全 文 ：糙叶败酱总木脂素对K562细胞体外生长的影响＊

陈 　茹 　赵健雄 　王学习　李世刚　王惠娟
兰州大学中西医结合研究所 (甘肃 兰州 730000)
　　摘要:目的:探讨糙叶败酱提取物总木脂素对 K562细胞体外生长的影响及作用机制。方法:采用四甲基偶氮唑
盐比色法 (monotetrazolium test , MTT)测定糙叶败酱总木脂素对 K562细胞生长的影响;采用电镜技术对其进行形态学
观察;采用流式细胞仪对其进行 DNA 含量分析 , 检测经药物作用后的细胞凋亡率。结果:糙叶败酱总木脂素对 K562
细胞生长有明显的抑制作用 , 抑制作用随药物浓度增加及作用时间延长而有加强趋势 , 细胞经糙叶败酱总木脂素作用
96h , IC50 21.16μg/mL。电镜下观察到经糙叶败酱总木脂素作用 48h 后 , 一部分 K562 细胞体积变小 , 胞浆浓缩 , 胞核
染色质聚集或边集 , 核碎裂 , 凋亡小体形成 , 呈典型的凋亡形态特征。流式细胞仪可检测到经糙叶败酱总木脂素诱导
K562 细胞 48h 后产生明显的亚二倍体峰 , 细胞凋亡率为 10.1%。结论:糙叶败酱总木脂素可抑制 K562 细胞的生长 ,
作用的机制与其诱导 K562细胞凋亡有关。
　　关键词:糙叶败酱　总木脂素　K562 细胞系　细胞凋亡
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3649 (2007)05-0014-04
　　Growth-inhibiting Effect of Patrinia Scabra Bunge Lignanoid on K562 Cells/ Chen Ru　Zhao Jianxiong　Wang Xuexi　Li
Shigang 　Wang Huijuan∥Institute of Integrative Chinese and Western medicine of Lanzhou University(Lanzhou Gansu 730000 , China)
Abstract　Objective:To discuss the effects of Patrinia scabra Bunge lignanoid on K562 cells growth in vitro and the relative
mechaniam.Methods:The effects of Patrinia scabra Bunge lignanoid on K562 cells growth in vitro were assayed by monotetrazolium test
(MTT).In this research , transmission electron microscope(TEM)was employed to observe the apoptotic rates of K562 cells treated
with Patrinia scabra Bunge lignanoid , and flow cytometry(FCM)was used to analyze the DNA content and to detect the apoptotic peak
(AP).Results:Patrinia scabra Bunge lignanoid had an effect on K562 cells in a concentration-and-time-dependent manner.TEM test
showed that 48 hours after treated with Patrinia scabra Bunge lignanoid , some K562 cells became smaller in size , and had the following
typical features of cell apoptosis such as condensed cell nucleus , assembled chromatin , and disintegrated nucleus body.The apoptosis
rate was 10.1%.Conclusion:Patrinia scabra Bunge lignanoid can inhibit the growth in vitro of K562 cells and the mechanism is that it
can induce the apoptosis of K562 cells.
Key words:Patrinia scabra Bunge lignanoid　K562　apoptosis
　　败酱科多年生草本植物糙叶败酱 (Patrinia scabra
Bunge.) 和异叶败酱 (Patrinia heterophylla Bunge.)
