全 文 ：单纯疱疹病毒性角膜炎土贝母皂甙点眼的
浓度筛选与刺激性评价
张晓辉1 ,孙乃学1 ,王 峰1 ,邢继龙1 ,刘先宁2 ,傅章才1
(1 西安交通大学第二医院眼科 ,西安 710004;2 陕西省西安市第一人民医院眼科 ,西安 710004)
摘要:目的 通过动物试验评价土贝母皂甙(tubeimoside, Tu)治疗单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis ,
HSK)的效果及点眼刺激性 ,并确定其点眼浓度值。方法 根据药物的眼刺激性选用 5、2 、0.8、8×10-2 、8×10-3、8
×10-4 g·L-1Tu 点眼 ,确定 0.4、0.2、0.1 g·L-1评价药物疗效。在地鼠肾细胞 BHK-21 上进行单纯疱疹病毒Ⅰ型
(HSV-1型)SM 44毒株复苏 ,制作兔HSK 模型。采用裂隙灯显微镜 、扫描电镜和透射电镜观察眼部病变的动态变化
评价 Tu 疗效。结果 5 、2 g·L-1 Tu 有中度刺激性 , 0.8 g·L-1 Tu 有轻度刺激性。 8×10-2、8×10-3 、8×10-4 g·
L-1 3 组 Tu 无任何眼刺激性。0.4 g·L-1 Tu 有轻度刺激性, 0.1 、0.2 g·L-1 Tu 无刺激性。 0.4 、0.2、0.1 g·L-1 3组
Tu 均具有一定疗效。结论 Tu 点眼剂的浓度与刺激性呈正相关, 点眼刺激性从轻度到无的界值浓度为 0.4、0.2、
0.1 g·L-1。治疗实验性 HSK有一定的疗效 , 但尚不及无环鸟苷。
关键词:土贝母皂甙;单纯疱疹病毒;角膜炎;治疗;眼刺激性
中图分类号:R772.21 文献标识码:A 文章编号:1671-8259(2003)01-0063-04
Concentration sift and irritational evaluation of tubeimoside
topically given in herpes simplex keratitis
Zhang Xiaohui , Sun Naixue , Wang Feng , Xing Jilong , Liu Xianning , Fu Zhangcai
(Department of Ophthalmology , Second Hospital , Xi an Jiaotong University , Xi an 710004 , China)
ABSTRACT:Objective To appraise the ther apeutic and ir r ita tional e ffe cts of tube imoside (Tu)on he rpes
simplex ker a titis (HSK) and establish the definite topic value r ange of concentr ation by means of animal
exper iment.Methods According to the ocular ir ritational ef fect of tubeimoside on rabbit eyes , 5 , 2 , 0.8 , 8
×10-2 , 8×10-3 and 8×10-4 g·L-1 were topically given , r espectively.Then 0.4 , 0.2 and 0.1 g·L-1 Tu were
de te rm ined to use in the next trial which focused on the tentative evalua tion on the ther apeutic ef fec t of Tu.
HSV-1(SM44str ain)was propaga ted and quantita ted on monolayers of BHK-21 cell cultur es , then rabbit model
of HSK was made af ter inoculation with scar ific ation.All eyes were examined by slit-lamp-microscopy and
corneal samples were observed under transm ission and scanning ele ctromicroscope.Results 5 , 2 g·L-1 Tu
brought about moderate irr itation , while 0.8 g·L-1 Tu had a mild ir r itat ional ef fec t.No irr itating response of
any kind could be observed on eyes administer ed by 8×10-2 , 8×10-3 , 8×10-4 g·L-1 of Tu.Mild ir ritation
occurr ed in 0.4 g·L-1 Tu , while no ir r ita tional ef fects appear ed in 0.1 and 0.2 g·L-1 Tu.Eyes inf ected by
HSV-1 , which were tre ated by 0.4 , 0.2 , 0.1 g·L-1 of Tu , responded favorably and similar ly.Conclusion
Tu concentr ation had positive cor re la tion with its ocular irr itational ef fec t.0.4 , 0.2 and 0.1 g·L-1Tu given
topically produced an ir ritational ef fect with none to mild degree.Tu , though able to cure exper imental HSK
to a cer tain degree , howeve r , has a smaller dramatic e ff ect than acyclovir on HSK.
