全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 08 食品科学 ※工艺技术64
小米多肽的制备及其抗氧化功能研究
刘剑利，曹向宇 *
(辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036)
摘 要：采用碱性蛋白酶Alcalase水解小米蛋白，以二苯代苦味肼基(DPPH)自由基清除率为指标，通过单因素试验
和正交试验确定小米多肽最佳制备条件，用硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验、脱氧核糖法检测其对超氧阴离子自由基
(O 2·)和羟自由基(·OH)的清除能力，分光光度法测定小鼠红细胞溶血和肝线粒体MDA生成量。结果表明：碱
性蛋白酶Alcalase制备小米多肽的最佳酶解条件为 pH8.5、[E]/[S]5%、温度 40℃、时间 3.5h、对DPPH自由基、
O2·和·OH的清除率分别为 68.93%、40.06%和 48.63%，并具有明显抑制氧化溶血现象和·OH诱导线粒体氧
化损伤的功能，表明小米多肽具有较强的抗氧化功能。
关键词：小米多肽；制备；抗氧化
Preparation and Antioxidation in vitro of Millet Peptides
LIU Jian-li，CAO Xiang-yu*
(Faculty of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)
Abstract ：Millet peptides were prepared by means of alcalase hydrolysis, and the optimum enzymatic hydrolysis parameters
were determined by single-factor test and orthogonal design. Then their scavenging activity to surperoxide anion radical and
hydroxyl radical were detected by nitroblue tetrazolium (NBT) test and deoxyribose method, and the extent of erythrocatalysis
and the formation of malondialdehyde (MDA) in liver mitochondria were detected by spectrophotometric method. The results
showed that the optimum preparation conditions for millet peptides are hydrolysis with 5% of concentration ratio of enzyme
to substrate at pH 8.5 and 40 ℃ for 3.5 h. The scavenging activity of millet peptides to DPPH radical, superoxide anion radical
(O2·) and hydroxyl radical (·OH) are 68.93%, 40.06% and 48.63%, respectively. Moreover, the millet peptides can effectively
inhibit the hemolysis of red blood cells and the damage of mitochondria. Therefore, they have significant antioxidation.
Key words：millet peptides；preparation；antioxidation
中图分类号：Q514.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)08-0064-04
收稿日期：2008-07-03
基金项目：辽宁省科技厅科技攻关项目(2004205001)
作者简介：刘剑利(1980-)，男，讲师，博士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：jianliliu@yahoo.com.cn
*通讯作者：曹向宇(1980-)，男，讲师，博士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：xiangyucao@sohu.com
随着自由基研究的不断深入，氧化应激损伤和抗氧
化保护作用的理论引起广泛关注，活性氧自由基导致的
氧化损伤被认为是引起衰老、细胞损伤、组织伤害和
细胞癌变的原因之一。因此寻找高效、低毒的抗氧化
剂已成为医学和食品科学研究的新趋势[1]，抗氧化肽由
于其重要功能和优越性而越来越受到人们的关注，已成
为国内外研究的热点[2 ]。
小米是我国主要的粮食品种之一，其种植和加工都
有着悠久的历史。小米营养丰富，其蛋白含量 9.28%，
是一种优质的植物蛋白资源[3]。目前国内小米的应用主
要还停留在初级加工阶段[2]，产品附加值低，并且国内
外未见小米多肽的研究报道。为进一步扩大小米在食品
及药品领域的应用范围，本研究在提取小米蛋白的基础
上，通过酶法制备小米多肽，以清除DPPH自由基为指
标，确定最佳制备条件，并对其抗氧化活性进行深入
研究，为小米多肽的大规模工业化生产提供理论依据和
工艺参数，为小米进一步深加工奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米(朝阳新谷 5号) 朝阳市农业高新技术研究所；
SD大鼠 中国医科大学实验动物中心。
碱性蛋白酶Alcalase(2.4AU/g)；丙二醛(MDA)测定
试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产
－
－
－
65※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 08
分析纯。
1.2 仪器与设备