的根及根茎中药称为墓头回 , 具有清热解毒、 消痈
排脓、 祛瘀止痛等功效。其抗肿瘤作用国内外早有
报道[ 1] 。近年研究表明:其有治疗血小板减少性紫
癜[ 2 ,3]和抗白血病[ 4 ,5]的作用 , 为治疗白血病的常用中
药。孙万里等报道:墓头回水提物对急性粒细胞性
白血病 (M2)和慢性粒细胞性白血病急粒变 (CML
-A)细胞有明显杀灭作用 , 抑制率接近 100%[ 5] 。
我们在糙叶败酱粗多糖、 总木脂素、 皂甙等提取物
的体外抗肿瘤活性的实验过程中发现糙叶败酱总木
脂素对 K562细胞生长有明显的抑制作用 , 抑制率达
99.38%, 遂进行了进一步研究 , 现报告如下。
1　材料
1.1　药材　墓头回由兰州市药材供应站提供 , 经甘
肃省医科院石长栓研究员鉴定为糙叶败酱。
1.2　培养液　RPMI-1640 (Gibco), 灭活的 10%新
生小牛血清 , 每毫升含青霉素和链霉素各 100单位。
1.3　试剂 　四甲基氮唑蓝 (MTT , Sino American
Biotechnology Co.)溶于 0.01 mol/ L、 pH7.4 的 PBS ,
浓度 5mg/mL , 过滤除菌 , 4℃冰箱避光保存。十二
烷基硫酸钠 (SDS , 南京医药公司洪声化工厂)溶于
0.01mol/L 盐酸溶液 , 终浓度为 100g/ L;二甲基亚
石风 (南京医药公司洪声化工厂);小牛血清 (四季青
公司);阿霉素 (上海华联制药有限公司 , 批号
031102A);提取分离糙叶败酱的试剂均为分析纯
(西安化学试剂厂)。
1.4　仪器　24 、 96 孔培养板 (美国 Coulter 公司);
EXL800自动酶标仪 (美国 BIL-TEK INSTRUMENT·
IC公司);CO2 恒温培养箱 (日本 SANYO 公司);
Epics XL 型流式细胞仪 (美国 Coulter公司);普通光
学显微镜 和 JEM100-CX透射电镜 (日本 OLYMPUS
公司)。
1.5　细胞及培养　人慢性粒细胞白血病 (CML)细胞
系K562引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。
用 RPMI -1640 培养液 , 37℃, 5%CO2 , 相对湿度
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基金项目:国家中药管理局课题 (04-05ZP61);甘肃省科技攻关项目 (2GSO42-A43-014-15)
100%常规培养 , 细胞悬浮生长 , 每2～ 3天传一代。
2　方　法
2.1　糙叶败酱粗总木脂素的提取分离　商品糙叶败
酱30kg , 粗制 , 水洗 , 水提 2次 , 3h/次 , 浓缩两次水
提液 , 醇沉 3次 , 乙醇终浓度 60%～ 70%, 过滤 , 浓
缩滤液 , 将浓缩液先经石油醚萃取 , 再经氯仿萃取后 ,
取氯仿萃取层 , 回收氯仿后 , 得黑褐色总木脂素。经
二甲基亚石风溶解 , 蒸馏水稀释 20倍 , 0.22μm微孔滤
膜过滤除菌 , 备用。
2.2　MTT 比色法测定细胞增殖活性　取对数生长期
K562细胞 , 用新鲜的 RPMI-1640 培养液配制成
1×105个/ml的细胞悬液 , 然后分别加入实验药物接
种于96 孔培养板中 , 终体积为每孔 100μL , 且每组
设3个平行孔 , 共设 4组:受试药组 (培养液+细胞
悬液+不同浓度糙叶败酱总木脂素)、 阴性对照组N
(培养液+细胞悬液)、 药物颜色对照组 TC (培养液
+不同浓度糙叶败酱总木脂素)、 空白对照组 B (培
养液+生理盐水)。其中糙叶败酱总木脂素浓度依次
为 12.5μg/ml、 25μg/ml、 50μg/ml、 100μg/ml、 200μg/
ml、 400μg/ml , 置 37℃, 5%CO2 培养箱中培养 24h 、
48h 、 72h 、 96h后 , 向每孔加入 MTT 溶液 (5mg/ml)
10μl , 震荡混匀后 , 继续培养 4h , 加入 10%SDS ,
100μl终止培养 , 37℃过夜 , 然后室温下在微量振荡
器上震荡 10min , 酶标仪测定 570nm 波长处的吸光度
(OD值), 实验重复 3次 , 计算生长抑制率 (Inhibi-
tion Rate, IR), 经 SPSS软件中的概率分析法求得糙
叶败酱总木脂素不同作用时间的半数抑制浓度 IC50。
IR计算公式如下:
　　生长抑制率 (%)=(N组OD均值-B组OD均值)-(T组 OD均值-TC组OD均值)
N组OD均值-B组OD均值 ×100%
2.3　电子显微镜下观察　采集对数生长期细胞 , 用
