全 文 ：341※分析检测 食品科学 2010, Vol. 31, No. 24
小米中VB2提取方法研究及其含量测定
董永刚 1，王 玲 2 ,*，刘立丹 2，李 庆 1
(1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学理学院，河北 保定 071001)
摘 要：通过单因素试验和正交试验分析研究不同提取液、提取方法和提取条件对小米中VB2提取效果的影响。
采用荧光分析法，在激发波长λex=471.0nm和发射波长λem=528.0nm时，测定小米中VB2的含量。结果表明：选
取H3PO4溶液为提取液，用水浴回流法，提取液浓度 0.1mol/L、提取时间 45min、提取液 pH5.0时，提取效果最
佳，且回收率可达到 89.20%～100.32%，变异系数可控制在 1.21%内。实验精密度和准确度良好，可快速、准
确的测定小米中VB 2含量。
关键词：小米；V B 2；正交试验；荧光分光光度法
Extraction and Determination of Vitamin B2 in Millet
DONG Yong-gang1，WANG Ling2,*，LIU Li-dan2，LI Qing1
(1. College of Food Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China；
2. College of Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)
Abstract ：Effect of the extraction method, solvent, solvent concentration, pH and time on the yield of vitamin B2 in the millet
was studied through single factor test and orthogonal design test. Vitamin B2 content was determined by fluorophotometric
method with excitation and emission wavelength at 471.0 nm and 528.0 nm, respectively. In the optimum extraction conditions,
millet was extracted with 0.1 mol/L of aqueous H3PO4 at pH 5.0 for 45 min in a water bath backflow. Under such conditions, the
recovery of VB2 was from 89.20% to 100.32%, with the coefficient of variation 1.21%.
Key words：millet；vitamin B2(VB2)；orthogonal experiment；fluorophotometry
中图分类号：Q563.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)24-0341-04
收稿日期：2010-03-03
作者简介：董永刚(1981—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：dygysq@sina.com
*通信作者：王玲(1963—)，女，教授，研究方向为分析化学。E-mail：wanglinghbnd@163.com
VB2是体内一些氧化还原酶的辅基，广泛参与体内
各种氧化还原反应，能促进糖、脂肪和蛋白质的代谢，
对维持皮肤、黏膜和视觉的机能有一定的作用。VB2体
内不能合成，小米是膳食中VB2的主要来源，因此测定
小米中 VB2具有重要的意义[1]。
常见的测定VB2的方法有高效液相色谱法[2-3]、荧光
光度法[3- 4]、毛细管电泳电化学法[5 ]、分光光度法等[6 ]。
样品的前处理是关键，它直接影响着VB 2的提取效果，
测量的精密度和准确度。V B 2 对热和酸稳定，易溶于
酸，在碱性溶液中受光线照射很快转化为光黄素，常
用的VB2提取液为盐酸、H2SO4和乙酸溶液。本实验拟
筛选最适宜提取液，在荧光法分析的基础上对样品前处
理条件进行改进和优化，简化了提取过程，降低了成
本，并且提高VB2的提取效果，旨在为VB2的提取测定
方法技术提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米 市售。
VB2标准品 北京奥博星生物技术责任有限公司；
淀粉酶 山东安克生物工程有限公司；3g/100mL KMnO4
溶液；体积分数 3% H 2O 2溶液；水为蒸馏水，试剂均
为分析纯。
1.2 仪器与设备
WFY-28型荧光分光光度计 天津拓普公司；pHS-
23C数字型精密酸度计 上海雷磁仪器厂；感量 1/万电
子天平 上海梅特勒 -托利多仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准液的制备[7]
VB2于 P2O5干燥器中干燥 24h，准确称取 0.0250g。
