全 文 ：! 基金项目!农业部“#$”项目（%&&’）。
陈定虎：男，%() 年生，博士研究生。
**通讯作者。+,-./012/013/00456/78473491:;<=>?!@A./,B.C6,D?>39D-=974-937E9
11111收稿日期：F&&F;&);%)1111接受日期!F&&F;&;’&
农业生物技术学报 G/,07=?1/21+B0>3,?-,0=?1H>/-43.7/?/BI1111F&&’J%%11（F）： %K’L%K(
·研究论文·
美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 *
陈定虎 王锡锋 李 莉 周广和**
M中国农业科学院植物保护研究所J植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 %&&&NO
摘要：从美洲商陆（P.I-/?=33= =<40>3=7=）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总 RS+J经 RT;PUR 扩增出缺失突变型抗病
毒蛋白 P+P 基因，将该基因克隆于分泌型真核表达载体 6PVUW，然后导入毕赤酵母XP=3.>= 6=5-/0>51O菌株 YZ%%) 细胞。在甲醇
的诱导下，经过酵母高密度发酵进行 P+P 的表达，经 Z[Z;P+Y: 分析。结果表明，在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白
条带，大小为 ’N1\[，经 ]45-407;D?/-->7B 分析，该蛋白与法国 P+P 抗血清有特异性反应，体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵
染性具有高度的抑制性，表明该基因在毕赤酵母 YZ%%) 中得到了表达。
关键词：美州商陆抗病毒蛋白；毕赤酵母；发酵；表达；活性测定
+1Z4304-481:^60455>/7Q_43-/0QU/75-0,3->/7Q/2QP/\4‘448Q+7->a>0=?QP0/-4>7QY474Q=78Q
V-5Q:^60455>/7Q>7QP=3.>= 6=5-/0>5
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T.4Q -/-=?Q RS+Q ‘=5Q >5/?=-48Q 20/3=7=Q OQ ?4=a45Q ,5>7BQ -.4Q <4-./8Q /2Q B,=7>8>74Q
>5/-.>/3I=7-4Q=78Q,548Q=5Q-4<6?=-4Q2/0Q=<6?>2>3=->/7Q/2Q-.4Q84?4-48Q<,-=7-Q6/\4‘448Q=7->a>0=?Q60/-4>7Q XP+PQOQ B474QDIQRT;PURQ=78Q
-.47Q-.4Q=<6?>2>48Q20=B<47-Q‘=5Q3?/748Q>7-/Q54304-48Q4^60455>/7Q6PVUWQa43-/0Q-/Q2/0>7-/QP=3.>= 6=5-/0>5QYZ%%)Q5-0=>79Q T.4Q5643>2>3Q4^60455>/7Q60/-4>7Q‘=5Q54304-48Q>7-/Q-.4Q<48>,78,3>7BQ‘>-.Q<4-.=7/?Q=78Q-.4Q
60/-4>7Q=7Q-.4Q5,6407=-=7-Q/2Q-.4Q<48>,=Q.>B.Q8475>-IQ
240<47-=->/79QZ[Z;P+Y:Q045,?-5Q5./‘48Q-.=-Q-.404Q‘=5Q/74Q<=>7Q60/-4>7QD=78Q‘>-.QB.-Q=D/,-Q’NQ\[Q>7Q-.4Q240<47-=->/7Q