KEYWORDS:tube imoside;herpes simplex virus;ker a titis;tr ea tment;ocular ir r ita tion
收稿日期:2002-06-20 修回日期:2002-10-28
基金项目:西安交通大学科研基金项目(No.2000KG-14)
作者简介:张晓辉(1973-),男(汉族),硕士 ,主治医师.
单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex kerati-
tis , HSK)是最常见的感染性角膜病 ,在角膜病致
盲原因中占居首位。药物仍是治疗 HSK最有效的
方法 。目前治疗 HSK 存在药物的毒性 、复发 HSK
的根治和耐药毒株的产生等问题 ,使 HSK 成为眼
科治疗的难题 。目前国内外学者仍在不断寻求安
全有效的抗 HSV-1新型药物 。
土贝母是葫芦科假贝母属植物假贝母的块茎 ,
为蔓生草本植物 ,土贝母皂甙(tubeimoside ,Tu)为其
第24卷第1期
2 0 0 3 年 2 月
西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 )
Journal of Xi an Jiaotong Univer sity (Med Sci )
Vol.24 No.1
Feb.2003
水溶性成份 , 具有抗肿瘤 、抗病毒等作用 。体外试
验中 Tu 可以抑制 HSV-1 ,本实验对 Tu 治疗实验性
HSK的刺激性 、浓度和疗效进行了深入研究。
1 材料与方法
1.1 材料 健康长耳白兔 32只 ,体重 2.5 ～ 3.5
kg ,雌雄不限 ,裂隙灯显微镜下检查双眼无疾病 。
由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
土贝母皂甙点眼液(5 、2 、0.8 g·L-1由西安交
通大学第二医院中药研究室提供;8 ×10-2 、8×
10-3 、8×10-4 、0.4 、0.2 、0.1 g·L-1 Tu 用`消疣
灵 针剂 2 g·L-1配制 ,陕西麟游制药厂生产),无
环鸟苷眼药水 (acyclovir , ACV , 1 g·L-1 ,武汉武
警制药厂生产),生理盐水(normal saline , NS ,9 g·
L-1 ,西安京西制药厂生产)。
1.2 方法
1.2.1 Tu刺激性实验 8只兔随机分 2 组 ,一组
双眼分别点 5 、2 g·L-1 Tu ,另一组分别点 NS 和
0.8 g·L-1 Tu 。给药 3 d ,停药后观察至第 7 d。点
眼方法为每天 5次 ,每次 2滴(100μL),间隔 2 h 。
每日在裂隙灯下观察 ,按卫生部药政局 1993 年眼
刺激性试验的新药评估标准进行评分[ 1] 。Tu浓度
减为 8×10-2 、8×10-3 、8×10-4 g·L-1 ,仍以 NS
为阴性对照 ,重复上述实验 。第三次实验 Tu 浓度
为0.4 、0.2 、0.1 g·L-1 。
1.2.2 Tu疗效观察 BHK-21 传代地鼠肾细胞
系用乳地鼠肾建立。试管接种 0.5 mL 细胞悬液
培养于 37 ℃ , 4 d后形成单层细胞 。接种病毒前
弃去生长液 ,换维持液 。HSV-1 SM44毒株接种在
BHK单层细胞上 ,接种第2 d开始在倒置显微镜下
观察 CPE(细胞病变效应)。第 3 d 吹打细胞与瓶
壁脱落 ,获得病毒原液 3 mL。TCID50(半数组织培
养感染量)为 1×10-7 ～ 1×10-8 ,病毒原液冻存于
-20 ℃低温冰箱备用。 20 只兔(40 只眼)用
4 g·L-1 Benoxil点眼 3次表面麻醉后 , 4.5号针头
