全 文 ：表 2　土甘草正丁醇提取物扭体法镇痛实验结果( x±s, n=10)
组别 剂量(g生药 /kg) 扭体次数 抑制率(%)
空白对照组 - 7.0±6.11
阿司匹林 0.2 1.3±0.95＊ 81.43
低剂量组 15.0 1.8±1.75＊ 74.29
中剂量组 30.0 1.8±1.69＊ 74.29
高剂量组 60.0 1.5±1.08＊ 78.57
　　注:与空白组比较 , ＊P<0.05。
实验结果显示 ,土甘草正丁醇提取物高 、中 、低均
具有抑制小鼠醋酸扭体反应的作用(P<0.05),其抑
制率低于阿司匹林 ,但均在 70%以上 ,且中 、低剂量没
有变化 。
3　讨论
实验结果显示 ,土甘草正丁醇提取物均有抗炎 、镇
痛效果(P<0.05)。实验中抗炎作用部分证明 [ 4] ,低
剂量无抑制作用 ,中剂量的抑制作用与对照组相当 ,高
剂量的抑制作用下降 ,说明本品的抑制作用不随剂量
增大而增大 。镇痛实验中 ,高 、中 、低剂量的抑制度基
本相当 ,均不随剂量的增大而增大。以上实验提示 ,土
甘草具有良好的抗炎 、镇痛作用 ,其作用机理有待进一
步研究 。
参考文献:
[ 1] 　广西壮族自治区中医药研究所.广西药用植物名录 [ M] .南宁:广
西人民出版社 , 1986:232.
[ 2] 　江苏新医学院.中药大辞典 [ M].上海:上海科学技术出版社 ,
1986:2698.
[ 3] 　徐叔云 ,卞如濂 ,陈修 ,等.药理实验方法学 [ M] .第 3版.北京:人
民卫生出版社 , 2002:46-49.
[ 4] 　杨东爱 ,郭力城 ,余胜民 ,等.土甘草抗炎镇痛作用研究 [ J] .中国
民族药杂志 , 2009, 15(11):55.
TheEffectofButanolExtractsfromTugancaoonAnti-inflammatoryandAnalgesic
YANGDong-ai, GUOLi-cheng, YUSheng-min, HUANGLin-yun, CHENShao-feng
(GuangxiInstituteofNationalMedicalResearch, Nanning530001, China)
Abstract:Objective:Tostudyanti-inflammatory, analgesicefectsofthebutanolextractsofTugancao.Methods:The
anti-inflammatoryandanalgesicefectsofTugancaowereobservedbymeansofdimethylbenzeneinducingearedema
model, aceticacidwrithingtest.Results:Tugancaocansignificantlyinhibittheinflammationcausedbyxylene(P<
0.05)andinhibitwrithingreactioncausedby0.7% aceticacidinmice(P<0.05).Conclusion:Tugancaohasanti-
inflammatoryandanalgesicefects.
Keywords:Tugancao;Anti-inflammatory;Analgesic
独角莲含药血清对肿瘤细胞的增殖抑制
和诱导凋亡作用的研究
客蕊1 ,华东 2＊ ,徐英杰 2 ,刚宏林 2 ,王志国 2
(1.黑龙江中医药大学附属第一医院 ,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
收稿日期:2010-12-13　　修回日期:2011-01-24
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(编号:11531350)
作者简介:客蕊(1977-),女 ,博士 ,主治医师 ,主要从事中医内科临床研究。
＊通讯作者:华东(1977-),男 ,博士 ,助理研究员 ,主要从事中药药理学研究。
摘　要:目的:观察独角莲含药血清在体外对 K562白血病细胞增殖及凋亡的影响 。方法:采用血清药
理学方法制备独角莲含药血清 ,以不同浓度的含药血清处理体外培养的 K562白血病细胞 ,采用 MTT比
色法观察独角莲含药血清对 K562细胞增殖的影响;采用流式细胞仪(FCM)及 DNA片段凝胶电泳观察
和检测细胞凋亡情况。结果:不同浓度独角莲含药血清对 K562细胞增殖具有抑制作用 ,并呈剂量依赖
关系。当含药血清作用 96h后 ,其抑制作用开始减弱。流式细胞仪检测显示 ,独角莲含药血清能够诱导
K562细胞的凋亡 ,且凋亡率随着剂量的增加而增大 ,与空白对照组比较(P<0.01);DNA琼脂糖凝胶电
