全 文 ：� 571 �中华中医药杂志(原中国医药学报)2014年 2 月第29卷第2期 CJTCMP , February 2014, Vol . 29, No. 2
·研究报告·
通讯作者：梁冰，贵阳市北京路9号贵阳医学院药理学教研室，邮编：550004，电话：0851-6908628，E-mail：bliang163@163.com
漆姑草诱导人白血病细胞株K562凋亡的实验研究
梁冰，王雷鸣，周磊，李淑芳，沈祥春
（贵阳医学院药理学教研室，贵阳 550004）
摘要：目的：研究漆姑草（HSJ）提取物对人白血病细胞株K562细胞增殖和凋亡的影响，探讨其诱导凋亡的
作用机制。方法：采用不同浓度的HSJ作用K562细胞后，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖抑制率；
TdT酶介导的末端缺失原位标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率；免疫细胞化学法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达；比
色法检测Caspase-3和Caspase-9的活性。结果：HSJ对K562细胞的增殖抑制率随药物剂量增大而增加；HSJ作用后
细胞凋亡率增加；Bcl-2蛋白阳性表达率下降，平均透光度增加；Bax蛋白阳性表达率增加，平均透光度下降；
Caspase-3和Caspase-9的活性增强，与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：HSJ能够诱导K562
细胞凋亡；其诱导凋亡作用可能与下调Bcl-2蛋白表达水平，上调Bax蛋白表达水平，增强Caspase-3和Caspase-9的
活性有关。
关键词：漆姑草；K562细胞；增殖抑制；细胞凋亡
基金资助：贵州省教育厅自然科学研究项目[No.黔教科（2010033号）]
Induced apoptotic effects of Herba Saginae Japonicae in K562 cell
LIANG Bing, WANG Lei-ming, ZHOU Lei, LI Shu-fang, SHEN Xiang-chun
( Department of Pharmacology, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China )
Abstract: Objective: To investigate the induced apoptotic eff ects and mechanism of Herba Saginae Japonicae (HSJ) on
K562 cells. Methods: K562 cells were incubated with diff erent concentrations of HSJ. The K562 cellular proliferation inhibition
rate was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. Rate of apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl
transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The expressions of Bcl-2 and Bax proteins were determined by
immunocytochemistry method. The activity of Caspase-3 and Caspase-9 was assayed by colorimetry with a commercial kit.
Results: The K562 cellular proliferation inhibition rate increased with the increment of concentrations of HSJ. Compared
with control group, after incubated with HSJ, the apoptotic ratios were increased; the positive rate of Bcl-2 protein expression
decreased, and the average transmittance increased; the positive rate of Bax protein expression increased, and the average
transmittance decreased. The activities of Caspase-3 and Caspase-9 increased, as well the diff erences were statistically signifi cant
(P<0.05). Conclusion: HSJ could induce apoptosis of K562 cells, which might be associated with lowering protein expression
level of Bcl-2 and increasing protein expression level of Bax, enhancing Caspase-3 and Caspase-9 activity.
Key words: Herba Saginae Japonicae; K562 cell strain; Proliferation inhibition; Apoptosis
Fund assistance: Natural Science Foundation of Guizhou Provincal Education Department [No.(2010033)]
白血病又称“血癌”，是严重威胁人类生命健康的恶性肿
瘤，化疗仍是目前该病的主要治疗手段，寻找高效低毒的化疗药
物是目前药物研发的热点之一。漆姑草（Herba Saginae Japonicae，
HSJ）又名珍珠草、地松和大龙叶等，为石竹科漆姑草属一、二年
生小草本植物，具有提脓、拔毒、散结消肿、解毒止痒等功效，
