全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 1期，第 179-184页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.1, 179-184
技术改进
Upgraded Technology
滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定
步怀宇﹡ 岑举人 王英娟 赵宇玮 李娜 毕彦博
西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,陕西省生物技术重点实验室,西安, 710069
*通讯作者, buhy@nwu.edu.cn
摘 要 本文利用发根农杆菌 Agrobacterizum rhizogenes 1.2556感染滇黄芩再生苗的茎段和叶片，建立了毛
状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的茎、叶外植体表面产生,在无外源激素的MS固体和液
体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根茎段的诱导率较叶片高，最高可达到 14.44%；经 rol B
基因 PCR分析和甘露碱纸电泳检测，证明 Ri质粒 T-DNA已整合到滇黄芩基因组中并表达；毛状根在附加
6-BA 2 mg/L和 NAA 0.2 mg/L的 MS固体培养基上直接诱导不定芽，并在 MS培养基上生根，形成再生植
株。获得的毛状根系经MS液体培养基培养 30 d后通过 HPLC都能检测到黄芩苷，其中 1个转化系黄芩苷
含量为 2.59%，是药材黄芩的 0.20倍，而从 3年单位时间黄芩苷生成量计算，毛状根是药材黄芩的 7.18倍。
本研究建立的毛状根培养体系，将对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状根生产黄芩苷的生物转化提供了
实验基础。
关键词 滇黄芩,毛状根,黄芩苷,发根农杆菌
Agrobacterium rhizogenes Mediated Transformation of Scutellaria amoena
and Production of Baicalin in Hairy Roots
Bu Huaiyu * Cen Juren Wang Yingjuan Zhao Yuwei Li Na Bi Yanbo
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Northwest University, Ministry of Education, Shaanxi Provincial Key Labo-
ratory of Biotechnology, Xian, 710069
* Corresponding author, buhy@nwu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.029.000179
Abstract The objective of this research was to establish an efficient system of genetic transformation and plant
regeneration from hairy roots by infecting the leaf sections and stem segments of in vitro Scutellaria amoena C.
H.Wright plantlets. Hairy roots were induced from the wounded surface of the explants on hormone free MS
medium after infection by Agrobacterium rhizogenes strain 1.2556 and which showed the representative charac-
teristic of hairy root. The frequency of stem segments was higher than that of leaf sections, the highest of which
can reach 14.44%. PCR analysis and opine paper electrophoresis confirmed that the T-DNA fragment of Ri plas-
mid from A. rhizogenes strain had been inserted into the genome of Scutellaria amoena and expressed. The hairy
roots could be directly induced into adventitious buds on the MS solid medium supplemented with 6-BA 2 mg/L
and NAA 0.2 mg/L and then took roots on MS solid medium. Finally, formed regeneration plantlets. The con-
tents of baicalin in different hairy root clones were determined by HPLC after cultured in liquid MS medium for
30 days. The contents of baicalin in one of transformations was 2.59%, which was 0.20 times of medicine Baikal
skullcap root, but if we calculated the contents of baicalin from the unit time of 3 years, the baicalin of hairy root
was 7.18 times than that of medicine Baikal skullcap root. The culture system of hairy roots was established in
this research would provide a experiment foundation for perfecting the technique of Scutellaria amoena transgenic
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.029.000179
基金项目：本研究由陕西省教育厅基金(09JS080; 09JK775)和西北大学研究生创新基金(09YSY36)共同资助
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
and using biotransformation of hairy roots yield to baicalin.