PB-10标准型pH计 德国Sartorius公司；SCR 20BC
型高速冷冻离心机 日本日立公司；721型分光光度计
中国上海第三分析仪器厂；HH-6型数显恒温水浴锅 金
坛市城东科辉仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 小米蛋白制备的工艺流程
小米→粉碎→过筛(20目)→稀碱浸泡 3h(pH10)→胶
体磨研磨→离心20min(5000r/min)→取上清液→90%硫酸
铵沉淀→离心 20min(5000r/min)→沉淀→溶解沉淀→大孔
树脂脱盐→冷冻干燥→小米蛋白
1.3.2 蛋白含量测定
蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[4]。
1.3.3 小米多肽最佳制备工艺研究
1.3.3.1 单因素试验
取小米蛋白制备 8%(W /V)的悬浮液，按不同 pH
值、酶与底物浓度比([E]/[S])、温度和时间进行酶解，
沸水浴 10min灭酶，离心 15min(3500r/min)，取上清液
进行分析测定。在其他因素确定的条件下分别采用脱氧
核糖法测定 pH值，[E]/[S]、温度和酶解时间各单因素对
小米多肽清除DPPH自由基的影响。
1.3.3.2 正交试验
在单因素试验的基础上，确定正交试验各因素的水
平，以 DPPH自由基的清除率为指标，同时用 pH-s tat
法测定水解度(DH) [5]，进行 L9(34)正交试验设计，确定
小米多肽制备的最佳工艺参数。
水平 pH [E]/[S] (%) 温度(℃) 时间(h)
1 8 4 40 2.5
2 8.5 5 45 3
3 9 6 50 3.5
表1 L9(34)正交试验设计方案
Table 1 Experimental scheme of orthogonal test L9(34)
1.3.4 体外抗氧化活性实验
按正交试验确定最佳制备条件制备小米多肽，进行
体外抗氧化活性实验。
1.3.4.1 抗自由基能力测定
清除DPPH自由基能力测定参照文献[6]；清除O2·
能力测定采用 NBT法[7]；清除·OH能力测定采用脱氧
核糖法 [ 8 ]。
1.3.4.2 H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验[9]
取 S D 大鼠，眼球取血，分离红细胞，生理盐水
洗涤三次后制成 0.5%的悬液，取红细胞悬液 1.0ml于试
管中，加入小米多肽 20μl，用生理盐水定容至 1.25ml，
最后加入 0.25ml (200mmol/L)的H2O2启动反应，37℃温
育 1h后，用 4.5ml生理盐水稀释，6000r/min离心 5min，
取上清液，测定 O D 4 1 5 n m。
1.3.4.3 影响肝脏线粒体MDA生成量的测定[10]
制备大鼠肝脏线粒体，取 1ml肝脏线粒体悬浮液，
加入 0.4ml不同浓度的小米多肽和 0.4ml 0.5mmol/L的
FeSO4、0.4ml 0.5mmol/L的VC溶液，对照组以等体积
PBS代替小米多肽溶液，混匀于 37℃温育 1h后测A532nm。
2 结果与分析
2.1 小米多肽制备单因素试验
2.1.1 pH值对酶解反应的影响
酶与底物蛋白的结合与催化反应都有一个最适宜的
pH值。在[E]/[S]为 5%，温度为 50℃，水解时间 3h条
件下，选择不同的 p H 值进行水解。由图 1 可知，当
pH值为 8.5时，酶解反应所得到的小米多肽对自由基的
清除能力最强。
小米多肽对DPPH自由基的清除能力取决于底物的
水解度，而底物的水解度随[E]/[S]的变化而变化。在[E]
远小于[S]时，一般认为酶反应速度正比于[E]，故[E]/[S]
－
图1 pH值对小米多肽清除DPPH自由基活性的影响
Fig.1 DPPH radical scavenging activities of hydrolyzed millet
protein at different pH values
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
(%
)
pH
7.5 8 8.5 9 9.5
2.1.2 [E]/[S]对酶解反应的影响
图2 [E]/[S]对小米多肽清除DPPH自由基活性的影响
Fig.2 DPPH radical scavenging activities of hydrolyzed millet
protein at different concentration ratios of alcalase to substrate
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
(%
)
[E]/[S](%)
0 2 4 6 8 10
2009, Vol. 30, No. 08 食品科学 ※工艺技术66
组别 浓度(mg/ml) A值 抑制率(%)
对照 － 0.78± 0.03 －
20 0.45± 0.03* 42.31
小米多肽 40 0.32± 0.01* 58.97
80 0.20± 0.02* 74.36
表3 小米多肽对H2O2诱导的红细胞氧化溶血的影响(x± s，n=3)
Table 3 Effects of different concentrations of millet peptides on
hemolysis of red blood cells induced by H2O2 (x± s，n=3)
注：* .与对照组比较，差异极显著(p <0 . 0 1 )。下同。
－
－
影响小米多肽对DPPH自由基的清除率。图 2是在 pH8.5、
酶解温度 50℃、水解 3h，变化不同的[E]/[S]而得到的
自由基清除率曲线。可以看出，[E]/[S]为 5%时，小米
多肽对 DPPH自由基的清除率最高。
2.1.3 温度对酶解反应的影响
各种催化反应都有最适的温度。在 pH8.5、[E]/[S]
5% 及反应 3h 条件下考察不同的温度对酶解反应的影
响。由图 3可知，温度为 35℃时清除率开始上升，40℃
达到较高水平，45℃以后开始下降，故 45℃为该酶解
反应最适作用温度。
2.2 小米多肽最佳酶解工艺条件的确定
从表 2 可以看出，就水解度而言，极差值反映出
影响水解度的各因素的排列顺序为A>C>B>D，最佳酶