5,6407=-=7-Q=78Q >-Q3/,?8Q5643>2>3=??IQ 04=3-Q‘>-.Qh0=734QP+PQ=7->540,7Q]45-407QD?/-->7B9Q +3->a>-IQ -45-5Q 04a4=?48Q -.=-Q -.>5Q60/-4>7Q
3/,?8Q>7.>D>-Q6?=7-Qa>0,5Q>7243->/7Q‘>-.Q.>B.Q422>3>473I9QQQQQ
6/\4‘448Q=7->a>0=?Q60/-4>7i P=3.>= 6=5-/0>5QiQ240<47-=->/7iQ4^60455>/7iQ=3->a>-IQ84-43->/7
美洲商陆抗病毒蛋白 （6/\4‘448Q =7->a>0=?Q
60/-4>7QJP+P）具有抑制多种病毒侵染的能力，它是
从美洲商陆叶片中分离出来的一种单链碱性蛋白，
分子量为 FQ\[j%JFk。该蛋白属于 V型核糖体灭活蛋白
（0>D/5/<4;>7=3->a4Q60/-4>7JRVP）， 具有 RS+QS; 糖
苷酶的活性，能专一地从真核生物核糖体 l&Z 大亚
基的 FKZQ0RS+ 特殊位点上切下一腺嘌呤，使其难
与蛋白质合成的延伸因子 :h;F 结合，从而阻碍了蛋
白质的合成 j’J#k。最新研究表明，P+P 不但能够对 m
个植物病毒属的成员具有抑制作用jnJlk，而且对真菌、
细菌及人类免疫缺陷型病毒（oV_）等都具有一定
的抑制效果 jmLk，因此 P+P 是一种广谱性抗病毒蛋
白，具有广阔的实用价值。另外，P+P 在体外稳定性
高，利于体外操作。由于 P+P 在植物中含量有限且
提取困难JQ因此，采用基因工程的方法，构建 P+P 表
达载体，再通过微生物发酵来大量生产 P+P，不失
为一种可行的方法。
巴斯德毕赤酵母菌是一种土壤微生物，作为外源
基因真核表达系统，毕赤酵母具有高的表达量（发酵
液高达 %&QBfc以上）。国外已有多种蛋白酶及抗体等
基因得到了高效表达，一些已经商品化生产，国内也
有外源基因表达的报道，如恶性虐裂殖子表面蛋白 %
农 业 生 物 技 术 学 报 !# 年
（$%&’）()*及人血清白蛋白（+,%）均在毕赤酵母中
得到了成功表达 ())*。本研究对 &,&基因进行适当改
造，去除了 -端信号肽编码序列及对植物细胞生长有
害的部分基因，然后克隆到真核表达载体上，再转化
毕赤酵母细胞，通过酵母高效发酵来研究 &,&基因
表达，为商品化生产 &,&奠定基础。
!....材料和方法
!!####酵母菌株
毕赤酵母菌/&01203 435678059:菌株 ;%))< 及表达
载体 4&=>?@、4;A$BC载体均购自 =DE0687FGD公司。
!$####%&% ’(&
由本实验室从美洲商陆/42H67I3113 3JG8013D3 :
叶片中提取，!KL9!保存M9&,&9兔抗血清由法国 NOP.
分子生物学实验室 &20I044G.QRI0GR.惠赠。
!)####酶试剂及其它材料
各种限制性内切酶、CSQ-, 连接酶!C3T.Q-,
聚合酶、PCB&>P实验用酶等均购自 &87JGF3公司，甲
醇!山梨醇!酵母氮碱等皆采购于北京各试剂公司。
!*###% & % 基因的 %+’ 扩增及与载体 ,%-+./ 的
克隆
为了便于 &,& 基因的表达，根据 4&=>?@ 多克
隆位点，在设计的引物两端即 %D3.V!及 -76!酶切位点；扩出的 &,& 基因为 -
端除去了信号肽，>端缺失 !<个毒性区氨基酸的缺
失型 &,& 基因，其 &,& 结构示意如图 ) 所示，这样
表达的 &,& 对植物病毒侵染有抑制作用而对植物
细胞无伤害作用()!*。
<引物 &&)W,,.C,>.;C,.;C;.,,C.,>,.,C>.,C>.C,>.,,C
............... %D3.V!
#引物 &&!W,,.;>;;>>;>.>C,.>>,.>CC.;;>.,>>.,>C.;;>
............... -76!
