全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2011, 27(2):455～ 457
阚雪芹 , 方向明 ,刘文倩 , 等.大丽菊花瓣衰老期差异表达蛋白质组的分析 [ J] .江苏农业学报 , 2011, 27(2):455-457.
大丽菊花瓣衰老期差异表达蛋白质组的分析
阚雪芹 , 　方向明 , 　刘文倩 , 　王海玲 , 　苏　媚 , 　谈建中
(苏州大学建筑与城市环境学院园艺系 ,江苏 苏州 215123)
收稿日期:2010-05-17
作者简介:阚雪芹(1982-),女 , 江苏徐州人 ,硕士研究生。 (E-mail)
kxx1230@163.com
通讯作者:谈建中 , (E-mail)szutjz@hotmail.com
　　关键词:　大丽菊;花瓣;衰老;差异蛋白质组
中图分类号:　S682.2+61;Q945.48　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2011)02-0455-03
AnalysisofdiferentialyexpressedproteomeinDahliapinnataCav.petals
duringsenescence
KANXue-qin, 　FANGXiang-ming, 　LIUWen-qian, 　WANGHai-ling, 　SUMei, 　TANJian-zhong
(DepartmentofHorticulture, SchoolofArchitectureandUrbanEnvironment, SoochowUniversity, Suzhou215123, China)
　　Keywords:　DahliapinnataCav.;petal;senescence;diferentialproteome
　　花瓣衰老过程是植物生命周期中的最后发育阶段 ,表现
出花色改变、花瓣萎蔫或脱落等特征 [ 1] 。有关植物花瓣衰老
的机理比较复杂 , 迄今已有营养亏缺理论 、植物激素调控理
论 、自由基学说、衰老基因调控学说及气孔调控学说等多种假
说 [ 2] ,但对大丽菊花瓣衰老相关的生理生化及分子机理的研
究迄今尚少有报道。为此 ,本研究应用双向电泳及质谱分析
技术 ,以单瓣型大丽菊(DahliapinnataCav.)花瓣为材料 , 对
不同发育阶段的蛋白质差异表达进行分析与鉴定 ,以期为深
入研究大丽菊花瓣衰老的分子机理提供新的信息。
1　材料与方法
1.1　植物材料
供试材料为单瓣型大丽菊黄色系品种 , 2008年 9月采
自苏州大学东校区花圃 , 分别从长势良好的植株上采集透色
期 、盛花期 、衰败期的花瓣 , 双蒸水冲洗干净 、晾干后 ,立即用
液氮快速冷冻 , 置 -70 ℃冰箱中保存备用。
1.2　蛋白质的提取
参照 Wang等 [3]的酚-甲醇 /醋酸铵沉淀法 ,提取大丽菊不
同开花时期花瓣的蛋白质,采用 Bradford法测定蛋白质浓度。
1.3　蛋白质双向电泳
取适量花瓣蛋白质样品溶液 , 用水化液(8 mol/L尿素 ,
4% 3-[ 3-(胆酰胺丙基)二甲氨基 ]丙磺酸内盐(CHAPS), 2
mg/ml二硫苏糖醇(DTT), 1%固定化 pH梯度(IPG)缓冲液
pH3 ～ 10, 2.5% PVP-40)补足到 350 μl(蛋白质上样量为 1
mg,含 5μl溴酚蓝指示剂), IPG胶条长 17 cm, pH3 ～ 10 [非
线性 (NL)] ,根据 IPG等电聚焦仪(GEHealthcare公司)的使
用指南进行第 1向等电聚焦电泳。第 1向电泳结束后, IPG胶
条分别用平衡缓冲液Ⅰ(0.05mol/LTris-HClpH8.8、6mol/L尿
素 、30%甘油 、2%SDS、1%DTT)和平衡缓冲液Ⅱ(用 1.25%碘
乙酰胺代替平衡缓冲液Ⅰ的 DTT)平衡 2次 ,每次 15min。第 2
向电泳 SDS-PAGE采用 12 %的分离胶 , 上样后恒流电泳。电
泳结束后 ,双向电泳凝胶用考马斯亮蓝进行染色。
双向电泳凝胶经凝胶专用扫描仪 Imagescanner(GE
Healthcare公司)进行扫描 ,利用双向电泳图谱分析软件 Im-
ageMaster5.0(GEHealthcare公司)进行分析 , 以比较大丽
菊不同开花时期花瓣蛋白质的差异表达 , 其中各个蛋白质组
分的表达量以占总蛋白点灰度值的百分比表示。
1.4　蛋白质的鉴定
从 2-DE凝胶切取差异表达蛋白质斑点 , 经胶内酶切
(胰蛋白酶酶解 20h)、酶解液提取及 ZipTip脱盐处理后 ,用
ABI公司的 4800 PlusMALDITOF/TOFTM质谱仪进行分析。
