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异叶败酱提取物对白血病 K562 细胞作用的蛋白质组学研究*
卫东锋1 赵春燕2 程卫东1，3# 刘婷婷1 胡燕1 苏刚1
卫东锋，男，在读博士生
# 通信作者:程卫东，男，博士，教授，博士生导师，主要研究方向:中医药抗肿瘤、中药资源保护与利用，E-mail:chengweidong888@ sina． com
* 中国博士后科学基金资助项目(No． 20090450017) ，甘肃省国际科技合作计划项目(No． 2008GS00862) ，甘肃省自然科学基金项目(No．
099RJYA008) ，环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金(No． KF2008-17)
(1 兰州大学基础医学院 甘肃 730000;2 兰州大学药学院;3 北京师范大学)
摘要:目的 研究异叶败酱提取物作用于人白血病 K562 细胞的分子机制。方法 以异叶败酱提
取物作用于 K562 细胞后提取细胞总蛋白，用双向电泳对蛋白进行分离，对异叶败酱提取物处理前
后的 K562 细胞总蛋白双向电泳图谱进行差异分析，通过质谱技术鉴定差异明显的蛋白质。
结果 通过对比分析异叶败酱提取物处理前后的白血病 K562 细胞总蛋白双向电泳图谱，发现异
叶败酱提取物处理组中有 23 个蛋白点发生了明显改变。经质谱和 Mascot软件分析，成功鉴定了 3
个蛋白质，分别为热休克蛋白 90β，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，血红蛋白。结论 通过蛋白质组学技术，
发现了异叶败酱提取物处理前后白血病 K562 细胞差异明显的蛋白质点 23 个，这些差异蛋白质可
能是异叶败酱提取物对白血病 K562 细胞产生增殖抑制、凋亡诱导和诱导分化作用的关键蛋白质。
关键词:异叶败酱;K562 细胞;蛋白质组学;凋亡诱导;诱导分化
中图分类号:R285． 5
Proteomics of leukemia K562 cells treated by extracts of Yiyebaijiang
(Patrinia heterophylla)*
WEI Dong-feng1，ZHAO Chun-yan2，CHENG Wei-dong1，3#，LIU Ting-ting1，HU Yan1，SU Gang1
(1 School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Gansu 730000;2 College of Pharmacy，
Lanzhou University;3 Beijing Normal University)
Abstract:Objective To study the molecular mechanism of the extracts of Yiyebaijiang (Patrinia
heterophylla)acting on human leukemia K562 cells． Methods The total protein of K562 cells was
extracted after K562 cells were acted by the extracts of Yiyebaijiang． The proteins were separated by
using two-dimensional electrophoretogram (2-DE)． The electrophoretogram of the total protein of K562
cells were given variance analysis before and after Yiyebaijiang treatment． The proteins with obvious
differences were identified by using mass-spectrometric technique． Results There were 23 protein points
having significant changes in the group treated with the extracts of Yiyebaijiang (trial group)through
comparing and analyzing 2-DE of the total protein of K562 cells before and after Yiyebaijiang treatment．
After the analyses of mass-spectrometric technique and Mascot software，there were 3 proteins identified
successfully， including heat shock protein 90β， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and