泳谱可见典型的 DNA梯形带形成 。结论:独角莲含药血清具有抑制 K562白血病细胞增殖 、促进细胞
分化和诱导细胞凋亡的作用 ,其作用强度与时间 -浓度呈正相关。独角莲含药血清对 K562细胞发生
细胞毒作用可能与诱导 K562细胞凋亡有关 。
关键词:独角莲;血清药理学;K562细胞系;凋亡
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2011)02-0037-04
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　　恶性肿瘤是严重危害人类健康的大敌 ,研究和控
制肿瘤是当代医学的重大课题 ,而研制抗肿瘤药物更
成为全球范围内的研究重点 。抗肿瘤药物研究 ,是十
分活跃的研究领域 ,发展迅速 ,并已取得了令人瞩目的
成就。目前 ,抗肿瘤血管生成方面的研究已为肿瘤治
疗的研究热点 ,血管生成是肿瘤生成 、入侵和转移的关
键环节 ,原发肿瘤和转移性肿瘤持续生长的首要条件
是诱导新血管的形成。因而抑制肿瘤的血管生成 ,切
断肿瘤的营养供应及转移途径 ,从而抑制肿瘤的生长
和转移 ,是一条很有希望的肿瘤治疗新途径 ,肿瘤血管
生成抑制剂成为了肿瘤治疗的又一新的武器。 20世
纪后期 ,世界新药研究看好中草药 ,在对中草药的抗肿
瘤作用研究中发现 ,许多中草药能够对肿瘤有抑制作
用 ,独角莲辛甘 ,性大热 ,归胃肝二经 ,可以祛风痰 ,止
痛 ,治疗瘰疬 ,破伤风 ,以及毒蛇咬伤 。独角莲在中医
药治疗多种恶性肿瘤中有广泛的应用 ,并取得了较好
的临床疗效 [ 1] 。笔者采用血清药理学的方法研究独
角莲对 K562白血病细胞增殖及凋亡的影响 ,以期探
讨独角莲抗肿瘤作用及其作用机制。
1　实验材料
1.1　实验瘤株　人红白血病 K562细胞株 ,购自中科
院上海生物细胞所。
1.2　药物制备　独角莲药材均购自黑龙江中医药大
学附属第一医院中药局 ,并经本校药学院生药鉴定室
鉴定 ,确定其科属符合实验要求。根据实验需要制成
混悬液 ,步骤如下:将药物混合加水浸泡 2h, 煎煮 2
次 ,浓缩煎液成 2g·mL-1的生药浓度 ,混悬液置于玻璃
安瓿内 ,灭菌后冷藏备用。
1.3　含药血清制
1.3.1　实验动物 　Wistar大鼠 , 雄性 , 体重 250 ～
350g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。实验
动物合格证号:黑医实验动物单项准第 61号。
1.3.2　血清制备　取 Wistar大鼠随机分为 5组 ,即空
白对照组 ,独角莲低 、中 、高剂量治疗组 ,西药对照组 ,
每组 4只 , 独角莲低 、中 、高剂量治疗组分别给予
12.5、25、50g/(kg·d)灌胃 ,对空白对照组给予等体积
生理盐水灌胃 ,西药对照组给予 0.39g/(kg·d)脲嘧啶
替加氟片(齐鲁制药有限公司 ,批号:0502002),连续
灌胃给药 7d,于末次灌胃后 2h,颈动脉采血 ,无菌分离
血清 ,经 56℃、30min灭活处理后 ,用 0.22μm微孔过
滤除菌 ,置 -20℃冰箱保存备用 。
1.4　实验试剂和仪器
1.4.1　培养液　RPMI1640、IMDM购自 Gibco公司 ,
以 10.4g溶于 1000mL三蒸水中 ,用 NaHCO3调 pH值
到 7.0,正压石棉滤板压滤除菌 , 4℃冰箱保存 ,用时加
入 10%胎牛血清 、100μg·mL-1青霉素 、100μg·mL-1链
霉素。
1.4.2　胎牛血清　杭州四季青生物工程公司产品。
经 56℃、30min灭活处理后 ,置 -20℃冰箱保存备用。
1.4.3　仪器设备　置倒置光学显微镜(OLYMPUS,日
本),细胞涂片机离心机(TXD3型 ,长沙),凝胶成像系
统(ViberLourtmant,美国)。
2　实验方法
2.1　台盼兰拒染试验 [ 1]
取对数生长期的细胞 ,将细胞调整为按 1×105·
mL-1 ,接种于 24孔板内 , 每孔 1mL,治疗组加入不同
浓度的独角莲含药血清 0.5mL, 阳性对照组加入
0.5mL的脲嘧啶替加氟片含药血清 ,阴性对照组给等
体积的空白血清 ,每组设 4个平行孔 ,置 37℃ 5%CO2
培养箱内培养 ,于用接种后 24、48、72、96h分别取每组
细胞 ,加入 0.2%台盼兰拒染进行活细胞数计数 ,试验
重复 3次 ,计算平均值按下式计算 IR并绘制生长曲
线 。IR=1-实验组活细胞数 /对照活细胞数 ×100%
2.2　MTT法测定药物的细胞毒实验
取对数生长期的 K562细胞 , 接种于 96孔板 ,
100μL/孔(1 ×105 /孔), 在 37℃5%CO2培养箱内过