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溶解于 0.02mol/L乙酸溶液中，在蒸汽浴上恒速搅动至溶
解，冷却后定容至 1L，标准液质量浓度为 25mg/L，盛
入棕色瓶加甲苯覆盖，低温(4℃)保存。
1.3.2 标准曲线绘制
取 4.0mL标准溶液于 100mL容量瓶中，定容。分
别吸取 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL此溶液于 50mL容
量瓶中，摇匀后用 0.1mol/L磷酸调至 pH5.0，加蒸馏水定
容至刻度。此系列标准液的质量浓度为 50、100、150、
200、250μg /L，依次测定其荧光强度，用所测结果
绘制相对荧光强度与 VB 2溶液质量浓度(c)的标准曲线。
1.3.3 提取方法的选择
水浴回流法：样品经干燥后研磨，准确称取 5.00g，
于蒸馏瓶中，加入 50mL 0 . 1mo l /L 磷酸，水浴回流
45min，冷却至室温后，转至 100mL锥形瓶中，加入
含质量分数10%淀粉酶的2.5mol/L乙酸钠溶液5.0mL，摇
匀，于培养箱中，37 . 5℃培养 18h，调节 pH 5 .0，使
蛋白质充分沉淀，慢速滤纸抽滤，定容至 100mL。用
此方法测定 V B 2 含量，重复 3 次，取平均值。
沸水浴法参考文献[8]方法；超声波法参考文献[9]方
法；高压法参考文献[10 ]方法。
1.3.4 提取液的选择
分别以 0.1mol/L三氯乙酸溶液、H2SO4溶液[7]、盐
酸溶液[10]、H3PO4溶液、甲酸和乙酸溶液[11]为提取液，
用水浴回流法提取小米中的 VB 2，每种方法重复 3次，
提取液经处理后测定VB2含量，比较 6种提取液的提取
效果，以选择提取效果较好的提取液。
1.3.5 提取条件对提取效果的影响
在单因素试验基础上，对提取时间、提取液浓
度、提取液 pH 值 3个因素各取 3个水平，进行 L 9(3 4)
正交试验[12]，以测定VB2含量作为指标进行考察，因素
水平见表 1。
培养箱中，37.5℃培养 18h，调节 p H 5 . 0，使蛋白质
充分沉淀，慢速滤纸抽滤，定容至 1 0 0 m L。移取
10mL于锥形瓶中，加 1.0mL乙酸和 1.0mL 质量分数
3g/100mL的 KMnO 4溶液，静置 2min，向试样中滴
加 0 .5mL 体积分数 3% 的 H 2O 2 溶液，摇匀，至溶液
中无气泡产生[1 3]。
2 结果与分析
2.1 波长扫描
用移液管移取 2mL标准溶液于 100mL容量瓶中，定
容后取 10mL溶液于三角瓶中，调节 pH5.0，用荧光分
光光度计在 400～600nm波长范围内进行扫描见图 1。
水平
因素
A提取液浓度 /(mol/L) B提取时间 /min C提取液 pH
1 0.1 15 4
2 0.2 30 5
3 0.3 45 6
表 1 小米中 VB2 提取正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for extraction of
VB2 from millet
1.3.6 样品测定
样品经干燥后研磨，准确称取 5 . 0 0 g，于蒸馏瓶
中，加入 50mL 0.1mol/L H3PO4溶液，水浴回流 45min，
冷却至室温后，转至 100mL锥形瓶中，加入含质量分
数 10%淀粉酶的 2.5mol/L乙酸钠溶液 5.0mL，摇匀，于
由图 1可知，VB2的最佳激发波长λex=471.0nm，最
佳发射波长为λem=528.0nm。
2.2 标准曲线绘制
120
90
60
30
0
相
对
荧
光
强
度
/%
波长 /nm
460 470 480 490
A
图 1 VB2的激发 (A)和发射 (B)波长扫描
Fig.1 Excitation(A) and emission(B) spectrum of VB2
80
60
40
20
0
相
对
荧
光
强
度
/%
波长 /nm
500 520 540 560 580 600
B
图 2 VB2 标准曲线
Fig.2 Calibration curve of VB2
质量浓度 /(μg/L)
50 100 150 200 250 300
100
80
60
40
20
0
相
对
荧
光
强
度
/%
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根据标准曲线(图 2)得到回归方程为 y=0.3186x+
1.09，r=0.9993。VB2溶液在 50～250μg/L范围内呈较好
的线性关系。
2.3 提取液的选择
图 3 不同提取液提取小米中 VB2 结果比较
Fig.3 Comparison of VB2 in the millet with extracts
3.50
3.30
3.10
2.90
2.70
2.50
V
B
2
含
量
/(μ
g/
g)
提取物
三氯乙酸 HCl H3PO4 H2SO4 甲酸 乙酸
从图 3可以看出，无机酸的提取效果优于有机酸提
取，用H3PO4和H2SO4溶液提取效果较好，甲酸溶液提
取效果最差，由此实验选取 0.1mol/L 的H3PO4溶液为提
取液。
2.4 提取方法的选择