根据质谱分析数据 , 应用 MatrixScience公司的 Mascot搜索
软件检索 NCBI的非冗余数据库(NCBInr), 以鉴定各个组分
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的蛋白质种类 , 其中多肽和串联质谱(MS/MS)片段的误差
分别为 100×10-6和 0.8, 其他按通用规定和标准进行分析。
蛋白质的胶内酶切与质谱分析委托上海中科新生命生物科
技有限公司进行。
2　结 果
2.1　大丽菊花瓣开放及衰老过程中的形态变化
在大丽菊花瓣开放过程中 , 观察到透色期 、盛花期及衰
败期的花瓣具有如下形态特征:透色期的花瓣开始伸展 , 瓣
色鲜艳;盛花期的花瓣充分伸展 , 花色 、花型呈现品种固有特
征;衰败期的花瓣失水萎蔫 , 外形凌乱 ,边缘呈褐色 , 花朵渐
失观赏价值。
2.2　不同开花时期花瓣蛋白质的双向电泳分析
分别从大丽菊 3个开花时期的花瓣中提取蛋白质进行
双向电泳(2-DE),结果得到了背景清晰 、分离效果较好的电
泳图谱 , 其蛋白质组分主要分布在等电点 pI5 ～ 8、分子量
(14 ～ 90)×103的范围内。同时 , 根据 2-DE图谱的分析结
果 , 在透色期 、盛花期和衰败期分别检测到了 432、421和 387
个蛋白点 , 其中表达量差异在 2倍以上的蛋白点共有 44个。
　　根据蛋白质表达量的变化趋势 , 可将大丽菊花瓣衰老过
程中差异表达的蛋白质分为 6种类型:第Ⅰ 类 ,表达量随着
花瓣衰老的进程而持续增加;第Ⅱ类 ,表达量持续减少;第Ⅲ
类 ,表达量呈先增后降 、总体增加的趋势;第Ⅳ类 , 与第Ⅲ类
相似 ,但总体减少;第Ⅴ类 , 表达量呈先降后增 、总体增加的
趋势;第Ⅵ 类 , 与第Ⅴ类相似 ,但总体减少。
2.3　差异蛋白质的质谱分析与鉴定
根据图谱分析结果,切取差异特别明显的 15个蛋白点进行
胶内酶切及 MALDITOF-TOF质谱分析,经 Mascot搜索软件对
蛋白质数据库进行检索分析,结果成功鉴定了其中的 10个蛋白
质组分(表 1),可归纳为 4个方面的功能类型:(1)物质代谢调
节相关蛋白:如查尔酮合成酶(蛋白点 D2、D3),甲硫氨酸合成酶
(蛋白点D4、D5、D7), S-腺苷甲硫氨酸合成酶(蛋白点D10);(2)
能量代谢调节相关蛋白:如核糖核苷二磷酸激酶(蛋白点 D8),
苯醌还原酶(蛋白点 D1);(3)细胞骨架形成相关蛋白:肌动蛋
白(蛋白点 D9);(4)抗氧化系统相关蛋白:过氧化氢酶(蛋白点
D6),推测这些差异表达蛋白质与大丽菊花瓣的衰老过程密切
相关。此外,在未能鉴定的 5个蛋白质中 ,包括了 4个假定蛋白
及 1个未知功能的蛋白。
表 1　大丽菊花瓣衰老相关蛋白质的质谱鉴定结果
Table1　IdentificationofdifferentlyexpressedproteinsrelatedtosenescenceinDahliapinnatapetalsbymassspectrometry
斑点 蛋白质名称 登录号 等电点 分子量 匹配肽段数 分值
D1 Quinonereductase(Vitisvinifera)醌还原酶(葡萄) gi 37724581 5.59 17 611.8 7 100
D2 ChalconesynthaseB(Aliumcepa)查尔酮合酶 B(葱) gi 29123574 5.97 43 235.9 20 100
D3 Chalconesynthase(Perilafrutescens)查尔酮合酶(紫苏) gi 1944134 6.47 41 354.2 16 100
D4 Methioninesynthaseisozyme(Mesembryanthemumcrystalinum)
甲硫氨酸合成酶同工酶(松叶菊)
gi 8134568 5.90 84 768.7 20 100
D5 Methioninesynthaseisozyme(Solenostemonscutelarioides)
甲硫氨酸合成酶同工酶(彩叶草)
gi 8134569 6.09 84 536.8 23 100
D6 Catalase(Homogynealpina)过氧化氢酶(款冬) gi 39103352 6.58 56 946.0 16 137
D7 Methioninesynthaseisozyme(Solenostemonscutelarioides)
甲硫氨酸合成酶同工酶(彩叶草)
gi 8134569 6.09 84 803.9 20 100
D8 Nucleosidediphosphatekinase1(Arabidopsisthaliana)核糖核苷二磷酸激酶(NDPKⅠ )(拟南芥) gi 730129 6.30 16 489.5 14 100
