定所；二苯基苦
味酰基苯肼（DPPH） Sigma公司；亚硝酸钠、硝酸
铝、氢氧化钠、乙醇、石油醚等 均为分析纯。
DJ-10A型电动植物粉碎机 上海淀久中药机
械制造有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 常州澳
华仪器有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机 上海
市离心机械研究所有限公司；SFG-02B.600型电热恒
温鼓风干燥箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司；
VIS-723N可见光光度计 北京瑞利分析仪器公司。
223
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.04.032
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2014年第4期
1.2 实验方法
1.2.1 芦丁标准曲线的绘制[11] 精确称取0.0100g芦
丁标准品，用乙醇溶解后定容至100mL，即得0.1000g/L
芦丁标准液。分别精确吸取芦丁标准液0.0、2.0、4.0、
6.0、8.0、10.0mL于6支25mL比色管中，用75%乙醇定
容至10mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.7mL，摇匀，静置
5min后，加入10%硝酸铝0.7mL，摇匀，静置5min，再
加入1mol/L氢氧化钠5mL，并用75%乙醇定容至25mL，
摇匀，静置10min后，以芦丁空白为对照，在波长
510nm处测定吸光度值。以吸光度值对芦丁质量浓
度作图，绘制芦丁标准曲线，见图1。经线性回归得
到方程：y=12.5x-0.001（y：吸光度，x：浓度，mg/mL），
R2=0.9997。
1.2.2 材料预处理 将采摘的山稔叶晒干后，粉碎
（40目）。取山稔叶粉末于索氏提取器中，用石油醚作
溶剂，回流提取5h，去除叶绿素等脂类物质，将预处
理后的山稔叶粉末50℃烘干，置于干燥器中保存。
1.2.3 山稔叶总黄酮的提取 准确称取预处理的山
稔叶粉末1.00g，至于100mL圆底烧瓶中，加入提取剂
进行回流提取，冷却，5000r/min离心10min，取上清液
1mL，测定总黄酮含量。
1.2.4 山稔叶总黄酮含量的测定 准确量取已制备
好的山稔叶总黄酮提取液1mL，总黄酮的提取率计
算公式如下：
总黄酮提取率（%）= c×25×V
1×1000
×100
式中，c为1mL提取液定容后的芦丁含量，mg/mL；
1为从提取液中吸取的体积，mL；25为1mL提取液定
容后的体积，mL；V为提取总黄酮时用的乙醇体积，
mL；1000为山稔叶粉质量，mg。
1.2.5 乙醇回流提取法单因素实验
1.2.5.1 提取温度 准确称取预处理的山稔叶粉末
1.00g，按液固比30∶1（mL/g）加入75%乙醇水溶液，分
别在40、50、60、70、80、90℃条件下，回流提取60min。
1.2.5.2 乙醇体积分数 准确称取预处理的山稔叶
粉末1.00g，按液固比30∶1（mL/g）加入乙醇体积分数
分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶
液，50℃回流提取60min。
1.2.5.3 液固比 准确称取预处理的山稔叶粉末
1.00g，按液固比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1
（mL/g）加入75%乙醇水溶液，50℃回流提取60min。
1.2.5.4 提取时间 准确称取预处理的山稔叶粉末
1.00g，按液固比30∶1（mL/g）加入75%乙醇水溶液，50℃
分别回流提取60、80、100、120、140、160min。
1.2.6 响应曲面实验 根据单因素实验结果，以提
取温度、乙醇体积分数、液固比、提取时间4个因素作
为响应变量，根据Box-Behnken中心组合设计建立四
因素三水平数学模型，以山稔叶总黄酮的提取率为
响应值，利用Design Expert 8.0.5b软件进行数据拟
合，实验因素及水平见表1。
1.2.7 山稔叶总黄酮清除DPPH自由基活性测定 量
取2.0mL不同浓度（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、
25、30μg/mL）的总黄酮提取液，加入2.0mL 200μmol/L
DPPH（乙醇），室温放置30min后，测定反应液在
517nm处的吸光度，并通过下式计算DPPH清除率[12]。
清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100
式中：A0为DPPH的吸光度，A1为最终反应液的
吸光度。
2 结果与分析
2.1 乙醇回流提取法单因素实验结果
2.1.1 提取温度对山稔叶总黄酮提取率的影响 由
图2可知，随着温度的增加，总黄酮提取率先升后降，
温度在40～70℃，黄酮提取率急剧上升，70℃时达到
最大值，温度继续增加时，黄酮提取率下降，并趋于
平稳。这是因为在一定温度范围内，随着温度的升
高，分子解附和扩散运动速度加快，从而有利于提高
黄酮提取量。但是不能无限制的增大温度，太高的温
度会对黄酮类化合物的稳定性有影响。所以本实验
选择提取温度为70℃。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard curve of rutin