夜培养 ,每孔加入不同浓度的独角莲含药血清 50μL,
阳性对照组加入 50μL脲嘧啶替加氟片含药血清 ,阴
性对照组用等体积的空白血清 ,每组设 6个平行孔 ,分
别在含药血清处理细胞 24、48、72、96h后 ,在不同的时
间内每孔加入 20μLMTT(5mg/mL),孵育 4h后弃培养
液 , 每孔加 入 100μLDMSO, 终止反应 , 轻轻震荡
10min,用酶联仪在 570nm波长下测光吸收值 ,并计算
细胞生长抑制率 。
细胞生长抑制率 =1-实验组光吸收值 /对照吸收
值 ×100%
2.3　细胞凋亡诱导的测定
取对数生长期的 K562细胞 ,调整细胞的初浓度 ,
加入不同浓度的含药血清处理细胞 ,阴性对照组加入
等体积空白血清 。置 37℃5%CO2培养箱培养 72h,收
集细胞 ,用预冷的 1 ×PBS洗 2次 ,每管用 1×binding
bufer把细胞调整成 1×106浓度 ,每管取 100μL加入
5μL的 AnnexinV-FITC溶液进行染色 ,轻轻混匀 ,再
加入 5μL的 PI溶液染色 ,双染后在室温避光静止
15min后每管再加入 1×bindingbufer400μL,在 1h内
上流式细胞仪进行凋亡检测 ,凋亡后继发坏死细胞既
有膜生化改变又有膜通透性改变 , AnnexinV+, PI+;
坏死细胞呈 AnnexinV-, PI+;正常细胞呈 Annexin
V-, PI-。每份标本设一个复管 ,重复 1次 ,计算凋亡
细胞百分数 。
2.4　统计学处理
所有结果的显著性均采用实验数据以均数 ±标准
差( x±s)表示 ,统计分析采用 SAS软件处理 。
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3　实验结果
3.1　独角莲含药血清对 K562细胞生长的直接作用
不同浓度的独角莲含药血清分别作用 K562细胞
24、48、72h,对 K562细胞的增殖均有明显的抑制作
用 ,且呈剂量依赖性抑制 ,在 72h抑制作用最强 , IR分
别为 33.29%、26.76%和 12.43%,随着作用时间的延
长 ,独角莲含药血清对肿瘤细胞的抑制作用降低(高
剂量组在 96h的抑制率降至 23.30%)。结果见表 1、
图 1。
3.2　独角莲含药血清对 K562细胞增殖的直接作用
不同浓度的独角莲含药血清分别作用 K562细胞
24、48、72和 96h,对 K562细胞的增值均有明显的抑制
作用 ,且呈剂量依赖性抑制 ,在 72h抑制作用最强。随
着作用时间的延长 ,其抑制作用有减弱的趋势 。 MTT
值和细胞生长抑制率见表 2。
3.3　独角莲含药血清体外诱导 K562细胞凋亡
含药血清处理的 K562细胞 72h后经荧光素 FITC
标记磷脂酰结合蛋白 V(AnnexinV)检测磷脂酰丝氨
酸(PS),结合 PI染色双标记法 ,以区分凋亡 、坏死 、活
细胞三种状态的细胞 。流式细胞仪对细胞周期的检测
结果显示 ,独角莲含药血清具有诱导 K562细胞凋亡
的作用 ,独角莲含药血清高剂量组的细胞凋亡率为
(35.15 ±1.09), 其凋亡率明显高于空白血清组
(11.40±1.18),并呈现出剂量依赖性。且凋亡率随
着剂量的增大而增加 。结果见图 2。
图 1　不同浓度 LQC含药血清
(作用 24-96hK562细胞生长曲线)
表 1　在不同浓度独角莲含药血清对 K562细胞生长抑制作用( x±s)
组别 不同时间独角莲含药血清对 K562细胞生长的影响(×10
5 , %)
　　24h 　　 48h 　　72h 　　 96h
空白血清对照组 1.68±0.09 4.63±0.42 11.0±0.20 14.70±0.31
独角莲血清高剂量组 1.31±0.08(22.02)＊＊ 3.22±0.14(30.45)＊＊ 7.16±0.13(34.91)＊＊ 11.28±0.28(23.27)＊＊
独角莲血清中剂量组 1.63±0.09(2.98) 3.66±0.07(20.95)＊ 7.86±0.13(28.55)＊＊ 11.82±0.73(19.59)＊＊
独角莲血清低剂量组 1.67±0.07(0.06) 4.15±0.11(10.37) 9.73±0.37(11.55)＊＊ 12.90±0.18(12.24)＊＊
脲嘧啶替加氟片血清组 1.23±0.06(26.79)＊＊ 2.91±0.04(37.15)＊ 6.32±0.38(42.54)＊＊ 8.33 ±0.30(43.33)＊＊
　　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;括号内为抑制率。
表 2　独角莲含药血清在不同时间内对 K562细胞增殖的影响( x±s)