hemoglobin． Conclusion There have been 23 protein points with obvious differences found out in K562
cells before and after Yiyebaijiang treatment through proteomics technique． These differential proteins
may be key ones for the effects of the extracts of Yiyebaijiang in inhibiting proliferation and inducing
apoptosis and differentiation in K562 cells．
Key words:Yiyebaijiang (Patrinia heterophylla) ;K562 cells; proteomics; apoptosis induction;
differentiation induction
642
北京中医药大学学报
Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine
第 35 卷第 4 期 2012 年 4 月
Vol． 35 No． 4 Apr． 2012
慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于造血
干细胞的克隆性骨髓增生紊乱恶性肿瘤［1］。大量
研究表明，CML细胞内与促进增殖和凋亡抵抗相关
的多种信号分子磷酸化及激活是其发病的主要原
因，也是 CML细胞耐受以化疗为主的联合治疗而不
能被彻底清除的主要因素之一［2］。异叶败酱
(Patrinia heterophylla bunge)属败酱科植物，是中药
墓头回的一种，具有清热解毒、消痈散结之功效。
现代药理学研究证明异叶败酱具有广泛的药理活
性，能够抗肿瘤、抗炎、抑菌、止血，可用于治疗肠道
肿瘤、慢性粒细胞白血病、肠炎等，是一种具有开发
价值的抗肿瘤中药新药［3］。
中药中化学成分多种多样，是典型的复杂物质
体系，继而导致其表现出多个效应器官、多种作用和
多个作用靶点。蛋白质组学作为一种高通量筛选方
法为中药复杂体系的研究提供了崭新的思路和方
法，非常适用于研究中药复杂成分对肿瘤的作用机
制、寻找有效的药物靶点及中药新药的开发［4］。本
课题组在前期的研究中发现异叶败酱提取物可在体
外通过诱导 K562 细胞凋亡而抑制其增殖［5］，但是
具体作用机制目前尚不清楚。为了进一步探讨异叶
败酱提取物诱导 K562 细胞凋亡过程中整体蛋白质
的变化，本实验使用蛋白质组学技术，通过比较异叶
败酱提取物处理前后 K562 细胞蛋白质表达谱的变
化，从整体蛋白质水平揭示异叶败酱提取物作用于
K562 细胞的分子机制，为临床应用异叶败酱提取物
治疗 CML提供理论依据。
1 材料
1． 1 细胞与药物
人慢性粒细胞白血病(CML)细胞系 K562 细胞
株，购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，本
实验室传代冻存。异叶败酱于 2009 年 10 月采自甘
肃省庆阳地区，经兰州大学药物化学研究所鉴定。
异叶败酱提取物按参考文献［6］方法制备，由中国
科学院西北高原生物研究所提供，以二甲基亚砜
(终浓度小于 0． 1%)助溶后用 PBS 缓冲液配制成
10 g /L 的原药储备液，－ 20 ℃ 保存。临用时以
RPMI-1640 完全培养基稀释，用 0． 22 μm孔径的滤
膜过滤除菌后，4 ℃储存备用。
1． 2 试剂
改良型 RPMI-1640 培养液、胰蛋白酶(美国
Gibco公司) ;新生牛血清(杭州四季青公司) ;二甲
基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、台盼蓝、
三羟甲基氨基甲烷(Tris )、十二烷基磺酸钠 (SDS
)、三氟乙酸四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、甲
叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硫脲、碘乙酰胺、考马斯亮
蓝 G-250 为 Sigma公司产品;固相 pH梯度胶条(pH
3 ～ 10，NL)为美国 Bio-Rad公司产品;IPG Buffer pH
3 ～ 10、Protease Inhibitor、3-(胆肽胺丙基 )-二乙胺-
丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、矿物油、甘氨
酸和低熔点琼脂糖为美国 Amresco 公司产品;其余
药品均为国产分析纯试剂。
1． 3 仪器
二氧化碳培养箱(日本 Sanyo 公司) ;倒置相差
显微镜(德国 Olympus公司) ;Model iMark 全自动酶
标仪(美国 Boi- Rad 公司) ;JY92-2D 超声波细胞破
碎机(宁波新芝公司)。PROTEAN IEF Cell 系统、
PRO2TEANⅡXL系统、Protein垂直电泳仪、GS-800
Calibrated Densitometer 扫描仪和 PDQuest 8． 0 图像
分析软件(美国 Bio-Rad 公司) ;5810R 台式高速冷