上皮层井字划痕 ,长度 4.5 ～ 5.5 mm ,深度 0.5
mm ,微量取样器吸取 HSV-1 SM44毒株原液 30μL
点入结膜囊 ,闭眼轻揉 30 s。
20只兔随机分 5组 ,即 0.4 、0.2 、0.1 g·L-1
Tu 、ACV 阳性对照组和 NS阴性对照组 ,每组 4只
兔(8只眼),接种病毒后 18 h 开始给药 ,每日点眼
5次 ,每次2滴(100μL),间隔 2 h ,双眼接受同样治
疗 ,共 14 d。每天在裂隙灯下观察病变程度 、评分 、
拍片记录。角膜上皮病变评分标准采用 Trousdale
记分法[ 2] 。其他评价参数包括:眼睑 、结膜 、虹膜
和房水 ,其中以角膜上皮病变分值(co rneal epithe-
lial involvement sco re ,CEIS)为主要指标 。接种病
毒后第 7 d 、第 14 d和第 20 d ,分别从 Tu和盐水组
中各取一只兔角膜标本(取角膜病变接近平均计
分),电镜下观察并拍片记录 。
1.2.3 统计方法 采用双因素方差分析 ,多组间
资料比较采用 Student-Newman-Keuls方法(q 检
验)。
2 结 果
2.1 Tu刺激性实验 5 、2 、0.8 g·L-1 Tu点眼 3 d
后 ,兔眼结膜血管呈深红色 ,较多白色粘液分泌物 ,
角膜上皮灰白色水肿。虹膜充血 ,轻度肿胀 ,瞳孔
光反迟钝 。5 、2 、0.8 g·L-1Tu 3 d平均刺激分值为
10.5 、8.33 、5.92 ,已达到或接近于中度刺激性 ,停
止试验。
8×10-2 、8×10-3 、8×10-4 g·L-1 Tu 3 组用
药 7 d ,观察至第10 d ,每日评分结果为 0 ,未见有任
何刺激反应。0.1 、0.2 g·L-1 Tu点眼兔眼结膜轻
度充血 ,少许分泌物 ,瞳孔光反灵敏 ,平均积分为
0.18 和 2 , 无刺激性 。0.4 g·L -1 Tu 平均积分
4.07 , 具有轻度刺激 性。统计结果显 示 , 除
0.1 g·L-1 Tu 与 NS 无差异外(q =1.29 , P >
0.05), 其余各组间刺激性均有显著差异(P <
0.01)。
2.2 裂隙灯显微镜观察 接种病毒后 24 h ,所有
家兔角膜上皮均出现点状 、短棒状 、短树枝状病灶 ,
病变首先从划痕处角膜上皮缺损部位开始形成。
NS 组:角膜病变发展迅速 。接种后第 2 d ,出
现典型树枝状病灶 ,第 6 ～ 8 d 形成大片密集地图
状溃疡。此后上皮病变呈现好转趋势 ,但向纵深发
展 ,基质水肿较重。14 d角膜上皮病变平均记分为
2.77。眼睑疱疹发病率为 50%,结膜炎 、虹膜炎发
病率 100%,前房积脓发病率 50%。
ACV组:病变以点状病灶为主 ,基质水肿 、浸
润轻微。第 6 ～ 7 d CEIS 为 1.75 ～ 1.88 ,第 9 ～ 12
d上皮迅速愈合 。14 d 角膜上皮病变平均分值为
1.13 。实验过程中 ACV 组未见眼睑疱疹发生 ,结
膜炎发病率 62.5%,虹膜炎发病率 50%,无前房积
脓。
Tu组:接种第 2 d ,角膜上皮出现棒状 、树枝状
病灶 。第 6 ～ 7 d时 0.4 、0.2 、0.1 g·L -1 3种浓度
组病变程度均达到高峰 ,平均评分为 3.13 ～ 3.5之
间 ,形成树枝状或地图状溃疡 ,面积较 NS 组小 。
第 14 d病变面积约 25%。3组 Tu 14 d上皮病变
64 西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 24 卷
平均记分分别为 2.15 、2.07 、2.21。眼睑疱疹 、结
膜炎 、虹膜炎发病率分别为 12.5%～ 25%、100%、