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
吸
光
度
芦丁浓度（mg/mL）
水平
因素
A 提取温度
（℃）
B 乙醇体积分数
（%）
C 液固比
（mL/g）
D 提取时间
（min）
-1 60 40 15∶1 100
0 70 50 20∶1 120
1 80 60 25∶1 140
表1 响应面实验的因素和水平设计表
Table 1 Factors and levels of RSM
图2 提取温度对山稔叶总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of temperature on extraction efficiency of
total flavonoids
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
30 40 50 60 70 80 90 100
提
取
率
（
%）
提取温度（℃）
224
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2014年第4期
Vol . 35 , No . 04 , 2014
图5 提取时间对山稔叶总黄酮提取率的影响
Fig.5 Effect of time on extraction efficiency of total flavonoids
4.1
3.9
3.7
3.5
3.3
3.1
40 60 80 100 120 140 160 180
提
取
率
（
%）
提取时间（min）
组号 A B C D Y：提取率（%）
1 -1 -1 0 0 3.455
2 1 -1 0 0 4.576
3 -1 1 0 0 3.341
4 1 1 0 0 4.613
5 0 0 -1 -1 4.387
6 0 0 1 -1 4.032
7 0 0 -1 1 4.561
8 0 0 1 1 4.525
9 -1 0 0 -1 3.400
10 1 0 0 -1 4.321
11 -1 0 0 1 3.738
12 1 0 0 1 4.540
13 0 -1 -1 0 4.470
14 0 1 -1 0 4.565
15 0 -1 1 0 4.482
16 0 1 1 0 4.082
17 -1 0 -1 0 3.712
18 1 0 -1 0 4.820
9 -1 0 1 0 3.395
20 1 0 1 0 4.612
21 0 -1 0 -1 4.011
22 0 1 0 -1 4.019
23 0 -1 0 1 4.610
24 0 1 0 1 4.560
25 0 0 0 0 5.284
26 0 0 0 0 5.262
27 0 0 0 0 5.270
28 0 0 0 0 5.337
29 0 0 0 0 5.397
表2 响应面实验设计及结果
Table 2 Experiment design and result of RSM
2.1.2 乙醇体积分数对山稔叶总黄酮提取率的影响
由图3可知，当乙醇体积分数为50%时，总黄酮提
取率最大。乙醇体积分数大于50%时，提取率随浓度
的增加而下降。这是由于黄酮类化合物是一大类极
性范围很广的物质[13]，在50%乙醇溶液中，醇溶性和
水溶性的总黄酮都能最大程度的溶出。而当乙醇体
积分数超过50%时，溶剂极性降低，从而减少了大极
性黄酮类化合物的溶出，导致总黄酮的提取率下降。
所以本实验选择乙醇体积分数为50%。
2.1.3 液固比对山稔叶总黄酮提取率的影响 从图4
可知，当液固比在5∶1～20∶1范围内时，黄酮提取率随
液固比的增大而上升，液固比为20 ∶1时，提取率最
高。之后，黄酮提取率变化不大，这可能是由于物料
与溶剂边界层浓度差减小，扩散达到平衡。所以从节
约溶剂的角度考虑，本实验选择液固比为20∶1。
2.1.4 提取时间对山稔叶总黄酮提取率的影响 由
图5可知，随着提取时间的延长，山稔叶总黄酮提取
率不断升高；但当提取时间超过120min后提取率开
始下降。这是因为刚开始时提取时间过短，总黄酮还
未充分溶出；随着提取时间的延长，总黄酮溶出量逐
渐增大，提取率逐渐升高；继续延长提取时间，未溶
出的总黄酮量很少，其他杂质可能增多，导致提取率
下降。故本实验选择提取时间为120min。
2.2 山稔叶总黄酮提取工艺响应面优化分析
2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析 选用中
心复合模型，做四因素三水平共29个实验点（5个中
心点）的响应面分析实验，设计及结果见表2。
经回归拟合后，得到以山稔叶总黄酮提取率（Y）
为响应值的回归方程：Y=5.31+0.54A-0.035B-0.12C+
0.20D+0.038AB+0.027AC-0.030AD-0.12BC-0.015BD+
0.080CD-0.79A2-0.51B2-0.40C2-0.52D2。
用Design Expert 8.0.5b软件对表2中的数据进行
图3 乙醇体积分数对山稔叶总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of
total flavonoids
3.9
3.8
3.7
3.6
3.5
3.4
3.3
20 30 40 50 60 70 80 90
提
取
率
（
%）
乙醇体积分数（%）