冻离心机(德国 Eppendorf 公司) ;Optima XL-100K
超速冷冻离心机(美国 Beckman coulter 公司) ;Heto
Lyo-lab 3000 型冷冻干燥机(丹麦 Heto 公司) ;
API4800 串联飞行时间质谱仪 MALDI-TOF-TOF(美
国 Applied Biosystems公司)。
2 方法
2． 1 细胞培养与收集
K562 细胞培养于含 10%新生牛血清、100 U /
mL青霉素、100 mg /L 链霉素的 RPMI-1640 培养液
中。以异叶败酱提取物处理的 K562 细胞为实验
组，未处理组为对照组，具体方法按参考文献［7］进
行。取对数生长期 K562 细胞，用含 10%小牛血清
的改良型 RPMI-1640 培养液配成 1 × 108 L －1单细胞
悬液，按每瓶 5 × 106 个细胞接种于培养瓶中，37 ℃
培养 24 h 后，换用终浓度为 50 mg /L 的异叶败酱
提取物培养液培养，对照组则不加异叶败酱提取物。
继续培养 48 h 后，收集实验组和对照组细胞，用预
冷的 PBS漂洗、离心 2 次。
2． 2 细胞总蛋白提取及纯化
参考文献［8］的方法，取约 2 × 106 个细胞重悬
于 1 mL细胞裂解缓冲液 (7 mol /L尿素，2 mol /L硫
脲，4% CHAPS，65 mmol /L DTT，40 mmol /L Tris，
5 mmol /L PMSF，0． 5% IPG buffer，Protease Inhibi-
tor)中，在液氮中反复冻融 3 次后，加入 5 mg /L
Rnase、20 mg /L Dnase，以 16 000 × g 4 ℃离心 50
min，取上清即为细胞总蛋白。采用 TCA-丙酮沉淀
742第 4 期 卫东锋等 异叶败酱提取物对白血病 K562 细胞作用的蛋白质组学研究
法纯化蛋白，Bradford 法测定蛋白浓度，其余样品冻
存于 － 80 ℃备用。
2． 3 双向电泳
参照 Bio-Rad双向电泳指南和文献［9］的改进
方案进行，在聚焦盘中均匀加入含 450 μg 蛋白质样
品的水化上样缓冲液(7 mol /L 尿素，2 mol /L 硫脲，
4% CHAPS ，65 mmol /L DTT，0． 5% 两性电解质，
0. 001%溴酚蓝)300 μL，将胶条胶面朝下放入聚焦
槽内，覆盖 2． 5 mL矿物油，然后将聚焦盘置于 PRO-
TEAN IEF Cell 电泳仪中进行等电聚焦。胶条平衡
30 min后进行 220 V 恒压 SDS-PAGE 电泳，凝胶固
定后进行考马斯亮蓝染色。
2． 4 凝胶图像分析
凝胶通过透射扫描仪进行扫描获取图像，用
PDQuest 8. 0 图像分析软件选择对照组作为参考胶，
对凝胶图谱依次进行点检测、背景消减、标准化、匹
配、建立平均凝胶，同时结合人工校正，对凝胶图像
进行分析。以图谱中蛋白点相对变化量大于 2 倍为
标准检测具有明显差异的蛋白质点。
2． 5 差异蛋白质点的质谱鉴定
在凝胶上选取 7 个差异明显的蛋白点进行切
胶、脱色、酶解、萃取等操作，制备样品。将样品放入
质谱仪中进行分析，采用正离子和自动获取数据模
式进行数据采集;选择强度最大的 10 个峰进行二级
质谱分析，得到肽质量指纹图(PMF)。使用 Mascot
Distiller 2． 1 软件和 GPS 3． 6 软件得到的质谱数据，
进行蛋白鉴定。参数如下:数据库选择 NCBI;物种
分类选 Homo sapiens;酶选 Trypsin;允许的最大漏切
位点选 1;固定修饰选 Carbamidomethyl;可变修饰选
Oxidation;肽质量容差选 0． 12 Da，质量测定值选择
monoisotopic，然后进行数据库检索。
3 结果
3． 1 超声处理和 TCA-丙酮沉淀法对 K562 细胞总
蛋白凝胶图谱的影响
蛋白样品经超声加 DNA、RNA 酶处理后，图谱
未见酸性端下部深染区，碱性端蛋白点数增多，且未
出现明显拖尾。用 TCA-丙酮沉淀法纯化蛋白后，在
4 ℃、16 000 × g 条件下离心 30 min 各 3 次后，可使
第一向等电聚焦顺利达到预设电压 10 000 V，低丰
度和高丰度蛋白都能被有效聚焦到固相 pH 胶条
中。K562 细胞总蛋白双向电泳图谱背景清亮，蛋白
点清晰，分辨率提高，图谱质量得到明显改善，见
图 1。
A 超声处理组;B TCA-丙酮沉淀组。
A ultrasonic group;B TCA-acetone precipitation group．
图 1 不同处理组 K562 细胞的双向电泳图谱
Fig． 1 2-DE grams of K562 cells in different groups
3． 2 异叶败酱提取物处理组与对照组的双向电泳
图谱分析
在相同条件下分别对异叶败酱提取物处理组和
对照组 K562 细胞总蛋白各进行 3 次双向电泳分
离，用高灵敏度的蓝银方法染色后获得分辨率高、重
复性较好的电泳图谱各 3 张。2 组图谱总体相似，
但在碱性端高分子量及酸性端低分子量区域差异较
为明显，见图 2。使用 PDQuest 8． 0 软件并结合人工
校正对凝胶图谱进行检测和分析，获得对照组和异
叶败酱提取物处理组 3 块凝胶的平均蛋白质点数分