Keywords Scutellaria amoena C. H.Wright, Hairy roots, Baicalin, Agrobacterium rhizogenes
滇黄芩 (Scutellaria amoena C. H.Wright)为唇形
科黄芩属多年生草本植物，是西南地区药用黄芩的
主流品种，现收载于《云南省药品标准》(李娅琼等,
2005)。滇黄芩的黄芩苷及黄芩素含量均高于黄芩，
是正品黄芩的高质量替代品，具有较大的开发潜力
(符洪等, 2003)。
毛状根是发根农杆菌( Agrobacterizum rhizogenes)
Ri质粒诱发的结果，为单细胞起源，具有生长迅速，
在无激素培养基上能够自主、持续生长，次生代谢产
物含量高且遗传稳定的特性，在植物基因工程育种
和生产实践中具有重要价值(王关林和方宏筠, 1998,
科学出版社, pp.552-556)。利用发根农杆菌进行毛状
根诱导，在黄芩(Nishikawa et al., 1999;齐香君等, 2006;
Tiwari et al., 2008)和粘毛黄芩(王淑芳等, 2008)上已
有报道，但对质量好、药用价值高的地方中药材品
种——滇黄芩的遗传转化未见报道。本实验室已通
过器官发生途径获得滇黄芩的组织培养再生植株，
并分析其遗传稳定性(岑举人等, 2009)。在此基础上，
本实验利用发根农杆菌 1.2556感染前期获得的滇黄
芩再生苗的茎和叶，诱导毛状根的产生，建立了滇黄
芩毛状根的离体培养体系并测定了毛状根中黄芩苷
含量，为滇黄芩毛状根大规模培养和黄芩苷次生代
谢产物的开发利用奠定基础。
1结果与分析
1.1毛状根的诱导
发根农杆菌感染后的叶片和茎段外植体接种于
含有 300 mg/L头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium, Cef)
的MS培养基上培养 10~15 d后，有的外植体开始膨
大，在伤口处陆续长出白色的毛状根，茎段和叶片都
有毛状根的产生(图 1A;图 1B)，出根部位多在外植
体的形态学下端。未转化外植体在 MS培养基上培
养一段时间后，也可能萌发出极细小的根，但在继代
培养过程中因不能自主生长而褐化致死。
毛状根在含头孢霉素的固体培养基上除菌完
全后，移到液体 MS培养基中培养。毛状根生长速
度明显快于固体培养，细嫩的次级毛状根不断生成
(图 1C)；30 d长成大量形态粗壮，无侧毛的次级毛状
根(图 1D)。这些根在不添加激素的 MS培养基中自
主生长,表现出典型的发根特征。
图 1滇黄芩毛状根的诱导和培养
注: A:茎段诱导的毛状根; B:叶片诱导的毛状根; C :液体悬
浮培养 8 d的毛状根; D:液体悬浮培养 30 d的毛状根
Figure 1 Induction and culture of hairy roots of Scutellaria amoe－
na C. H.Wright
Note: A: Hairy roots induced from stem segments; B: Hairy roots
induced from leaf; C: Hairy roots cultured for 8 d in liquid MS
medium; D: Hairy roots cultured for 30 d in liquid MS medium
侵染 3周后统计茎段和叶片外植体转化率(图 2)。
不添加乙酰丁香酮(Acetosyringone, As)时，茎段的毛
状根转化率是 11.11%，明显高于叶片 3.33%的转化
率，为其 3.34倍。而添加不同浓度的 As时，结果发
现，20 μmol/L As处理能明显提高叶片和茎段两种
外植体的转化率，其中叶片转化率是 9.63%，达到未
经 As处理的叶片转化率的 2.67倍。进一步提高 As
浓度，无论茎、叶转化率都逐步降低。
1.2毛状根 rolB基因的 PCR检测
rolB 基因是发根农杆菌 Ri 质粒上与毛状根形
图 2乙酰丁香酮(As)浓度对转化频率的影响
Figure 2 Effect of acetosyringone concentration on transforma-