解条件为 A3B 3C 2D3，即 pH9、[E]/[S]6%、温度 45℃、
时间3.5h、在此条件下水解度可达31.39%；对清除DPPH
自由基能力而言，极差值反映出影响自由基清除能力的
各因素的排列顺序为 B > C > A > D，最佳酶解条件为
A 2B 2C 1D 3，即 pH8 .5、[E]/ [S ]5%、温度 40℃、时间
3.5h，在此条件下验证小米多肽对DPPH自由基的清除
率为 68.93%。从表 2还可以看出，底物的水解度与小
米多肽对 D PPH 自由基的清除能力间并不存在线性关
系，只有在特定的水解度时，清除能力最强，超过或
者低于这个水解度，清除能力下降。本实验目的是制
备抗氧化肽，故最佳制备条件为A2B 2C 1D3，即 pH8.5、
[E]/[S]=5%、温度 40℃、时间 3.5h。
试验号 A pH B [E]/[S] (%) C温度(℃) D时间(h) DH (%) 清除率(%)
1 8 4 40 2.5 20.62 47.52
2 8 5 45 3 27.81 51.63
3 8 6 50 3.5 29.45 53.04
4 8.5 4 40 3.5 23.61 48.68
5 8.5 5 50 2.5 21.68 58.89
6 8.5 6 45 3 18.62 57.34
7 9 4 50 3 25.91 46.90
8 9 5 40 3.5 27.78 60.22
9 9 6 45 2.5 31.36 48.71
K1 25.96 23.38 22.34 24.55
DH
K2 21.30 25.76 27.59 24.11
K3 28.35 26.48 25.68 26.95
R 7.05 3.10 5.25 2.83
K1 50.73 47.70 55.03 51.71
清除率
K2 54.97 56.91 49.67 51.96
K3 51.94 53.03 52.54 53.98
R 4.24 9.21 5.35 2.27
表2 正交试验结果
Table 2 Results and range analysis of orthogonal test
2.3 体外抗氧化活性实验
2.3.1 抗自由基能力测定
经测定小米多肽对O2·和·OH都有较好的清除效
果，对 O2·和·OH的清除率别为 40.06%和 48.63%，
说明制备的小米多肽具有较高的清除 O2·和·OH的能
力，并且在该条件下制备的小米多肽清除·OH 的能力
更强。
2.3.2 小米多肽对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验的
抑制作用
－
－
－
2.1.4 时间对酶解反应的影响
时间影响酶的催化反应。随着反应时间的延长，
水解度逐渐增大，小米多肽对自由基清除DPPH率也随
之增大，当底物的水解度超过了小米多肽清除DPPH自
由基能力的最适水解度时，小米多肽对自由基的清除率
随之下降。从图 4可以看出，在 pH8.5、[E]/[S]5%、温
度 45℃的条件下，以水解 3h 效果最佳。
图3 温度对小米多肽清除DPPH自由基活性的影响
Fig.3 DPPH radical scavenging activities of hydrolyzed millet
protein at different temperatures
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
(%
)
温度(℃)
35 40 45 50 55
图4 时间对小米多肽清除DPPH自由基活性的影响
Fig.4 DPPH radical scavenging activites of hydrolyzed miled
protein at different hydrolysis time
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
(%
)
时间(h)
2 2.5 3 3.5 4
67※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 08
红细胞中加入 H2O2后，红细胞膜氧化受损，导致
溶血现象。加入小米多肽后，明显抑制了氧化溶血现
象的发生，实验结果见表 3。小米多肽对 H 2O 2诱导的
红细胞氧化溶血的抑制作用在 3个浓度水平上(20、40、
80mg/ml)均达到了显著水平(p<0.01)，且表现出一定的剂
量 -效应关系。说明在本实验条件下所制备的小米多肽
能明显抑制溶血反应的发生，有效保护红细胞结构的完
整性。
2.3.3 小米多肽对肝脏线粒体MDA生成量的影响
米多肽，结果表明，以碱性蛋白酶 Alcacase 制备小米
多肽的最佳酶解条件为 pH8.5、[E]/[S]5%、温度 40℃、
时间 3 . 5 h，制备的小米多肽对 D P P H 自由基、O 2·
和·OH的清除率分别为 68.93%、40.06%和 48.63%，
能减少红细胞溶血，减轻肝脏线粒体MDA生成量，说
明小米多肽具有较强的抗氧化功能。本研究为小米多肽
的工业化生产提供理论依据和工艺参数，从而为小米多
肽更加广泛的应用于功能食品领域提供依据，其体内抗
氧化活性和抗氧化作用机理有待于进一步研究。
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组别 浓度(mg/ml) MDA (nmol/mg蛋白) MDA生成抑制率(%)
对照 － 68.83± 5.62 －
20 51.26± 4.85* 25.53
小米多肽 40 43.71± 9.66* 36.50
80 35.18± 6.93* 44.89
表4 小米多肽对肝脏线粒体MDA生成量的影响(x± s，n=3)
Table 4 Effects of different concentrations of millet peptides on
formation of malondialdehyde (MDA) in mouse liver mitochondria
(x ± s，n=3)－
－
－
在实验剂量下小米多肽均能抑制 Fe2+-VC诱导的肝
脏线粒体脂质过氧化产物MDA的生成，抑制作用随浓
度的增加而增强，高剂量下效果最明显。结果表明小
米多肽对大鼠肝线粒体损伤具有保护作用(表 4)。
3 结 论
本研究以小米为原料制备具有较高抗氧化活性的小