民间用于白血病、漆疮、痈肿、淋巴结结核、龋齿痛等病症[1]。本
课题组曾对HSJ的药理活性进行研究，发现其在抗肿瘤方面显示
出一定疗效[2]。目前，国内有少量关于HSJ治疗白血病的临床病例
研究报告[3]，但其抗白血病的药理学研究至今未见国内外相关报
道。本研究以人慢性髓细胞性白血病急变期细胞株K562细胞为
研究对象，观察HSJ水提取物对其增殖及凋亡作用的影响，旨在
为HSJ的进一步研究开发和临床应用提供实验依据。
材料
1. 药品与试剂　HSJ，购于贵阳市药材市场，经贵阳医学
院龙庆德教授鉴定为Herba Saginae Japonicae Sagina japonica
（Sw.）Ohwi的全草；注射用盐酸多柔比星（浙江海正药业有限
公司，100901）；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（碧云天
生物技术研究所）；Bcl-2鼠单克隆抗体和Bax鼠抗人单克隆抗体
（北京中杉金桥）；Caspase-3和Caspase-9活性检测试剂盒（碧
云天生物技术研究所）。
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2. 主要仪器　XP-75型倒置荧光显微镜（OLYMPUS，日
本）；Elx 800 UV型酶联免疫检测仪（BIO-TEK，美国）。
方法
1. HSJ水提物的制备　HSJ全草加水浸泡后煮沸，先用强
火，后改用文火，保持微沸约1h，趁热过滤。药渣再加三蒸水，
同法煮沸后过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，制备成20mg/mL母
液，经0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃贮存备用。
2. MTT法检测细胞增殖抑制率　将K562细胞制成5×104/mL
的细胞悬液，接种培养24h，实验组加入HSJ，药物终浓度分别为
0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/mL，阳性药对照组加入终浓度为0.03mg/
mL的多柔比星；同时设不含药物的阴性对照组和等体积的培养基
空白对照组，每组设3个复孔。细胞继续培养至24、48、72h时，每
孔加入5mg/mL的MTT 20μL，继续培养4h，离心弃上清。每孔加入
150μL DMSO，振荡溶解结晶，测定标本在波长为490nm处的吸光
度值（OD值）。计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，LOGIT法求出
IC50值。
肿瘤细胞生长抑制率（%）=[1-（实验组OD-培养基空白对
照组OD）/（阴性对照组OD-培养基空白对照组OD）]×100%
3. TUNEL法检测细胞凋亡　取对数生长期K562细胞，
调整细胞密度至1×106/mL，经HSJ作用48h后，取50μL做细
胞涂片，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤5min，用含0.1%
TritonX-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2min，PBS洗涤2次，
加入50μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，PBS洗涤
5min×2次；荧光显微镜下观察、摄片，激发波长范围为450-
500nm，发射波长范围为515-565nm。400倍镜下，选取5个视
野，计数视野内阳性细胞数和细胞总数，计算阳性细胞表达
率。阳性细胞表达率（%）=阳性细胞数/细胞总数×100%
4. 免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达　取
对数生长期K562细胞，调整细胞浓度至5×104/mL，培养24h
后，加HSJ，使终浓度分别为1.0、2.0、4.0mg/mL，对照组加等
体积的无血清培养基。继续培养48h，2 000r/min离心收集细
胞。PBS洗涤1次，用含血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至
1×106/mL，制备细胞涂片，室温自然干燥，按试剂盒说明书操
作，偏光显微镜观察并照相记录，通过Biomias 2001图象分析
系统，高倍镜下随机选取5个不同的视野，鼠标点击法测量阳
性细胞数和细胞总数，计算阳性细胞表达率；鼠标分割法测量
平均透光度。
5. 比色法测定Caspase-3、Caspase-9活性　取对数生长期
K562细胞，同“3.”项下方法处理，经PBS洗涤后，按每200万细
胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，冰浴裂解15min；4℃
20 000r/min离心15min，取上清Bradford法测定蛋白浓度，参照
试剂盒说明书检测Caspase-3、Caspase-9活性。
6. 统计学方法　应用统计软件SPSS 13.0，数据统计以x-±s
进行，计量资料多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异具有
统计学意义。
结果
1. 药物对细胞增殖抑制率的影响　见表1。经不同浓度的
HSJ作用后，K562细胞的生长明显减慢，细胞增殖抑制率随着
HSJ浓度的增加明显增高；同一时间点，药物浓度越高，细胞增
殖抑制率越高，同一浓度下，药物作用时间越长，细胞的增殖抑
制率越高。经HSJ作用24、48和72h后的IC50分别为1.64、1.35和
1.01mg/mL。
表1　HSJ对K562细胞的增殖抑制率（x-±s，n=3，%）
组别
增殖抑制率
24h 48h 72h
HSJ（0.5mg/mL）组 11.70±0.89 12.78±3.03 21.41±0.03
HSJ（1.0mg/mL）组 15.60±1.11 29.20±1.92 30.65±0.02
HSJ（2.0mg/mL）组 46.71±2.76 63.59±4.02 82.90±4.34
HSJ（4.0mg/mL）组 91.88±1.87 96.62±1.01 98.71±0.86
HSJ（8.0mg/mL）组 97.41±0.69 98.46±0.81 99.42±0.89
