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［责任编辑 顾雪竹］
［收稿日期］ 20120509(013)
［基金项目］ 中国博士后科学基金项目(20090461042)
［第一作者］ 张海弢，硕士，Tel:13610730639，E-mail:zht716@ 126. com
［通讯作者］ * 杨世海，博士，教授，博士生导师，E-mail:jlyangs@ 163. com
王不留行毛状根的诱导及培养
张海弢，包京姗，杨世海* ，付娟，马玲
( 吉林农业大学中药材学院，长春 130118)
［摘要］ 目的:利用 4 种发根农杆菌 R15834，R1601，R1000，A4 诱导药用植物王不留行产生毛状根，建立王不留行的毛
状根培养体系。方法:采用共培养法研究不同外植体、菌株、外源激素、侵染时间、预培养时间和共培养时间对王不留行毛状
根诱导率的影响。结果:用王不留行叶片作为外植体，外植体预培养 60 h，共培养 48 h，发根农杆菌 R1601 侵染 10 min，培养基
中添加 0. 1 mg·L －1吲哚丁酸(IBA)转化率最高。结论:王不留行毛状根诱导成功，为其遗传转化提供了依据。
［关键词］ 王不留行;发根农杆菌;毛状根;诱导率
［中图分类号］ R282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)06-0141-04
Induction and Culture of Hairy Roots of Vaccaria segetalis
ZHANG Hai-tao，BAO Jing-shan，YANG Shi-hai* ，FU Juan，MA Ling
(College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)
［Abstract］ Objective:Hairy root of Vaccaria segetalis were induced by the infection of four
Agrobacterium rhizogenes strains R15834，R1601，R1000，A4 and an in vitro culture system of the hairy roots was
established． Method:Hairy roots were induced by co-culture． Effects of explants，A． rhizogenes，exogenous
phytohormones， infecting time，pre-culture time and co-culture time on growth of hairy root were studied．
Result:The highest induction frequency was obtained from blade leafs with 60 h pre-culture and 48 h co-culture
which were induced by R1601 for 10 mins． The transformation frequency could be raised by culture media with 0. 1
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第 19 卷第 6 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
Mar．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.06.010
mg·L －1 indole-3-batytric acid (IBA)． Conclusion:The successful induction of Vaccaria segetalis hairy roots
provided a basis for genetic transformation．
［Key words］ Vaccaria segetalis;Agrobacterium rhizogenes;hairy roots;induction rate
王不留行为石竹科植物麦蓝菜的干燥成熟种
子［1］。种子具有活血通经、下乳消肿、利尿通淋的
功能，用于经闭，痛经，乳汁不下，乳痈肿痛，淋证涩
痛，是临床催乳通经良药，与其他中药配合还可以治
疗急性腰扭伤，关节炎、面部皮肤过敏等［2］。它不
仅是多种妇科中成药的配方原料，而且有抗癌作用;
另外，王不留行有催乳作用，也可成为母畜饲料的添
加剂。综上所述，中药王不留行具有良好的研究开
发利用前景，是一种很有研究价值的药用植物［3］。
王不留行常用种子繁殖，但生长很慢，生物量较小。
发根农杆菌具有诱导植物生根的生物学特性，而且
所产生的毛状根能合成该植物特征的次生代谢物，
因此发根培养技术成为生产次生代谢物的一条可靠
和有效途径［4-5］。
利用发根农杆菌进行次生代谢物质生产，具有
许多适应工业化生产的特点，如无需添加外源生长
素、迅速自主生长、遗传稳定性高、能合成植物特有
的次生代谢物，而且其含量往往比植物自身合成的