RPMI1640培养基调整至浓度为 1×105 个/ml , 接种
于150ml培养瓶中 , 每瓶 10ml, 设阴性对照组和受
试药组 , 受试药组加入糙叶败酱总木脂素 , 使其终
浓度为 400μg/ml , 全湿条件下 , 37℃、 5%CO2培养
箱中培养 , 48h 后将细胞悬液移至离心管 , 1000r/
min离心5min , 弃上清 , 并用PBS 洗细胞1～ 2次后 ,
1000r/min离心5min , 弃上清 , 沿管壁缓慢加入 3%
的戊二醛 , 4℃固定过夜后经 1%锇酸固定 , 环氧树
脂Epon812 包埋 , 超薄切片 , 醋酸铀 、 柠檬酸铅双
染色 , JEM100-CX透射电镜观察并摄片。
2.4　流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡　采集对
数生长期细胞 , 用 RPMI-1640培养基调整至浓度为1
×105个/ml, 接种于 150ml 培养瓶中 , 每瓶 10ml , 设
阴性对照组和受试药组 , 受试药组加入糙叶败酱总木
脂素 , 使其终浓度为 400μg/ml , 全湿条件下 , 37℃,
5%CO2培养箱中培养 , 48h后分别将细胞悬液移至离
心管 , 1000r/min 离心 5min , 弃上清 , 并用 PBS 洗细
胞1～ 2次后 , 1000r/min 离心 5min , 弃上清 , 沿管壁
缓慢加入 75%的冷乙醇固定 , 4℃过夜 , 离心除去固
定液 , 加入 1ml , 50μg/ml 碘化丙啶 (propidineiodide,
PI)染液(含 20μg/ml RNase A和 1%Triton X-100),
4℃避光染色 30min , 400目筛网过滤后 , 流式细胞仪
检测 , 记录激发光波波长为 488nm 处的荧光 , 并用
Multicycle DNA content and cell cycle Analysis 软件处理
结果。分析计算相应的细胞凋亡百分率。
2.5　统计学处理　采用统计软件 SPSS10.0进行 , P
<0.05为有统计学意义。
3　结果
　　MTT 测定结果表明 , 糙叶败酱总木脂素对 K562细
胞增殖有显著抑制作用, 抑制作用随药物浓度增高及作
用时间延长而有加强趋势。糙叶败酱总木脂素 400μg/
ml , 作用 K562 细胞 96h , 抑制率达 99.38%, IC50为
21.16μg/ml , 可信区间在 15.82μg/ml ～ 3076μg/ml之
间。见表 1。
表 1　不同浓度糙叶败酱总木脂素作用
不同时间对 K562细胞抑制率%及 IC50 (μg/ml)的影响
浓度μg/ml 12.5 25 50 100 200 400 IC50
24h 24.68 39.73 49.24 53.71 61.18 78.50 65.02
48h 20.47 37.52 40.86 52.03 80.09 98.72 56.39
72h 33.41 48.05 55.26 66.07 90.69 99.25 31.74
96h 40.05 56.89 62.55 70.81 99.27 99.38 21.16
　　透射电镜下观察 , 显示未经处理的 K562细胞
(阴性对照组), 细胞生长旺盛 , 细胞圆形 , 表面有
微绒毛;核大 、 部分呈双核或多核 , 质内有大量的
核蛋白体 , 其它的细胞器 (线粒体 、 内质网等)较
少 (图 1)。经糙叶败酱总木脂素作用后 48h (受试
药组), 透射电镜下可见细胞皱缩、 变小 , 胞质致
密 , 细胞器相互靠近 , 染色质固缩 , 凝结成块 , 聚
集在细胞外周 , 细胞核碎裂 , 细胞膜皱折 、 外凸 、
出芽和起泡 , 形成凋亡小体 (图 2、 3), 呈现出凋亡
细胞典型的形态学改变。
图 1　未经处理的 K562 细胞 , 核膜完整 ,
　　　细胞膜上微绒毛丰富 , 细胞器正常
·15·2007年第 25卷第 5期Vol.25 ,No.5 ,2007 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine
图 2　细胞核碎裂 , 染色质浓缩 , 边集 ,
　　　空泡形成 , 细胞膜皱折 、 外凸 、 出芽
图 3　细胞核碎裂 , 染色质浓缩 , 边集 , 细
胞膜皱折 、 外凸 、 出芽 , 产生凋亡
小体。(箭头示)
　　流式细胞仪测定 , PI 单染法进行 DNA含量分析
(见表 2):经糙叶败酱总木脂素作用 K562细胞 48h ,
较阴性对照组 , 细胞被明显阻滞在 G1期 、 处于 S期
细胞明显减少。亚二倍体峰 (Sub-G1)表示 DNA降