先提取美洲商陆叶片的总 P-,，然后将其反转
录成 1Q-,第一链M.再用特异性引物扩增出 &,& 基
因，将该基因片段克隆于 4;A$BC 载体的多克隆位
点上，构成重组载体，然后分别从重组载体的 %&X
和 CK 启动子对回收片段进行序列测定，序列确证
无误后，再用 %D3.V!和 -76!双酶切该重组载体，
回收酶切下的 &,& 基因片段，与用同样双酶切的表
达 载 体 4&=>?@ 相 连 接 ， 构 建 成 表 达 载 体
4&=>?@B&，其策略如图 !。将 4&=>?@B& 转化大肠杆
菌YAZ 17I0.:[$’L? 后经筛选培养基筛选，碱法提取
其重组质粒，然后用酶切及 &>P进行鉴定。
!0####表达载体的序列分析及 12!!0 的转化
对酶切及 &>P 鉴定正确的重组子再进行序列
分析，以便进一步确定 &,& 基因插入方向的正确
性，并保证读码框的准确。序列分析验证后，再用酶
VFI将表达载体 4&=>?@B& 线性化，然后通过电转
移方法将其导入酵母 ;%’’<菌株的感受态细胞。具
体操作程序按 &01203 A\48G5507D.@06提供的方法。
图 ’Z.&,&.基因结构示意图
O0FZ’Z.%]G612.J34.7^99&,&9FGDG9568R16R8G
图 !Z99真核分泌型表达载体
4&=>?@B&的构建
O0FZ!Z9>7D568R1607D97^962G9
5G18G6G_9G\48G5507D9EG16789
4&=>?@B&
!3####% & % 基因在酵母中的诱导表达
具体操作按 =DE0687FGD 公司 &01203 A\48G5507D9
@06程序进行。
!4####表达蛋白分子量的测定
取 )9 J‘ 酵母发酵液，)#9 9 8aJ0D 离心 ’<9
J0D，取上清 ’L# ‘ 进行 %Q%B&,;A，电泳后用考马
斯亮蓝染色。
!5####表达蛋白 67897:; #<=>99?;@检测
%Q%B&,;A9电泳后将表达蛋白电转移到硝酸纤
维素膜（->）上，然后用法国制备的兔抗 &,& 抗血
清作为一抗与 -> 膜上的蛋白进行免疫反应，之后
再用第二抗血清即碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗血清
对表达蛋白进行特异性鉴定。
!.####表达产物浓度的测定及其抗病毒活性的检测
由于毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，但在外源
蛋白表达时可利用酿酒酵母的分泌信号将表达的蛋
白分泌到液体培养基中，分泌的表达蛋白纯度可达
到 bLcd?Le(’#*，因此可采用紫外吸收法测定出培养
基中的总蛋白含量，即可得知分泌蛋白的表达量：取
酵母发酵培养物 ’#.LLL.8aJ0D 离心 ’<.J0D，取上清
测其在 !XL.DJ、!bL.DJ 处的吸光值，并以未诱导的
菌液培养基作对照。
表达产物抗病毒的活性检测：采用半叶法测定：
’bS
第 !期 陈定虎等：美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达
图 #$%真核表达产物对 &’( 抑制作用的测定
)*+,#,-../0%12%34563..*1756183*790:/;<*/
5/.816*.17&’(*723;8*17
-=表达蛋白接种>%?=半叶法接种测定（左：&’(%与表达
蛋白混合，右：&’(）>% @=&’(%与表达蛋白混合接种>%
A=&’( 接种。 -=% 863/8B378% C*8<% 34563..*17% 56183*7%
17D0>%?=%34563..*17%56183*7>%J*+<8I%&’(%*71;KD/8*17L>@=&’(B*43FC*8<34563..*1756183*7>A=&’(*71;KD/8*17,
取酵母发酵培养物 MNOPPP6QB*7 离心 M#B*7，取上
清（内含表达蛋白）然后将其用 P,PMB1DQH 的磷酸
缓冲液（5RS,P）进行梯度稀释，再分别与同浓度的
烟草花叶病毒（&’(）等体积混合后，接种到 &’(
的枯斑寄主心叶烟叶片上，同时用 &’( 作对照，各
处理 MP 株 NP 张叶片，!#!下观察烟叶发病情况并
统计烟叶上病斑数目。
! 结果和分析
!#$%& ’ & 基因的 &() 扩增
P,TU的琼脂糖凝胶电泳检查 :@J 扩增结果=发
现只有一条 AV- 带=其大小与预期值一致=将其克
隆到 5WX’E& 载体上 然后对其进行核酸序列测定=
结果表明，扩增的基因片段大小为 SMM%95，与国外报
道的 :-: 基因序列仅有一个碱基的差异=但其编码
的氨基酸没有变化。
!#!%%%%表达载体 *&+(,- E& 的鉴定
对表达载体 5:Y@Z[E: 分别用 :@J 及 \7/?!
QV18!双酶切鉴定，结果表明 :-: 基因已经克隆于
表达载体 5:Y@Z[ 上=如图 N。
图 N,真核表达载体 5:Y@Z[E:%
:@J 及双酶切鉴定
)*+,N,% YF378*2*;/8*17% 12% 8<3%
34563..*17% ]3;816% 5:Y@Z[E:% 90%
:@J%/7F%F1K9D3%37^0B3OF*+3.E
8*17OC*8M=O分子量对照>O!=O双酶切>ON=O:@J
鉴定。M=O B/6_36 G#‘a=O TNM=O ZaS= OMNS#= OM#TaO95L>O !=O F1K9D3O 37^0B3O
F*+3.8*17OC*8!./%%%%表达载体 *&+(,- E& 的序列分析
对表达载体进行序列分析，结果发现 :-: 插入
方向及位置完全正确，可以进行下一步诱导表达。
!.0%%& ’ & 基因的诱导表达及表达蛋白的 121 E&’34
分析
带有表达载体的 W\MM# 在 !TO!条件下，在
?’’b 培养基 （Mc%03/.8%3486/;8=% !U%5358173=MPP%
BB1DQH%518/..*KB%5<1.5P,PPPPa%9*18*7=MU%B38养基离心后，再取上清经 \A\E:-WX 电泳分析=%发
现在泳道中有一条非常明显的蛋白带，大小约为 Na%
_A=%比预期值 !‘%_A 要大=%而在阴性对照中几乎看
不到任何蛋白带，如图 a，经测定其蛋白表达量约为
#Pd‘P +QBH上清液
图 a,%表达蛋白 \A\E:-WX 分析
)*+,a,%-7/D0.*.%12%34563..*17%56183*7%90%\A\E:-WX
M=%B/6_36>%!=%表达蛋白>%N=阴性对照。
M=%B1D3;KD/6%C3*+<8%B/6_36>%!=%34563..*17%56183*7%
*7%.K5367/8/78%12%8<3%B3F*KB>%N=%73+/8*]3%;17861D,
!#5%%%%表达蛋白的鉴定
经 e3.8367E9D188*7+ 分析发现表达蛋白带能够
与法国制备的 :-: 兔抗血清发生特异性免疫反应=
（图 N），说明 :-: 基因在酵母中得到了正确表达。
!#6表达蛋白抗病毒活性检测
!#%!下 #%F 后即可发现在接种 &’( 的心叶烟
叶片上产生了大量的褐色局部病斑，而与表达蛋白
混合的 &’(的叶片上仅产生零星病斑，如图 #。根
据病斑平均数计算，在表达产物稀释 MPP倍时，其病
毒侵染抑制率仍可达到 TN,#MU，对病斑统计数进行
显著性 8 测验=结果表明=表达蛋白对病毒的侵染的
抑制作用达到了极显著水平。
MT#
农 业 生 物 技 术 学 报 !# 年
! 讨论
植物病毒是一种很难用药剂防治的病原物，而
$%$具有广谱的抗病毒侵染的特性，用 $%$ 防治植
物病毒的为害&有两条途径可以利用：一是通过基因
工程的方法，将 $%$ 基因转入植物，使 $%$ 在转基
因植物体内进行表达；二是在体外大量生产 $%$，
做成抗病毒制剂来防治病毒，而在体外大量生产
$%$，较为可行的方法是通过酵母高效率的发酵。
酵母具有不同于其它表达系统的优势：第一，有
先进的异源蛋白折叠途径，当使用酵母分泌信号序
列时，酵母可以分泌经正确折叠和加工的蛋白质，因
此有功能的和完整折叠的异源蛋白可以分泌到培养
基中；第二，酵母可以在简单的培养基中快速生长，
并能高效发酵，生产异源蛋白。因此自 ’()年以来，
酵母一直被用来大规模生产人、动物及植物来源的
蛋白质。随着工业大规模发酵技术的广泛应用，酵母
在表达临床和其它重要蛋白质方面已显示出了极大
的应用价值。
本实验构建一种分泌型 *+,-表达载体，即含表
达载体的酵母菌株在含甲醇的培养基上生长缓慢，
其表达的异源蛋白可分泌到培养基中&. 由于酵母本
身不分泌内源蛋白，方便目的基因表达蛋白质的纯
化。我们在实验中发现阴性对照的培养基上清液在
电泳道上几乎看不到任何蛋白带，而在经诱导的培
养基上清在电泳道中有一条非常明显的目标蛋白
带，这可以比较容易地分离出表达的目的蛋白。另
外，在 /0/1$%23实验中我们发现表达蛋白的表观
分子量（4554678,.9:;7<+;46.=7>?@,）为 #A.B0，要比
实际的由基因推导的翻译产物分子量 !C.B0 大，分
析其可能原因主要有二：’D毕赤酵母常常要对表达产
物进行糖基化，因而增加了基因产物的分子量，而且
糖基化也使其空间结构趋于复杂，降低了它的泳动
迁移率；!D.其信号肽加工不完全，即未完全切除表达
产物 E端的信号肽，从而加大了基因产物的分子量。
参 考 文 献
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5:B7=77J.48,>G>64;.56:,7>8.>8@>M>,.G>64;.>8I7<,>:8.M+,.J:7-.8:,.
J75+6>84,7.@:-,.6>M:-:97-D. $6:<.E4,;.%<4J./<>.S/%&. ’((O&
(AQ#)CCR#)O’
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微生物学报，’((O，#OQ.A)#RA)P
’)C