D9 Putativeactin1(Chorisporabungeana)肌动蛋白 1(高山离子芥) gi 56181504 5.56 40 336.0 11 113
D10 S-adenosylmethioninesynthetase(Petuniahybrida)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(矮牵牛) gi 75313216 5.55 43 023.0 10 73
3　讨 论
研究植物花瓣衰老过程及其调控作用的分子机理可以
为花卉采后保鲜技术提供理论依据 ,本研究以单瓣型大丽菊
花瓣为研究对象 , 建立了差异蛋白质组研究的试验技术体
系 , 从不同发育阶段花瓣的蛋白质双向电泳图谱中检测到了
44个差异蛋白质组分 , 并成功鉴定了其中的 10个 , 它们分
别参与植物的物质和能量代谢 、自由基清除和抗氧化作用 、
细胞骨架系统及信号转导等 ,推测它们与大丽菊花瓣发育和
衰老的调控过程有关。
在花瓣物质代谢调节相关的蛋白质中 , 查尔酮合成酶
(CHS)是类黄酮生物合成途径中的关键酶之一 ,对类黄酮种
类 、含量及花色的调控具有重要影响。本研究检测到的 2种
查尔酮合成酶(蛋白点 D2和 D3)具有相同的变化趋势 , 即
在花瓣透色期表达量最高 , 盛花期和衰败期显著减少 , 分别
下降至前者的 13.1%和 16.5%,这与胡可等 [ 4]瓜叶菊花瓣
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开放过程中查尔酮合成酶的表达量变化相似。 由此推测 ,
CHS表达量的变化不仅直接影响大丽菊黄色花瓣中的查尔
酮含量 , 也可能与花瓣衰老的诱导或进程之间存在着某种联
系 , 这在以往相关研究中尚少报道。其次 , 这 2种查尔酮合
成酶的分子量相同 , 而等电点略有差异 , 推测它们为 CHS的
同工酶 ,可能是多基因家族编码的缘故 [ 5] , 或者在翻译后修
饰过程中存在某种差异。同时 ,本研究还检测到了 3种甲硫
氨酸合成酶同工酶(蛋白点 D4、D5、D7), 三者的分子量相
同 , 而等电点存在差异 ,表达量变化趋势也有所不同 ,如甲硫
氨酸合成酶同工酶 I(蛋白点 D4)表现为持续降低 , 同工酶
Ⅱ(蛋白点 D5)先升后降 ,同工酶Ⅲ (蛋白点 D7)则在衰败
期急剧下降。 检测到的 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(蛋白点
D10)仅在透色期大量表达 ,此后便开始急剧下降 , 这与花瓣
衰老期乙烯生成和释放的变化倾向相类似 [ 6-8] ,推测乙烯的
这些变化与这 2种酶的表达特征有关。
在已经鉴定的差异蛋白质组分中 ,还包括 2种与能量代
谢密切相关的蛋白质 ,如核糖核苷二磷酸激酶 Ⅰ (NDPKⅠ )
和醌还原酶(QR)。核糖核苷二磷酸激酶(NDPK)可以调节
细胞的增殖 、分化 、发育和凋亡等多种反应 [ 9] , 而醌还原酶
的主要功能是构成电子传递系统 ,参与 ATP的生成 [ 10] 、以及
保护植物细胞免受氧自由基损伤的作用 [ 11] 。本试验检测到
的 NDPKⅠ (蛋白点 D8), 其表达量在盛花期达到最高 , 出现
明显的峰值 , 随后下降 ,与 Liu等 [ 12]报导的衰老期小麦旗叶
中 NDPK过量表达的情况相似。同时 , Novikova等 [ 13]发现
乙烯处理拟南芥叶片可导致 NDPK活性增强 , 因此 , 大丽菊
花瓣衰老过程中 NDPK的变化是否也与乙烯有关 、又是如何
调控花瓣衰老进程的还有待进一步研究。而醌还原酶(蛋
白点 D1)的相对表达量虽然不高 , 但呈逐渐增加趋势 ,这与
拟南芥叶片衰老过程中醌还原酶表达上调 [ 14] 、凤梨自然成
熟过程中 NADH-醌还原酶活性增加 [ 15]的报导相一致。 可以
认为 , 醌还原酶的高表达对植物衰老过程中的能量供给以及
预防细胞损伤等具有重要意义。
本研究还检测到抗氧化系统中过氧化氢酶 (蛋白点 D6)
的表达量呈先升后降的变化趋势, 这在许多花卉中已检测到
类似的变化倾向 [ 16-18] 。可以认为 ,大丽菊盛花期花瓣中过氧
化氢酶的大量表达 ,有利于清除植物体内过多的活性氧物质 ,
而衰败期过氧化氢酶表达减少 , 可能是由于酶蛋白降解及合
成减少 、或者是活性氧增加过多的缘故。此外, 与细胞骨架形
成相关的肌动蛋白(蛋白点 D9),在大丽菊整个花期的表达量
都比较高 ,且呈先降后升 、总体增加的变化趋势, 这种变化是
否会引起衰老 、以及受哪些因素影响等还有待进一步研究。
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