含量还高［6］。据不完全统计，已有 31 科 100 余种植
物建立了毛状根培养系统，其中不少是药用植
物［7］。黄芪［8］、曼陀罗［9］、三角叶黄连［10］、人参［11］、
莨菪［12］、长春花［13］、短叶红豆杉［14］等毛状根的小
规模培养已经成功。人参皂苷、黄连素等已通过毛
状根培养法得以工业化生产。目前，国内外学者对
王不留行的研究主要集中于化学成分及药理活性的
研究，而对王不留行毛状根的研究尚未见报道。本
实验利用发根农杆菌侵染王不留行诱导得到毛状
根，并考察不同因子对王不留行毛状根的诱导和生
长的影响，为进一步筛选适宜的王不留行毛状根培
养系统并调控次生代谢产物的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 王不留行无菌苗的培养 供试王不留行
Vaccaria segetalis(Neck．)Garcke 种子采自吉林农业
大学药植园，经吉林农业大学中药材学院杨世海教
授鉴定。发根农杆菌菌株 Agrobacterium rhizogenes
R1601，R15834，R1000，A4，由中国农业微生物研究
所菌种保藏中心提供。挑选当年成熟干燥的王不留
行种子，温水浸泡 40 min 后，在生物洁净工作台内
用无菌水清洗 3 次;75%乙醇浸泡 30 s，无菌水清洗
3 遍，每次清洗 30 s;然后再用 0. 1% HgCl2 浸泡 8
min，无菌水再次清洗 5 ～ 6 次，每次清洗 2 ～ 3 min。
最后用灭菌滤纸将种子表面的水分吸干，用镊子轻
轻放置在装有 MS 固体培养基(不添加任何激素)
中，置于温度为 24 ～ 25 ℃、光强 2 000 lx、光照 12 h·
d －1黑暗 12 h·d －1的条件下交替培养，等待萌发无菌
王不留行幼苗，作为遗传转化用的外植体。
1. 2 发根农杆菌的活化 在无菌条件下，将保存在
－ 78 ℃下的菌种用接菌针挑出，在已灭菌的发根农
杆菌培养基(YEB)固体平皿上划线培养，封口膜封
口置于 28 ～ 30 ℃的恒温培养箱暗培养，1 ～ 2 d即可
长出单菌落。无菌条件下，用接菌针挑取一个单克
隆菌落接种于装有加有 Kan 的 20 mL YEB 液体培
养基中，28 ℃恒温摇床，180 r·min －1条件下培养 24
h后，透明的红棕色 YEB 液体培养基颜色变淡，呈
现云雾状浑浊，此时证明农杆菌已复苏。菌液还要
进行再次活化，将已复苏的菌液取出 1 mL加入装有
50 mL YEB 液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床 28
℃，180 r·min －1再次培养 12 h，此时活化的菌液达
到了对数生长期，可以对外植体进行侵染。
1. 3 王不留行毛状根的诱导 在无菌条件下将王
不留行无菌苗的幼嫩叶片剪成 0. 5 cm2 大小的片
段，茎段剪成长约 0. 5 cm 的小段。每个样品在 MS
(不添加任何激素)固体平板培养基上接种 10 片
(段) ，并且每个样品均做 5 次平行，黑暗中 24 ℃下
预培养 60 h。在超净工作台上将预培养后的外植体
(叶片、茎段)转移至已灭菌的锥形瓶中，再将活化
好的发根农杆菌菌液倒入其中，侵染 10 min。在侵
染过程中，轻轻地摇晃锥形瓶，后用无菌滤纸吸干表
面菌液，接种到原固体平板培养基上，在 24 ℃黑暗
条件下共培养 48 h，再转接到含有 500 mg·L －1 Cef
的 MS(不添加任何激素)固体平板培养基上于24 ℃
黑暗条件下培养，同时以未被菌液感染的外植体作
为对照。每周转接 1 次，待开始发根后，逐步降低抗
生素浓度，及时转移和扩增在无激素 MS 培养基上，
多次继代直至达到完全除菌后再去掉抗生素继续培
养。21 d后统计诱导出的毛状根数，并且计算平均
诱导率。王不留行毛状根诱导率按以下公式计算。
毛状根诱导率 =长出毛状根的外植体数 /接种外植体的
总块数 × 100%
取完全除菌后的毛状根转移到 MS(不添加任
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
Mar．，2013
何激素)液体培养基中，建立毛状根离体培养体系。
2 结果与分析
2. 1 种子灭菌方法 用 10%双氧水和 0. 1%升汞
灭菌，将种子接种到 MS 基本培养基，10 d 后，实验
结果见表 1。表 1，图 1A 显示种子消毒时使用
0. 1%升汞消毒效果好于 10%双氧水，为了避免升
汞对种子的毒害，8 min最为合适。
表 1 不同处理方法对种子污染率的影响 %
消毒剂
消毒时间 /min
2 4 6 8 10
10%双氧水 100 100 82 80 73
0. 1%升汞 85 70 25 0 0
A. 无菌苗;B. 毛状根大量增殖;C. R1601 侵染;
D. A4 侵染;E. R1000 侵染;F. R15834 侵染;
G. 添加 IBA;H. 添加 NAA;I. 添加 2，4-D
图 1 毛状根的诱导和培养
2. 2 发根农杆菌菌株和外植体对王不留行毛状根
诱导率的影响 利用 R15834，R1601，R1000，A4 4
种发根农杆菌采用共培养法对王不留行的不同外植
体(叶片、茎段)进行诱导，以未被任何菌株感染的