阳性药对照租 48.05±1.56 79.59±2.36 92.77±2.31
2. 药物对阳性细胞表达率的影响　见图1，表2。TUNEL法
检测结果显示，与阴性对照组相比，各药物组细胞的荧光着色
在数量上和强度上都显著增高，药物组阳性细胞表达率显著高
于阴性对照组，差异具 有统计学意义（P<0.05）。
A B
DC
图1　TUNEL法检测HSJ对K562细胞的影响（×400）
注：A.阴性对照组；B.HSJ（1.0mg/mL）组；C.HSJ（2.0mg/mL）
组；D.HSJ（4.0mg/mL）组。
表2　HSJ作用后K562细胞TUNEL法结果（x-±s，n=3，%）
组别 阳性细胞表达率
阴性对照组 10.80±1.23
HSJ（1.0mg/mL）组 26.51±3.02*
HSJ（2.0mg/mL）组 44.08±4.84*
HSJ（4.0mg/mL）组 54.40±3.73*
注：与阴性对照组比较，*P<0.05。下表同。
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3. 药物对Bcl-2蛋白和Bax蛋白阳性表达率和平均透光度的
影响　见表3-表4。经HSJ作用后，与阴性对照组相比，Bcl-2蛋
白阳性表达率下降，平均透光度增加（P<0.05）；Bax蛋白阳性
表达率增加，平均透光度下降（P<0.05）。
表3　HSJ对K562细胞Bcl-2和Bax阳性表达率的影响（x-±s，n=3，%）
组别 Bcl-2 Bax
阴性对照组 90.49±10.62 73.15±6.83
HSJ（1.0mg/mL）组 84.54±6.77* 85.82±3.12*
HSJ（2.0mg/mL）组 80.33±4.71* 88.34±12.52*
HSJ（4.0mg/mL）组 75.00±3.53* 91.20±9.03*
表4　HSJ对K562细胞Bcl-2和Bax表达平均透光度的影响
（x-±s，n=3，IOD/μm2）
组别 Bcl-2 Bax
阴性对照组 97.10±2.33 129.38±6.96
HSJ（1.0mg/mL）组 100.85±6.07* 114.13±6.34*
HSJ（2.0mg/mL）组 119.83±4.95* 104.83±8.87*
HSJ（4.0mg/mL）组 144.90±5.67* 93.69±6.66*
4. 药物对Caspase活性的影响　见表5。与阴性对照组相比，
HSJ作用48h后，K562细胞Caspase-3和Caspase-9的活性明显增
高，各药物组与阴性对照组相比差异有统计学意义（P< 0.05）。
表5　HSJ对K562细胞Caspase-3，Caspase-9活性的影响（x-±s，n=3）
组别 Caspase-3 Caspase-9
阴性对照组 8.11±1.03 10.50±1.71
HSJ（1.0mg/mL）组 67.81±3.69* 44.83±6.93*
HSJ（2.0mg/mL）组 193.32±3.15* 109.90±2.37*
HSJ（4.0mg/mL）组 198.78±17.17* 120.91±4.73*
讨论
细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡的过程，是优于坏
死的一种死亡途径，细胞凋亡的异常与多种肿瘤的发生有关。
诱导白血病细胞凋亡，是目前白血病药物治疗的重要靶点之
一[4]。凋亡亦是中药抑制肿瘤细胞增殖的一条重要途径[5]。本研
究中，经HSJ提取物作用后，K562细胞的生长受到不同程度的
抑制，细胞增殖能力下降，且在一定范围内与用药剂量和作用
时间呈正比，说明HSJ对K562细胞具有增殖抑制作用。TUNEL
实验中凋亡细胞存在DNA断裂，能被荧光素标记，未凋亡细胞
几乎没有DNA断裂，故荧光素无法标记，很少被染色。实验观
察到药物组K562细胞的荧光着色在数量上和强度上都明显高
于阴性对照组，阳性表达率高于阴性对照组，差异具有统计学
意义（P<0.05），说明HSJ能够促进K562细胞凋亡，发挥其抗肿
瘤作用。
Caspase家族与Bcl-2家族是细胞凋亡过程中的重要调控
因素，二者在调控细胞凋亡的过程中又互相调节。Caspase家族
作为促细胞凋亡的酶类，以酶原形式存在，在被信号途径激活
后通过级联反应，将细胞内的蛋白质降解, 最终激活核酸内切
酶，使细胞不可逆地走向死亡。其中Caspase-3和Caspase-9分别
为凋亡级联反应的执行者和起始者，在细胞凋亡中起着重要
作用[6]。本研究通过比色法检测Caspase-3和Caspase-9的活性，
发现经HSJ作用48h后，K562细胞的Caspase-3和Caspase-9的活
性显著增加，各药物组与阴性对照组相比差异有统计学意义
（P<0.05），表明HSJ诱导K562细胞凋亡可能与Caspase家族有
关，HSJ通过激活Caspase-9，上调Caspase-9的活性，进而促进
Caspase-3的活化，Caspase-3活性的增高，进一步促使胱天蛋白
酶级联反应放大，引起K562细胞凋亡。而Bcl-2和Bax是Caspase
途径的上游调控机制，二者的表达水平能有效调节Caspase-9
和Capase-3的激活和细胞凋亡。Bcl-2和Bax可以以同源二聚体
形式存在，也可以以异源二聚体的形式存在，但其抑制凋亡的作
用则必须需要通过与Bax形成异源二聚体来实现[7-9]。本研究通过
对Bcl-2和Bax蛋白表达的免疫细胞化学分析，发现K562细胞经
HSJ提取物作用48h后，Bcl-2的阳性细胞表达率随药物浓度增
加而逐渐降低，平均透光度值逐渐上升；Bax的阳性细胞表达
率逐渐上升，平均透光度值逐渐下降。因平均透光度与细胞的
阳性表达程度呈反比关系，故结合两个指标结果，HSJ能降低
K562细胞Bcl-2的表达；上调Bax的表达。Bcl-2与Bax形成的二
聚体中，Bcl-2/Bax异源二聚体的形成减少，Bax/Bax同源二聚体
的形成增多，进而发挥促进细胞凋亡的作用。
综上所述，HSJ具有诱导K562细胞凋亡的作用，其作用与
下调Bcl-2和上调Bax、以及激活Caspase-3和Caspase-9有关。本
研究为HSJ的创新药物研制及临床应用提供了实验依据。
参 考 文 献
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