组别 不同时间独角莲含药血清对 K562细胞增值作用(OD值 , %)　　24h 　　 48h 　　72h 　　96h
空白血清对照组 0.258±0.026 0.350±0.022 0.534±0.037 0.813±0.089
独角莲血清高剂量组 0.192±0.023(25.58)＊＊ 0.254±0.024(27.43)＊＊ 0.365±0.025(31.65)＊＊ 0.629±0.146(22.63)＊
独角莲血清中剂量组 0.219±0.024(15.12)＊ 0.264±0.022(24.57)＊＊ 0.387±0.014(27.53)＊＊ 0.677±0.068(16.73)＊
独角莲血清低剂量组 0.256±0.019(0.78) 0.299±0.015(14.57)＊＊ 0.438±0.048(17.98)＊＊ 0.724±0.027(10.95)＊
脲嘧啶替加氟片血清组 0.192±0.014(25.58)＊＊ 0.246±0.022(29.71)＊＊ 0.344±0.036(35.58)＊＊ 0.497±0.082(38.87)＊＊
　　注:与空白对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
图 2　流式细胞仪检测不同浓度独角莲对 K562细胞的诱导凋亡作用(72h)
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表 3　不同浓度的独角莲含药血清对 K562细胞凋亡
诱导作用的影响( x±s)
组别 凋亡率(%)
空白血清对照组 11.40±1.18
独角莲血清高剂量组 35.15±1.09＊＊
独角莲血清中剂量组 26.68±1.83＊＊
独角莲血清低剂量组 21.66±1.50＊＊
脲嘧啶替加氟片血清组 41.64±1.13＊＊
　　注:与空白对照组比较 , ＊＊P<0.01。
4　讨论
中药成分的复杂性以及作用靶点的多样性 ,决定
了中药不同途径的抗肿瘤作用:主要是通过对肿瘤细
胞信息转导的影响 ,直接杀伤肿瘤细胞 、促进肿瘤细胞
凋亡及提高免疫功能等发挥抗肿瘤作用。祖国医学认
为 ,肿瘤多属本虚标实之证 。本虚以阴虚 、气阴两虚为
主;标实则多以热毒 、痰凝 、血瘀为主 。治法多取益气
养阴 ,清热解毒 ,化痰消瘀为治则 。独角莲味辛甘 ,性
大热 ,归胃肝二经 ,可以祛风痰 ,止痛 ,治疗瘰疬 ,破伤
风 ,以及毒蛇咬伤 。独角莲在中医药治疗多种恶性肿
瘤中有广泛的应用 ,并取得了较好的临床疗效。前期
研究结果表明 ,独角莲水提物可通过抑制 BFGF表达
而抑制肿瘤血管的生长 ,从而发挥其预防和治疗肿瘤
的作用 [ 2] 。正常细胞增殖与细胞凋亡处于动态平衡
状态 ,而肿瘤组织细胞的这一平衡状态被打破 ,表现为
无限制增殖 ,而凋亡受阻。故白血病及其他肿瘤防治
的重要方法之一就是抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细
胞凋亡 。
肿瘤细胞的增殖与凋亡在机体的内环境中起重要
作用 ,它与肿瘤的发生 、发展 、消退有着密切的关系。
诱导肿瘤细胞的分化 、促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤 、
降低肿瘤恶性程度和抑制转移的主要措施之一 。
本研究采用流式细胞术检测独角莲含药血清对
K562抑制作用及诱导凋亡情况 。结果显示 ,独角莲含
药血清作用于 K562细胞 24、48、72 h后 ,对 K562细胞
的增殖均有明显的抑制作用 ,独角莲含药血清组与空
白血清对照组之间比较 ,差异具有显著性意义 , P<
0.05,并遵循一定的量效关系;在 72h抑制作用最强 ,
独角莲含药血清高 、中 、低剂量对 K562细胞增殖的抑
制率分别为 31.65%、27.53%和 17.98%。独角莲含
药血清对 K562细胞凋亡具有诱导作用 ,在一范围内 ,
随着独角莲剂量的增大而增强 ,其高剂量组诱导细胞
凋亡的凋亡率为(35.15±1.09),明显高于空白血清
组的凋亡率(11.40±1.18),二组比较 ,差异具有显著
性意义 , P<0.05,并遵循一定的量效关系。实验结果
显示:独角莲含药血清具有抑制 K562细胞增殖和诱
导细胞凋亡的作用 ,使细胞的增殖分裂受到抑制 ,从而
诱导肿瘤细胞分化 、凋亡 ,发挥抗肿瘤效应 。该作用遵
循一定的量效关系和时效关系 。药物作用 24h即显示
出明显的抑制作用 ,在 72h抑制率高达 31.65%。
实验提示 ,独角莲含药血清能够从细胞分子水平
抗肿瘤细胞增殖 ,并遵循一定的量效关系和时效关系。
这也是独角莲协同化疗药物脲嘧啶替加氟片治疗白血
病在增效减毒方面的关键机制 。
独角莲在体外实验中表现出明显的抗肿瘤作用 ,
影响细胞生长 、增殖 ,诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤的
作用机制之一。而影响血管生成相关因子的表达 ,抑
制肿瘤新生血管生成 ,可能是独角莲抑制肿瘤的作用
另一机制 ,这一机理有待于进一步研究。
参考文献:
[ 1] 　段玉敏 ,刘书鑫 ,张红娟 , 等.独角莲乙醇提取物体外抗肿瘤实验
研究 [ J] .中医药学报 , 2010, 38(3):20-23.
[ 2] 　华东 ,客蕊 ,刚宏林 , 等.独角莲乙醇提取物对 H22肝癌小鼠抑制
瘤 BFGF表达影响的研究 [ J] .中医药信息 , 2011, 28(2):97-
100.
InhibitionofProliferationandInductionofApoptosisbytheHerb
SerumContainingHORNLIANonK562LeukemiaCels
KERui1 , HUADong2 , XUYing-jie2 , GANGHong-lin2 , WANGZhi-guo2
(1.TheFirstAfiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China;
2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China)
Abstract:Objective:TostudytheefectoftheherbserumcontainingHORNLIANontheproliferationandapoptosisof
K562leukemiacelsinvitro.Methods:PreparetheherbserumcontainingHORNLIANwithserologicpharmacological
methodandtreattheK562 leukemiacelswithcontainedherbserumofHORNLIANindiferentconcentrations.The
efectoftheherbserumontheproliferationofK562celswasobservedwithMTTassay.Efectoftheherbserumcontai-
ningHORNLIANonapoptosisofK562celswasdetectedbyflowcytometryandDNAagarosegelelectrophoresis.Re-
sults:Theherb-serumcontainingHORNLIANindiferentconcentrationscouldinhibittheproliferationofK562leuke-
miacelsdirectlyinadose-dependent.Theinhibitiveactionbegantoatenuateaftertreatmentwiththedrug-serumof
HORNLIANat96h.ThetreatedK562celsbytheherbserumcontainingHORNLIANtookonapoptosisbyflowcytom-
etry, andtheherbserumcontainingHORNLIANcouldincreasetheapoptosisrateoftheK562 celscomparedwith
blankcontrolgroupwiththeincreaseofdrugdose(P<0.01).TheDNAladderalsowasobservedbyagarosegelelectro-
phoresis.Conclusion:TheherbserumcontainingHORNLIANcouldinhibittheproliferation, increasethediferentiation
andinducetheapoptosisofK562leukemiacelsinadose-timedependentmanner.Sowecouldconcludethatcytotoxic
actionoftheherbserumcontainingHORNLIANmayberelatedtotheefectofinducingtheapoptosis.
Keywords:HORNLIAN;Serum-pharmacology;K562celline;Apoptosis
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