842 北京中医药大学学报 第 35 卷
别为 378 ± 16 和 397 ± 21，平均匹配的点数分别为
328 ± 15 和 352 ± 12，匹配率分别为 86． 77% 和
88． 66%，找出差异明显的蛋白质点 23 个(差异大于
2 倍以上且在 3 组凝胶中均有相同差异) ，其中在异
叶败酱提取物处理组蛋白点表达上调的 11 个，表达
下调的 9 个，仅在对照组中表达的蛋白点 3 个。
A 对照组;B 异叶败酱提取物处理组;圆圈中所示为热休克蛋白 90β在不同组别中的表达。
A control group;B trial group;The circles showed expression of HSP 90 beta in different groups．
图 2 对照组和异叶败酱提取物处理组 K562 细胞的双向电泳图谱
Fig． 2 2-DE grams of K562 cells in control group and trial group
3． 3 差异蛋白质点的质谱鉴定
参考白血病蛋白质组学相关文献选取其中差异
较为明显的可能为关键功能蛋白的 7 个蛋白点进行
质谱分析，通过检索 NCBI 数据库共有 3 个蛋白质
得到成功鉴定，质谱鉴定结果见表 1。在异叶败酱
提取物处理组 2 个蛋白即甘油醛-3-磷酸脱氢酶和
热休克蛋白 90β 表达下调，与能量代谢、氧化应激
和细胞凋亡相关;1 个蛋白即血红蛋白表达上调，与
诱导分化相关。鉴定蛋白质的放大图和三维图见图
3(彩图见插页 2)。
表 1 差异蛋白质的质谱鉴定结果
Table 1 Identification results of differential proteins by mass-spectrometric technique．
蛋白点
Spot
序列号
ID
分子量
MW (Da)
等电点
pI
得分
Score
匹配肽段
Matched peptide
覆盖率
Coverage rate
(%)
蛋白名称
Name
17 gi |31645 36202 8． 26 484 9(8) 34 甘油醛
-3-磷酸脱氢酶 Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
15 gi |9082289 73170 5． 07 322 8(3) 18 热休克蛋白 90 β Heat shock protein 90 beta
6 gi |4885397 15684 7． 93 475 8(7) 61 血红蛋白 Hemoglobin
4 讨论
蛋白质组学技术在探讨中药提取物多靶点，多
通路作用机制及寻找药物靶标方面具有重要意
义［10 － 11］。异叶败酱是传统的抗肿瘤中药，其提取物
可以通过各种不同途径来干扰肿瘤细胞的生长和生
存［12］。本实验成功鉴定的 3 个蛋白质即甘油醛-3-
磷酸脱氢酶、热休克蛋白 90β 和血红蛋白与慢性白
血病 K562 细胞的增殖抑制、凋亡和诱导分化密切
相关。
热休克蛋白 90β (HSP 90β )在蛋白质稳定、
降解和肿瘤细胞生长、增殖、抗凋亡及多药耐药过程
中发挥重要作用［13 － 14］。异叶败酱提取物作用 K562
细胞 48 h后，如图 3 蛋白点 15 所示，HSP 90β 表达
量明显降低，表明异叶败酱提取物可能通过下调
HSP 90β 的高表达抑制其发挥分子伴侣的作用，减
弱了 K562 细胞的抗应激、抗凋亡和耐药能力，抑制
其增殖。甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH )是一个
多功能蛋白质，通过与微管蛋白结合域结合调节微
管的组合，影响细胞骨架的排列，促进膜融合，与
ATP 合成和细胞周期密切相关［15 － 16］。GAPDH 还参
与 DNA 的复制、修复，是凋亡的起始因子［17 － 18］。如
图 3 所示，K562 细胞在异叶败酱提取物处理后
942第 4 期 卫东锋等 异叶败酱提取物对白血病 K562 细胞作用的蛋白质组学研究
GAPDH 表达量明显降低，表明异叶败酱提取物可能
通过抑制 GAPDH 的表达，减少葡萄糖分解和糖原
异生，影响 DNA 修复、微管蛋白组装和膜融合等抑
制 K562 细胞的增殖并诱导其凋亡。K562 细胞具
有向红系、粒系和巨核系细胞分化的特点，血红蛋白
含量较低，经诱导分化剂作用后，随着分化成熟，血
红蛋白含量持续增加［19 － 20］。图 3 中 K562 细胞经
异叶败酱提取物作用后血红蛋白点含量明显增加，
提示异叶败酱提取物可能通过诱导 K562 细胞向幼
红细胞系分化、增强细胞的血红蛋白合成能力和改
变细胞内氧化还原状态等抑制其增殖。
综上所述，异叶败酱提取物作用 K562 细胞后
引起多种蛋白表达量的明显变化，此类蛋白可能是
异叶败酱提取物发挥抗肿瘤作用的关键蛋白靶点。
异叶败酱提取物可抑制 K562 细胞的能量代谢，并
诱导其凋亡和分化，为异叶败酱提取物在蛋白质分
子水平的抗肿瘤机制提供了新的依据。下一步仍需
采用 Western blot 和 RNAi 方法进一步验证差异蛋
白质的功能，以明确异叶败酱提取物的多作用靶标。
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