解 , 又称细胞凋亡峰 , 在 48h , Sub-G1 期细胞占
10.1%(图 1、 图 2)
表 2　糙叶败酱总木脂素作用
K562细胞 48h的 DNA含量分析 (%)
周期 Sub-G 1 G1 S G 2
阴性对照组 0 47.6 48.9 3.4
受试药组 10.1 69.4 20.5 3.1
图 4　阴性对照组
　　　　　
图 5　受试药组
4　讨　论
　　关于糙叶败酱及其不同提取物、 复方制剂的抗
肿瘤作用 , 近年来有大量的文献报道[ 6] 。本研究是
从糙叶败酱中分离提取出总木脂素 , 采用MTT 比色
法测定糙叶败酱总木脂素对 K562 细胞生长的影响 ,
利用透射电镜对其进行形态学观察 , 并通过流式细
胞仪对其进行 DNA含量分析 , 初步探讨糙叶败酱总
木脂素对 K562细胞的作用机制。
　　MTT 比色法是利用活细胞内线粒体琥珀酸脱氢
酶能将MTT 还原为蓝色不溶解的甲月赞结晶 , 甲月赞可
以用有机溶剂 SDS 溶解 , 利用自动酶标读数仪检测
甲月赞溶解后颜色的深浅 (用 OD 光密度值表示)可
以代表活细胞的数量和功能状态 , 并可进一步计算
生长抑制率。此法简单 、 快速、 灵敏 , 现已被广泛
用于体外肿瘤药敏的测定。 本试验 MTT 比色法显
示 , 糙叶败酱总木脂素对K562细胞增殖有显著抑制
作用。
　　在透射电镜下观察到具有凋亡典型形态学改变
的细胞。细胞凋亡有十分重要的生物学意义 , 如果
在细胞增殖和凋亡之间失去平衡 , 导致增殖细胞较
多而凋亡细胞较少 , 则发生肿瘤。而有些肿瘤 (如
淋巴瘤 、 慢性粒细胞性白血病), 其增殖率并不
高[ 7] 。凋亡的研究 , 为肿瘤的防治提供了新靶点和
新思路。不少化疗药物都是通过诱导和增强肿瘤细
胞凋亡 , 从而发挥治疗肿瘤的作用[ 8] 。
　　细胞凋亡时 , 由于凋亡小体的形成导致细胞内
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针刺大鼠后三里与三阴交对热水甩尾痛阈的影响＊
李　娇1 　孟凡迅2 、3■ 　张俊芳4 　施耀成5　张苗苗1 　周孝伟1 　高云飞1　张慎彦1
1.南通大学生命科学学院 (江苏 南通 226007)　2.南通大学神经科学系 (江苏南通 226001)
3.上海市针灸经络研究中心 (上海 201203)　4.南通大学第一附属医院 (江苏 南通 226001)
5.浙江省湖州市妇幼保健院 (浙江湖州 313000)
　　摘要:目的:观察针刺大鼠 “后三里” 与 “三阴交” 对热水甩尾测痛模型的影响。方法:分别针刺大鼠胃经线上
“后三里” 和脾经脉线上 “三阴交” 腧穴 , 以热水甩尾测痛方法分别测定其针刺前后的痛阈 , 并对结果进行统计学分
析。结果:“后三里” 腧穴针刺前 (5.90±0.38)后 (9.28±0.32)配对 t检验比较差异显著 (p=0.0001);“三阴交”
腧穴在针刺前 (5.95±0.42)后 (9.27±0.42)配对 t检验比较差异显著 (p =0.0001);“后三里” 和 “三阴交” 针刺
前后痛阈差值比较 , 未发现有统计学意义的改变 (t=0.4550 , p=0.6682)。结论:针刺胃经线上 “后三里” 和针刺脾
经线上 “三阴交” 腧穴 , 对大鼠热水甩尾模型具有相似的作用影响。
　　关键词:针刺镇痛　脂肪条带结构　后三里　三阴交　经络环
　　中图分类号:R245.3+1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3649 (2007)05-0017-02
　　The Effect of Acupuncturing Housanli Point(ST 36)and Sanyinjiao Point(SP6)on the Pain-threshold of SD Rats in the
Warm water Tail-flick Test/ Li Jiao1　Meng Fanxun2, 3　Zhang Junfang4　Shi Yaocheng5　Zhang Miaomiao1　Zhou Xiaowei1　
Gao Yunfei1　Zhang Shenyan1∥1.School of Life Science of Nantong University (Nantong Jiangsu 226007 , China)　 2.Depart-
ment of Neurology of Nantong University (Nantong Jiangsu 226001 , China)　3.Shanghai Research Center of Acupuncture and