tion frequency
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000179180
成密切相关的基因(Di et al., 1996)。以 rolB基因的扩
增引物分别对滇黄芩对照根、获得的假定转基因毛
状根基因组 DNA 及发根农杆菌质粒 DNA 进行
PCR扩增(图 3)，从农杆菌菌株、转化毛状根基因组
DNA中扩增出预期大小约为 700 bp目的片段。而阴
性对照未转化植物根 DNA未扩增出此条带。这表明
T-DNA上的 rolB 基因已整合入滇黄芩基因组 DNA
中，被检测的单克隆是真正的毛状根。
1.3毛状根冠瘿碱检测
发根农杆菌 Ri质粒 TR-DNA中含有冠瘿碱合
成酶基因，该基因只在真核生物中表达，因此冠瘿碱
的存在常被作为检测农杆菌质粒转化表达与否的分
子标记(Stanton, 2003)。利用高压纸电泳技术检测毛
状根冠瘿碱，结果表明，所有毛状根均出现了甘露碱
的显样点，而阴性对照未转化植株的根未出现此显
样点(图 4)。由此证明发根农杆菌的冠瘿碱合成酶基
图 4滇黄芩毛状根甘露碱分析
注: 1:甘露碱标品; 2:未转化植株根阴性对照; 3~8:为不同毛
状根的单克隆
Figure 4 Opine analysis of hairy root of Scutellaria amoena by
high voltage paper electrophoresis
Note: 1: Mannopine marker; 2: Non-transformed plantlet root;
3~8: Different hairy root clones
因已整合入滇黄芩转化组织基因组 DNA中，并在转
化细胞中特异的合成冠瘿碱表达产物。
1.4毛状根黄芩苷的含量测定
对不同毛状根系提取物进行色谱分析发现，所
有的毛状根样品均含有黄芩苷，保留时间为 25.7 min
与所购对照品相符(图 5)。
含量分析中，标准品黄芩苷计算的回归方程和
相关系数分别为 Y=60 355X-12 822，r=0.999 2。选取
图 5黄芩苷对照品(A)、毛状根样品(B) HPLC色谱图
注: 1:黄芩苷
Figure 5 HPLC chromatograms of reference standards (A) and
hairy root sample (B)
Note: 1: Baicalin
的 6个转化毛状根系克隆经液体培养 30 d后，测定
的黄芩苷含量不同，分别为 2.09%，0.98%，0.87%，
1.68%，2.59%和 2.36%。其中毛状根中黄芩苷含量最
高为 2.59%，与野生药材黄芩中 13.16% (刘美兰等,
2002)的黄芩苷含量相比，仅为药材黄芩的 0.20倍。
但从 3年单位时间黄芩苷生成量计算，毛状根系是
药材黄芩的 7.18倍，可见毛状根培养技术是获得黄
芩苷的高效策略。
1.5毛状根再生苗的获得
切取毛状根系 2~3 cm长的根尖置于添加 6-BA
2 mg/L和 NAA 0.2 mg/L的 MS固体培养基上诱导
图 3 滇黄芩毛状根 rolB基因 PCR扩增分析
注: M:分子量标记; 1:含扩增片段的质粒 DNA阳性对照; 2:
未转化植株的阴性对照; 3~8:不同毛状根的单克隆
Figure 3 PCR analysis of rolB gene fragment in transformed hairy
roots of Scutellaria amoena
Note: M: Molecular weight marker; 1: Fragment from Ri plas-
mid; 2: Non-transformed plantlet root; 3~8: Fragment from dif-
ferent hairy root clones
滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定
Agrobacterium rhizogenesMediatedTransformationofScutellaria amoena andProductionofBaicalin in HairyRoots 181