87.5%,无前房积脓。0.4 、0.2 、0.1 g·L-1 Tu与
NS 之间 CEIS 比较 , q=7.75 、8.75 、7 , P <0.01 ,
差异有显著性 , 3组 Tu的 CEIS 差异无显著性 。3
组Tu 与 ACV 相比 , 差异也有显著性(P 均 <
0.01)。
表1 0.4、0.2、0.1 g·L-1 Tu 、ACV、NS 5 组兔角膜病变评分
接种后时间/ d Tu(g·L-1)
0.4 0.2 0.1 ACV NS
2 1.5 1.5 1.63 1.25 1.75
4 2.25 2.13 2.13 1.5 2.88
6 3.25 3.5 3.5 1.88 3.75
8 3.0 3.0 3.13 1.75 3.88
10 2.13 2.13 2.13 0.88 3.13
12 1.5 1.38 1.63 0.38 2.5
14 1.25 1.13 1.13 0.13 1.88
x i 2.15＊ 2.07＊ 2.21＊ 1.13＊ 2.77
注:与生理盐水组对照＊P <0.01
2.3 透射电镜 NS组:病程第 7 d ,微绒毛完全消
失 ,细胞层次呈现均质化(图 1)。病程第 14 d ,上
皮细胞增生愈合 ,微绒毛形成 ,细胞层次可见 3 ～ 4
层 ,染色质边集 ,线粒体扩张呈囊泡状。感染后第
20 d细胞结构仍紊乱不清 。
0.1 g·L-1 Tu组:感染第 7 d ,微绒毛减少或部
分消失 ,细胞层次有 2 ～ 3层 ,染色质边集(图 2)。
感染第 14 d ,微绒毛恢复 ,但排列不规则 ,细胞层次
有 7 ～ 8 层。线粒体轻度肿胀 ,粗面内质网扩张 。
细胞排列结构较整齐。感染第 20 d ,胞浆中微丝增
多 ,细胞内空泡减少 ,核形渐趋规则。
ACV组:感染第 14 d ,微绒毛排列整齐 ,细胞
层次为 7 ～ 8层 ,核形较规则 ,染色质部分边集。细
胞器发达 ,胞浆中微丝和粗面内质网较多 ,线粒体
无肿胀变性。细胞间桥粒连接紧密 ,细胞外胶原纤
维排列整齐。
2.4 扫描电镜 NS 组:感染第 7 d ,溃疡区大量细
胞碎片 、核质碎屑 ,微绒毛消失(图 3)。感染第 14
d ,微绒毛基本恢复。胞膜表面有大小不等的孔洞
或破裂 ,周围可见少数早期病变细胞。
0.1 g·L-1Tu 组:感染第 7 d ,病变上皮细胞变
圆 ,突出于表面 、松解或脱落。微绒毛较多 ,分布不
均(图 4)。感染第 14 d ,上皮修复 。上皮细胞形态较
规则 ,微绒毛排列整齐 ,胞膜表面孔洞较少。感染第
20 d ,上皮细胞尚未完全恢复正常多边形形态。
ACV组:感染第 14d ,角膜上皮细胞形态恢复
正常 ,为典型多边形 ,微绒毛排列整齐 ,分布均匀 ,
细胞膜表面基本完整。
图 1 病程第 7 天 NS 组角膜上皮细胞 (TEM×8 000)
图 2 感染第 7 天 Tu 组角膜上皮细胞 (TEM×8 000)
图 3 感染第 7 天 NS 组溃疡区上皮细胞 见细胞肿胀 、变圆 ,大部分脱落 , 基质层暴露 ,
细胞间连接松解 (SEM×2 000)
图 4 感染第 7 天 Tu 组病变上皮细胞 见细胞肿胀 , 微绒毛较多 (SEM×2 000)
3 讨 论
土贝母化学成份包括脂溶性和水溶性 2 种 。
水溶性成份即土贝母皂甙 ,经层析分离和降解产生
6种化合物 ,即土贝母皂甙甲 、乙 、丙 、丁 、腺苷和麦
芽糖 。土贝母皂甙甲抗病毒谱主要包括乳头多瘤
空泡病毒中人疣病毒和痘病毒中传染性软疣病毒 。
在原代兔肾细胞上接种不同浓度药物与病毒原液
651期 张晓辉 ,孙乃学,王 峰 ,等.单纯疱疹病毒性角膜炎土贝母皂甙点眼的浓度筛选与刺激性评价
各 0.5 mL评价药效 ,结果 Tu浓度在 1×10-5 ～ 1