外植体空白对照组。从图 1 中不同菌种的诱导率情
况可以看出，这 4 种菌株对王不留行的茎段诱导率
都为 0，可能是这 4 种菌株对其茎段没有诱导能力。
R15834 对叶片和茎段的诱导率都为 0，可能是该菌
种对王不留行叶片和茎段没有诱导能力。R1601 对
叶片的诱导率最高，达到 82%，而菌株 A4(54%) ，
R1000(12%) ，R15834(0%)。因此，R1601 是诱导
王不留行的最佳菌种，最佳外植体是叶片(因此后
续试验均采用 R1601 菌种侵染叶片)。
2. 3 不同侵染时间对王不留行毛状根诱导率的影
响 适宜的侵染时间有助于发根农杆菌对植物细胞
的附着和转化。侵染时间的长短与诱导率的高低有
着直接联系。如果侵染时间过短，发根农杆菌无法
及时侵染植物细胞;侵染时间过长则菌株对植物细
胞造成无法恢复的损害，致使外植体无法存活。采
用共培养方法，用发根农杆菌 R1601 分别侵染王不
留行一定量的叶片 0，4，6，8，10，12 min，30 d后计算
诱导率。由图 2 可知，不同侵染时间对发根诱导率
的影响特别明显。随着侵染时间的增加，诱导率也
随之升高，侵染 10 min 后诱导率开始急剧下，并且
杂菌大量生长，外植体软腐，部分死亡。因此，侵染
时间 10 min为宜。
图 2 不同侵染时间对王不留行毛状根诱导率的影响
2. 4 外源激素对王不留行毛状根诱导率的影响
在发状根的诱导过程中，添加适当浓度的外源激素
对于提高发状根的诱导频率有明显的促进作用。把
感染后的外植体分别共培养在 MS，MS + IBA 0. 1
mg·L －1，MS + 2，4-D 0. 1 mg·L －1，MS + NAA 0. 1
mg·L －1的培养基上。其结果见表 2，图 1，在 MS +
IBA0. 1 mg·L －1的培养基上，毛状根的诱导率达到
74%，效果很明显。而 2，4-D和 NAA两种激素的添
加对毛状根的诱导没有促进作用，反而使外植体愈
伤化比较严重。这说明在适当的植物激素作用下，
王不留行组织块可以启动细胞分裂，而处于 DNA合
成和细胞分裂高峰期的外植体较易进行外源 DNA
的导入与整合，从而促进根的诱导。
表 2 不同外源激素对王不留行毛状根诱导率的影响
培养基 感染外植体数 /个 生根外植体数 /个 诱导率 /%
MS 50 23 46
MS + IBA 50 37 74
MS + NAA 50 0 0
MS + 2，4-D 50 0 0
2. 5 外植体预培养和共培养时间对王不留行毛状
根诱导率的影响
2. 5. 1 预培养时间 外植体产生伤口后，在愈合过
程中会形成并释放出乙酰丁香酮等酚类物质，以此
作为诱导发根农杆菌识别的信号分子。发根农杆菌
侵染前需经过一定时间预培养，使受体能形成并释
放这种信号分子，从而提高转化率。另外，经农杆菌
感染的外植体伤口处细胞可能因为过敏反应而褐
化，甚至死亡，会严重影响转化效率及毛状根的形
·341·
张海弢，等:王不留行毛状根的诱导及培养
成，预培养也能较好地解决褐化问题。本实验对王
不留行叶片分别进行 0，24，48，72，96 h 的预培养，
然后分别用发根农杆菌 R1601 进行侵染 20 d 后观
察其转化结果。
由图 3 数据可以看出，王不留行叶片经过不同
的预培养时间培养后，转化率有所不同。60 h 前，
诱导率随着预培养时间的增加而增加，但 60 h 后，
诱导率随预陪养时间的增加而减小。由此可以得
出，60 h是王不留行叶片的最佳预培养时间。
图 3 预培养和共培养时间对王不留行毛状根诱导率的影响
2. 5. 2 共培养时间 共培养是农杆菌将其携带的
外源基因向外植体转化的过程，适当的共培养时间
是农杆菌能否将外源基因成功转化的关键。共培养
时间的长短与转化效率密切相关，时间太短，农杆菌
来不及把基因片段整合到植物 DNA 上。但共培养
时间过长，可使发根农杆菌过度生长，而严重毒害外
植体使转化难以实现。本实验对王不留行叶片分别
进行 0，24，48，72，96 h 共培养的观察，从图 3 可以
看出，共培养 48 h诱导率最高，而 55 h 后随共培养
时间的增加而减少。
3 讨论
关于王不留行的遗传转化目前还没有报道。本
研究利用发根农杆菌 R1601 转化王不留行叶片，获
得了激素自主、快速生长、多分支、多根毛的毛状根
株系，且在 MS液体培养基中都能很好的生长，为今
后进行王不留行有效成分研究和规模化生产提供了
方法。预培养能够较好地解决外植体伤口处的细胞
因为过敏反应而导致的褐化问题，而且利用含一定
植物激素的培养基，会使植物细胞对农杆菌的感染
更加敏感;被菌液感染的外植体需放在无抗菌素的
培养基上共培养后，再进行除菌，才能保证发根农杆
菌 T-DNA的充分转化与整合。
综合上述各因素的影响，得出了诱导王不留行
毛状根的最佳条件:用王不留行叶片作为外植体，外
植体预培养 60 h，共培养 48 h，发根农杆菌 R1601
侵染 10 min，培养基中添加 0. 1 mg·L －1 IBA。该试
验为以后进行王不留行次生代谢产物的规模化生产
提供了依据。
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［责任编辑 邹晓翠］
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