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 6滇黄芩毛状根的植株再生
注: 1:毛状根在固体培养基分化出不定芽; 2:毛状根在液体培
养基分化出不定芽; 3:毛状根在 MS液体培养基中分化出大
量不定芽; 4:再生转化植株
Figure 6 Plant regeneration from hairy roots of Scutellaria amoena
Note: 1: A plantlet differentiated from hairy root on solid medi-
um; 2: Buds differentiated from hairy root in liquid medium; 3:
Shoots differentiated from hairy root in liquid MS medium; 4:
Regenerated plantlets with abundant roots
不定芽，10 d后部分毛状根明显变粗，开始膨大、转
绿，25 d左右形成芽点，继而长成不定芽(图 6A)。而
根尖培养于附加相同激素的MS液体培养基中，16 d
左右开始形成芽点，长出小不定芽(图 6B)，继续培养
10 d，不定芽伸长，且毛状根快速生长并分枝，不断有
新不定芽产生(图 6C)。生长状态良好的毛状根再生
不定芽可以在不附加任何激素的 MS培养基上诱导
生根(图 6D)。转化再生苗在形态上与未经感染的再
生苗无明显区别。同时，获得的毛状根根系中,有些在
无激素培养基上也会有绿色芽点出现，光照下培养，
能自主分化出芽，但分化率低。
等, 2000)，同属黄芩的发根诱导过程中同样表现出茎
段的转化效率高的特点(齐香君等, 2006)。乙酰丁香酮
在多种双子叶植物中促进 T-DNA转移 (Katia et al.,
1993)，实验表明 20 μmol/L As能够促进发根农杆菌
对滇黄芩外植体的转化，但过量的 As对外植体造成
毒害作用，降低了转化率，因此 As对滇黄芩的转化
有其适宜的浓度范围。
滇黄芩毛状根经 HPLC 检测黄芩苷的结果可
知，毛状根和原植物一样能产生次生代谢产物黄芩
苷。由于 T-DNA插入植物基因组的位置、长度和拷
贝数千差万别，会导致不同的毛状根系合成次生代
谢产物能力不同(Lee et al., 2004)，检测的 6 个毛根
克隆中黄芩苷含量最高 2.59%，是最低含量 0.87%
的 2.98倍，差别明显。毛状根中黄芩苷最高含量也仅
为药材黄芩的 0.20倍，产生的次生代谢产物量低于
原植物的含量，这一结果与同属黄芩毛状根(齐香君
等, 2008)和粘毛黄芩毛状根中(王淑芳等, 2008)黄芩
苷含量低于野生黄芩一致，也与其他种属植物遗传
转化，如怀地黄毛状根中梓醇的含量低于鲜地黄和
生地黄中梓醇含量的报道相符(Zhou et al., 2009)。同
时，我们注意到滇黄芩毛状根中黄芩苷含量比黄芩毛
状根(40 d)中 8.16%的含量和粘毛黄芩毛状根(32 d)
3.58%的含量低，而文献报道滇黄芩中黄芩苷含量最
高(符洪等, 2003)，分析认为可能 T-DNA插入位置不
理想，未能获得高表达量的毛状根系，也可能次生代
谢物质在植物中是一个积累的过程，不同时间、培养
条件取材导致了测定含量不同。
滇黄芩药用部位为根茎，本研究建立的毛状根
培养体系，对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状
根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。改变一
些外在的条件可以使预期的化合物产量提高(田恬
等, 2009)，这些技术将对提高滇黄芩毛状根中黄芩苷
的含量提供有益的借鉴。
3材料与方法
3.1供试材料
滇黄芩 (Scutellaria amoena C.H. Wright)的组织
培养无菌苗由本实验室培养获得。发根农杆菌 A－
grobacterizum rhizogenes 1.2556本实验室保存。
3.2发根农杆菌的活化
挑取发根农杆菌 1.2556单菌落于 YEB培养基
中，28℃下 180 r/min振荡培养过夜。转接到新鲜培
养基培养至 OD值为 0.5时，分别加入终浓度为 0、
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000179
2讨论
药用植物毛状根培养已在 160多种植物获得成
功(杜雯等, 2005)。本文利用野生型发根农杆菌感染
滇黄芩再生植株叶片和茎段,诱导产生了毛状根。滇
黄芩毛状根在无激素液体培养基中呈现出正常离体
器官的生长模式，具有快速生长特性，表现出典型的
毛状根特征。
实验中外植体类型和菌液处理都影响着转化效
率。滇黄芩茎和叶作为外植体都可以诱导产生毛状
根，但茎的转化率比叶的转化率高，这可能与滇黄芩
茎的分裂能力比叶片的分裂能力强，而生长旺盛的
组织对农杆菌更敏感有关(岑举人等, 2009; 许铁峰
182
20 μmol/L、50 μmol/L和 100 μmol/L的乙酰丁香酮
(As)，继续振荡培养 2 h后用于感染滇黄芩外植体。
3.3发根农杆菌转化
滇黄芩再生苗茎段和叶片切成小块，投入发根
农杆菌 1.2556菌液，侵染 10 min，MS培养基上暗处
共培养 2 d，而后转入含有 300 mg/L Cef的 MS培养
基除菌生长。3周后观察生根情况并统计转化率。转
化率(%) =生根外植体的总数 / 接种的外植体总数。
上述各试验每处理接种 6瓶，每瓶接 15块外植体。
3.4滇黄芩毛状根的培养
切下侵染部位长出的毛状根，单条毛状根分别
接种于含有 300 mg/L Cef的MS培养基上，每 7~10 d
转接 1次，逐步降低抗生素浓度，经 3~5次继代培养
后获得除菌的毛根系。切取除菌完全、生长快速的,毛
根系接种在不含激素的 MS固体或液体培养基中培
养和增殖。
3.5毛状根的 PCR检测
用 CTAB法提取毛状根的总 DNA，以非转化植
株毛状根总 DNA作为对照(顾红雅和瞿礼嘉, 1998)。
由大连 TaKaRa公司合成 rolB基因的 PCR引物，上
游引物：5-CGCAAGCTACAACATCATAG-3，下游
引物：5-CAGTAGATCTCACTCCAGCA-3。PCR反
应体系 20 μL，其中 DNA模板 1 μg，上下游引物各
1 μL (终浓度 20 pmol/L)。PCR反应程序为：94℃预
变性 4 min；94℃变性 50 s；52℃退火 50 s；72℃，延
伸 1 min；循环 5次；94℃变性 50 s；50℃退火 50 s；
72℃延伸 1 min；30次循环；72℃，延伸 10 min。预期
产物大小为 700 bp。
3.6甘露碱检测
冠瘿碱检测参考王关林和方宏筠的方法(王关林
和方宏筠, 1998,科学出版社, pp.552-556)。不同转化
毛状根克隆各称取 0.5 g提取冠瘿碱，点样于层析滤
纸上。以非转化植株根为阴性对照，甘露碱标准品
(1.00 mg/L)为阳性对照，450 V进行纸电泳。扫描并
记录电泳结果。
3.7测定毛状根黄芩苷含量的条件及方法
采用Waters2695-2996型高效液相色谱仪(美国
Waters公司) 测定不同转化毛状根克隆黄芩苷含量；
高效液相色谱柱UltimateXB-C18 (4.6×250mm, 5μm)；
流动相 100 mmol/L 甲醇：0.2%磷酸水(40:60)，流速
1.0 mL/min，柱温：常温；检测波长 280 nm，灵敏度
2.00 AUFS，进样量 20 μL；黄芩苷对照品购自中国药
品生物制品检定所(批号 110715-200815)。
黄芩苷样品溶液的制备以及标准曲线的绘制来
确定毛状根黄芩苷的含量，具体方法蛀牙参照孔
祥鹤(2009)进行。
3.8毛状根再生苗的获得
毛状根系切成 2~3 cm长，置于 6-BA 2 mg/L和
NAA 0.2 mg/L的 MS固体培养基上诱导不定芽，待
不定芽长至 3~5 cm时，切下移至 MS培养基上诱导
生根。培养条件为(25±1)℃，光照 16 h /d，光照强度
30~40 mol·m-2·s-1。
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