×10-4 g·L-1对 HSV-1具抑制作用[ 3] 。
毒性试验结果提示 ,土贝母皂甙具有一定的毒副
作用。因此必须首先进行刺激性实验 ,筛选 Tu 进行
动物实验的点眼浓度范围值。由于 5、2、0.8 g·L-1
Tu3组眼刺激性较强 ,因此以最小浓度值 0.8 g·L-1
Tu为上限 ,浓度按10倍连续稀释 ,浓度为 8×10-2、8
×10-3 、8×10-4g·L-1 Tu 3组连续用药7 d ,无任何眼
刺激性。在 0.8 g·L-1和 8×10-2g·L-1之间按2倍连
续稀释选 3种浓度0.4、0.2 、0.1 g·L-1 ,连续用药 7 d ,
无明显眼刺激性 ,因此这 3种浓度进入下一步实验。
在 Tu治疗兔眼 HSK的实验中 ,0.4 、0.2 、0.1
g·L-1 3组 Tu均可减轻角膜病变程度 ,使 Trous-
dale 评分下降。5 组家兔角膜上皮病变程度差异
如下:ACV<0.4=0.2=0.1 g·L-1 Tu
结膜炎 、虹膜炎 、眼睑疱疹 、前房积脓等眼部指标观
察 ,说明 Tu对病情有一定改善作用 ,但程度不及
ACV , 3种浓度间无明显差异 。
病变细胞在与相邻细胞解离前 ,相邻细胞出现
相同病变 ,提示病变细胞内新合成的子代病毒通过
细胞-细胞途径直接感染相邻细胞。目前认为
HSV在细胞间扩散方式主要有 2 种:一种是通过
细胞间桥粒扩散 ,另一种是成熟病毒颗粒因感染细
胞解体 ,被释放到细胞外 ,进入邻近细胞[ 4] 。有人
曾对角膜 3种细胞进行体外培养 ,发现对 HSV-1
感染敏感性的顺序依次为:角膜基质细胞最敏感 ,
其次是内皮细胞 ,上皮细胞最不敏感。
与盐水对照组相比 , Tu药物组病变范围局限 ,
细胞结构与细胞器损害较轻 ,但与 ACV 药物对照
组相比 ,效果略差 , 这与裂隙灯下观察结果一致 。
感染第 14 d ,上皮修复后 ,从细胞层次 、细胞间连接
和细胞器的病理损害观察 ,Tu与盐水对照组相比 ,
一定程度上减轻了病理损害的发生 、发展 ,抑制病
毒向周围邻近细胞扩散 ,缩小病灶范围 ,具有一定
保护易感细胞的作用 。
本实验中选用 BHK-21进行病毒复苏 ,即毒力
扩增 ,毒株为 SM44株。国内多采用SM44株或 KOS
株的标准株 ,国外多用 McKrae株造模 ,毒力强 ,模
型易成功 ,但兔常发生疱疹病毒性脑炎而死亡 。毒
株的毒力是造模成功的关健 。影响毒株毒力的主
要因素有:①毒株类型(弱毒株和强毒株);②毒株
状态(标准株和野毒株);③毒株传代次数(由于冷
冻贮藏后大部分病毒处于休眠状态 ,部分失去活
性 ,为了增毒进行传代即复苏 ,传代后二次冻存毒
株 ,反复进行冻存与传代次数增多后 ,毒力下降可
直至丧失毒力 ,但病毒仍保持其抗原性)[ 5-7] 。
病毒分离是诊断 HSV 感染最准确而敏感的方
法 ,是其他 HSV检测方法的参照标准 ,但是本实验
未采用这一观察指标。据统计 ,病毒分离在树枝状
角膜炎阳性率为 80%,地图状溃疡阳性率为 5%～
20%,在角膜基质炎多为阴性。NS 组病毒分离结果
常为阴性 ,这不是病情好转而是病毒向深层发展的
结果 ,说明结膜囊泪液取样进行病毒分离 ,不能用于
评价药物治疗HSK的疗效。但是从已知的HSV-1
潜伏组织(如角膜 、TG)中进行病毒分离可以判断实
验药物是否对复发治疗有帮助 ,或是有助于减少
HSV-1在组织中潜伏几率 ,而对于药物在治疗过程
中病情发展变化不宜作为一个指标[ 8 ,9] 。
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(编辑 韩维栋)
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