3.20
3.10
3.00
2.90
2.80
2.70
V
B
2
含
量
/(μ
g/
g)
沸水浴法 超声波法 高压法 回流法
图 4 不同提取方法提取小米中 VB2 结果比较
Fig.4 Yield of VB2 in the millet using different extraction methods
从图 4可以看出，4种提取方法相比，超声波法提
取效果最差，高压法和回流法标准偏差较小，提取效
果较好，但是高压法需要把 VB2还原成无荧光物质[10]，
步骤较多，且多次重复测定结果表明回流法的精密度较
高，且成本较低，所以实验选择回流法提取。
2.5 提取条件的选择优化
本实验选取H3PO4溶液作为提取液，则小米中VB2
的提取效果主要受到提取液浓度、提取时间和提取液
pH值 3个因素的影响，经过正交试验(表 2、3)可确定
这 3个影响因素对试验结果的影响大小，以优化提取条
件，达到理想的测定结果。
试验号
因素
VB2含量 /(μg/g)
A B C 空列
1 1 1 1 1 3.15
2 1 2 2 2 3.17
3 1 3 3 3 3.11
4 2 1 2 3 3.12
5 2 2 3 1 3.04
6 2 3 1 2 3.10
7 3 1 3 2 3.00
8 3 2 1 3 3.09
9 3 3 2 1 3.14
k1 3.14 3.09 3.11 3.11
k2 3.09 3.10 3.14 3.09
k3 3.08 3.12 3.05 3.11
R 0.06 0.03 0.09 0.02
表 2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal experiment
方差来源 偏差平方和 自由度 F
H3PO4溶液浓度 0.020 2 7.525*
提取时间 0.001 2 0.153
提取液 pH 0.026 2 9.966**
空列 0.005 2 1.881
误差 0.012 9
注：* .差异显著，P ＜ 0 . 0 5；* * .差异极显著，P ＜ 0 . 0 1。
表 3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance
由表 2 可见，各因素指标的极差均大于空列的极
差，表明各因素效应对试验均产生影响，提取后溶液
的 pH值是影响VB2提取量的主要因素，H3PO4溶液浓度
次之，提取时间最小。根据各指标的均值确定各因素
的最佳水平组合为 A 1 B 3 C 2，即 H 3 P O 4 溶液浓度为
0.1mol/L，水浴回流 45min，提取液 pH5.0时，提取效
果最佳。方差分析结果(表 3)表明，提取液 pH值对VB2
的浸出量影响极显著，提取液浓度影响显著。
2.6 精密度实验
平行移取 5 份样品液做精密度测定，测得 5 份样
品的平均值为 3 .14μg/g，标准偏差为 0.038，变异系
数较小为 1.21%，用此法测定 VB 2 含量，测定结果重
复性好。
2.7 VB2含量及加标回收率测定
实验号
含量 /(μg/g)
本法测定 国标测定
1 3.13 3.15
2 3.14 3.14
3 3.14 3.15
表 4 两种测定方法结果比较
Table 4 Comparison of two measurement methods of VB2
2010, Vol. 31, No. 24 食品科学 ※分析检测344
平行称取 3 份每份 5 . 00g 试样，分别加入 0 .20、
0.25、0.30mL VB2标准溶液测定回收率， 3个样品的回
收率测定结果，每个样品平行测定 3 次。由表 5 可见，
本实验测定VB2的平均回收率为 94.28%。
3 结 论
3.1 VB 2在酸性介质中较稳定，在酸解处理法中，酸
浓度和时间对测定结果有一定影响，本实验以 0.1mol/L
H3PO4溶液为提取液，通过正交试验对酸解条件进行优
化，与常用的盐酸溶液、乙酸溶液等提取液比较，提
高了实验精密度和准确性。相对高压法需要把VB2还原
成无荧光物质[10]，本实验用水浴回流法提取小米中VB2
实验号 本底值 /μg 加标量 /μg 测定量 /μg 平均回收率 /%
8.27
1 3.13 5.00 8.29 100.32
8.31
8.97
2 3.13 6.25 8.94 93.33
8.98
9.85
3 3.13 7.50 9.80 89.20
9.81
表 5 回收率实验结果
Table 5 Results of recovery experiment
标准曲线法测定小米中VB2的含量，并与国标[7]测
定结果比较，见表 4，结果表明本方法与国标测定结果
基本一致，但相对国标需要把VB2还原成无荧光物质[7]，
本实验用水浴回流法提取小米中VB2实验操作简单、快
速、成本较低。
2.8 回收率实验
实验成本低，精密度和准确度良好，可快速、准确的
测定小米中VB 2含量。
3.2 样品经提取后，加入淀粉酶，培养箱中培养 18h，
使结合型VB2转变为游离型VB2，以达到理想的提取效
果。提取液过滤后加入 KMnO4溶液氧化其中杂质，排
除干扰，提高测量的准确性。
参 考 文 献 ：
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