图4 液固比对山稔叶总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction efficiency of
total flavonoids
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
0 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 25∶1 30∶1 35∶1
提
取
率
（
%）
液固比（mL/g）
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图7 提取温度和液固比对总黄酮提取率的等高线图和曲面图
Fig.7 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect
of temperature and liquid-solid ratio on extraction efficiency of
total flavonoids
5.5
-1.00
提
取
率
（
%）
C：液固比
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
-0.50
0.50
0.00
1.00
-1.00
-0.50
0.50
0.00
1.00
A：温度
图6 提取温度和乙醇体积分数对总黄酮提取率的曲面图
Fig.6 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect
of temperature and ethanol concentration on extraction efficiency
of total flavonoids
5.5
-1.00
提
取
率
（
%）
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
-0.50
0.50
0.00
1.00
-1.00
-0.50
0.50
0.00
1.00
A：温度B：乙醇体积分数
注：***差异极显著（p<0.001）；**差异高度显著（p<0.01）；*差异显著（p<0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F p>F 显著度
模型 9.95 14 0.71 68.51 <0.0001 ***
A 3.46 1 3.46 333.30 <0.0001 ***
B 0.015 1 0.015 1.44 0.2494
C 0.16 1 0.16 15.46 0.0015 **
D 0.47 1 0.47 44.90 <0.0001 ***
AB 5.700E-003 1 5.700E-003 0.55 0.4708
AC 2.970E-003 1 2.970E-003 0.29 0.6010
AD 3.540E-003 1 3.540E-003 0.34 0.5684
BC 0.061 1 0.061 5.91 0.0291 *
BD 8.410E-004 1 8.410E-004 0.081 0.7800
CD 0.025 1 0.025 2.45 0.1396
A2 4.06 1 4.06 391.02 <0.0001 ***
B2 1.67 1 1.67 161.46 <0.0001 ***
C2 1.04 1 1.04 100.43 <0.0001 ***
D2 1.74 1 1.74 167.88 <0.0001 ***
残差 0.15 14 0.010
失拟项 0.13 10 0.013 4.11 0.0927
绝对误差 0.013 4 3.220E-003
总差离 10.09 28
表3 回归模型参数检验
Table 3 Parameter estimate of regression model
多元回归分析，其方差分析见表3。从表3可以看出，
回归方程失拟检验p＞0.05，差异不显著，说明未知因
素对实验结果干扰很小；回归方程拟合检验p＜0.0001，
差异极显著，说明模型的预测值和实际值非常吻合，
模型成立。同时回归方程相关系数R2=0.9856，说明响
应值的变化有98.56%来源于所选变量，即乙醇体积
分数、液固比、提取时间和提取温度。因此，该回归方
程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关
系，可以用其确定最佳提取工艺条件。此外，各因素
中一次项A、D及二次项A2、B2、C2、D2对黄酮的提取影
响极显著（p＜0.001），C（液固比）对黄酮提取的影响
高度显著（p＜0.01）；交互项BC对黄酮的提取影响显
著（p＜0.05）；而B、AB、AC、AD、BD、CD的影响差异不
显著。
2.2.2 各因子交互作用对总黄酮得率影响的分析
RSM方法的图形是特定的响应面（Y）与对应的因素
A、B、C、D构成的一个三维空间在二维平面上的等高
图，每个响应面对其中两个因素进行分析，另外两个
因素固定在零水平。从中可以直观地反映各因素对
响应值的影响，从实验所得的响应面分析图上可以
找到它们在提取过程中的相互作用。回归优化响应
面图分别见图6~图11。
图6~图11直观地反映了各因素对响应值的影
响，由等高线图可以看出存在极值的条件应该在圆
心处。比较六组图可知：提取温度（A）对桃金娘叶片
总黄酮提取的影响最为显著，表现为曲线较陡；而提
取时间（D）、液固比（C）与乙醇体积分数（B）次之，表
现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应
值变化较小。
226
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图8 提取温度和提取时间对总黄酮提取率的等高线图和曲面图
Fig.8 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect
of temperature and time on extraction efficiency of total flavonoids
5.5
-1.00
提
取
率
（
%）
D：时间
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
-0.50
0.50
0.00
1.00
-1.00
-0.50
0.50
0.00
1.00
A：温度
图9 乙醇体积分数和液固比对总黄酮提取率的等高线图和
曲面图
Fig.9 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect
of ethanol concentration and liquid-solid ratio on
extraction efficiency of total flavonoids
5.4
-1.00
提
取
率
（
%）
C：液固比 -0.50
0.50
0.00
1.00
-1.00
-0.50
0.50
0.00
1.00
B：乙醇体积分数
5.2
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
图10 乙醇体积分数和提取时间对总黄酮提取率的等高线图
和曲面图
Fig.10 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect
of ethanol concentration and time on extraction efficiency of
total flavonoids
5.4
-1.00
提
取
率
（
%）
D：时间 -0.50
0.50
0.00
1.00
-1.00
-0.50
0.50
0.00
1.00
B：乙醇体积分数
5.2
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
图11 液固比和提取时间对总黄酮提取率的等高线图和曲面图
Fig.11 Curved surface plot and contour line for reciprocal effect
of liquid-solid ratio and time on extraction efficiency of
total flavonoids
5.5
-1.00
提
取
率
（
%）
D：时间
-0.50
0.50
0.00
1.00
-1.00
-0.50
0.50
0.00
1.00
C：液固比
5.0
4.5
3.5
4.0
2.2.3 最优提取工艺及验证 通过Design Expert
8.0.5b软件分析得到的山稔叶总黄酮最佳提取工艺为
提取温度73℃、乙醇体积分数50%、液固比19∶1（mL/g）、
提取时间124min，黄酮提取率理论值为5.443%。在此
条件下，重复三次实验，山稔叶黄酮提取率为5.426%。
与理论预测值相比，其相对误差约为0.31%。而且重
复性也很好，说明优化结果可靠。
2.3 山稔叶总黄酮对DPPH自由基清除作用
由图12可以看出山稔叶总黄酮对DPPH自由基
具有明显的清除效果，且在一定范围内呈量效关系。
当样品浓度为18μg/mL，清除率达到最大值73.48%。
经GraphPad Prism V5.01软件计算得到山稔叶总黄酮
对DPPH自由基的IC50（半数抑制浓度）为9.797μg/mL，
而VC为7.886μg/mL，清除效果略优于山稔叶总黄酮。
3 结论
3.1 本文在单因素实验的基础上，利用Design Expert
8.0.5b软件设计响应面实验优化山稔叶总黄酮回流
提取工艺。通过方差分析可知，各因素对山稔叶总黄
酮提取率的影响作用为：提取温度＞提取时间＞液固
比＞乙醇体积分数。山稔叶总黄酮回流提取的最优工
艺条件为：提取温度73℃、乙醇体积分数50%、液固比
19∶1（mL/g）、提取时间124min。在此条件下总黄酮的
提取率（5.426%）与预测值基本相符。
3.2 山稔叶总黄酮具有较强的DPPH自由基清除能力，
在一定浓度范围内呈量效关系，其IC50为9.797μg/mL，
与天然抗氧化剂VC（IC50=7.886μg/mL）相近。本研究
为合理开发利用山稔叶资源提供了理论依据。
参考文献
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图12 山稔叶总黄酮及VC对DPPH自由基清除作用
Fig.12 Scavenging effect of total flavonoids and VC on DPPH
100
80
60
40
20
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32
VC
总黄酮
清
除
率
（
%）
样品浓度（μg/mL）
（下转第233页）
227
工 艺 技 术
2014年第4期
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（上接第227页）
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