Meridian (Shanghai 201203 , China) 　4.Affiliated Hospital of Nantong University (Nantong Jiangsu 226001 , China) 　5.
HuzhouMaternity and Child Care Hospital (Huzhou zhejiang 313000 , China)
Abstract　 Objective:To observe the effect of acupuncturing Housanli Point(ST 36) and Sanyinjiao Point(SP6)on the pain
threshold of SD rats in warm water tail-flick test.Methods:Researchers practiced acupuncturing on Housanli Point(ST 36)and Sanyin-
jiao Point(SP6) separately , then they measured the pain threshold of model rats using warm water tail-flick test before and after
acupuncture , and analyzed the results by statistical software.Results:Under paired t-test , the pain threshold at Housanli Point(ST 36)
before acupuncture(5.90±0.38)was significantly different(P =0.0001)from that after acupuncture(9.28±0.32);the pain thresh-
old at Sanjinjiao Point(SP6)before acupuncture(5.95±0.42)was also significantly different(P=0.0001)from that after acupunc-
ture(9.27±0.42).However , between the pain threshold at Housanli Point(ST36)and the pain threshold at Sanyinjiao Point(SP6)
after acupuncture , there was no statistical significance(t=0.4550 , p=0.6682).Conclusion:Acupuncture on Housanli Point(ST36)
on the Stomach Meridian and acupuncture on Sanyinjiao Point(SP6)on the Spleen Meridian have similar effects on the pain-threshold of
model rats in warm water tail-flick test.
Key words:acupuncture analgesia　the fat strip structure　Housanli(ST36)Point　Sanyinjiao Point(SP6)
　＊　基金项目:国家 973项目 (2005CB523306);上海市科学技术发展基金攻关项目 (014319365);江苏省教育厅自然科学研究基金项目
(04KJB360115)。 　　■通讯作者 , Tel:0513-5051814 , E-mai l:MFX-08@126.com
DNA的丢失 , 用DNA特异性荧光素染色后 , 凋亡细
胞荧光减弱 , 呈现G0/G1期峰前亚二倍体峰。流式细
胞DNA含量分析术以其特异 、 敏感、 大量且快速的
特点成为凋亡研究的一个有效方法。本研究应用此
方法进一步验证了糙叶败酱总木脂素可以明显诱导
K562细胞凋亡。
　　本研究证实:糙叶败酱总木脂素可抑制K562细
胞的生长 , 作用的机制与其诱导K562细胞凋亡有关。
参考文献
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10:735～ 744
(收稿日期　2007-01-17)
·17·2007年第 25卷第 5期Vol.25 ,No.5 ,2007 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine