全 文 ：西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)　　　　　　 第 45卷 2009 年第 1 期　
Journal o f No r thw est No rmal Univer sity(Na tur al Science)　　　　　　 Vo l.45　2009　No.1　
收稿日期:2008-12-15
基金项目:甘肃省教育厅科研基金资助项目(0601-27)
作者简介:丁兰 (1964—), 女 , 四川德阳人 , 教授 , 博士 , 硕士研究生导师.主要研究方向为天然药物化学与细胞工程.
E-mail:dinglan@nw nu.edu.cn
·本刊特约稿·
异叶败酱中三萜化合物常春藤皂苷元
对人早幼粒白血病细胞 HL-60的增殖抑制 、
周期阻滞及凋亡诱导作用
丁　兰 , 侯　茜 , 徐福春 , 张　琼 , 王　瀚 , 刘国安
(西北师范大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730070)
摘　要:利用倒置显微镜观察法 、 台盼蓝排染法 、 H oechst33258 荧光染色法 、 DNA ladder 电泳以及流式细胞分析技
术 , 检测了从甘肃产异叶败酱(Patrinia heterophy l la Bunge.)中分离得到的三萜化合物常春藤皂苷元(HG)对人早幼
粒白血病细胞 H L-60 的增殖抑制 、 周期阻滞及凋亡诱导作用.结果表明 , 常春藤皂苷元在较低浓度(10 ～ 40 μmo l·
L -1)条件下 , 对 HL-60 细胞增殖具有良好的抑制作用;在较高浓度(40 ～ 50μmo l·L-1)条件下 , 对 H L-60 细胞具有致
死作用;同时 , 常春藤皂苷元对 H L-60 细胞的 G 1 期阻滞和凋亡诱导作用极可能是其实现增殖抑制和致死作用的主要
途径.
关键词:异叶败酱;常春藤皂苷元;人早幼粒白血病细胞;生长抑制;周期阻滞;凋亡
中图分类号:Q 946;Q 255　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-988 Ⅹ(2009)01-0088-06
The ef fect of Hederagenin , a t riterpnoid
f rom Patrinia heterophy l la Bunge.on the proliferation inhibition ,
cell cy cle ar rest and apoptosis of human promyelocy tic
leukemia H L-60 cells
DING Lan , HOU Qian , XU Fu-chun , ZHANG Qiong , WANG Han , LIU Guo-an
(Co llege o f Life Science , Nor thw est No rmal Univer sity , Lanzhou 730070 , Gansu , China)
Abstract:T he effects of Hederagenin(HG), a t ri terpnoid f rom Patrinia heterophy l la Bunge., on the
pro li feration inhibit ion , cell cy cle ar rest and apoptosis o f Human promyelo cy tic leukemia HL-60 cells are
measured by morpho logical observation , typanblue exclusion method , Hoechst 33258 stain assay , DNA
ladder and f low cytometry respectively.The resul ts show that Hederagenin can inhibi t the prolife rat ion of
HL-60 at low concentrations(10 ～ 40μmol·L-1)whi le make the cells death a t the high concentrations(40
～ 50 μmo l·L -1);HG can make proliferation inhibit ion and cell death on H L-60 cells through G 1 phase
arrest and apopto sis.
Key words:Patrinia heterophy lla Bunge.;hederagenin;human promyelocy tic leukemia cells;
pro li feration inhibit ion;cell cy cle ar rest;apoptosis
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　2009 年第 1 期 丁　兰等:常春藤皂苷元对人早幼粒白血病细胞 HL-60的增殖抑制 、周期阻滞及凋亡诱导作用
　2009　No.1 The effect o f HG on the prolifera tion inhibition , cell cycle a rrest and apopto sis o f H L-60 cells　
　　异叶败酱(Patrinia heterophy lla Bunge.)是败
酱科(V alerianaceae)败酱属(Patrinia Juss.)植物
多年生草本植物[ 1 ] , 也是传统中药材墓头回的药
源植物之一.墓头回的另一药源植物为糙叶败酱 ,
临床上将其用于治疗白血病[ 2 , 3] , 具有很好的疗
效.同时墓头回还用于治疗子宫癌 , 子宫颈癌 , 胃
癌等[ 1 ] .目前 , 对于上述 2种植物化学成分的研
究已有了较为系统的报道[ 4-6] , 其主要的化学成分
为三萜类化合物 , 包括熊果酸 、齐墩果酸 、 败酱皂
苷和常春藤皂苷等[ 7 ] .有关这 2种植物抗肿瘤的
研究主要还集中在植物粗提物的体内外抗肿瘤测
试[ 8-10] .有研究表明 , 这两种植物的水提物对小鼠
S180肉瘤抑制率达 62.5%, 并观察到是直接杀伤
作用[ 8 ] .而其单体化合物的抗肿瘤研究非常有限 ,
因而 , 目前尚不能知道哪种(哪些)化合物在对白血
病治疗过程中起着主导作用.
本课题组从甘肃陇南地区的异叶败酱中分离得
到了 10 余种化合物 , 鉴定出 7个三萜化合物 、 2
个甾体化合物和 1个三萜皂甙 , 并用 SRB 法对其
中分离到的得率较高的化合物进行体外毒性测试 ,
部分化合物表现出较高的抗癌活性 , 但对其抗癌机
理还 没 有 进 一 步 研 究[ 6 ] .常 春 藤 皂 苷 元
(hede ragenin　HG ,化学结构如图 1)是所分离的 7
个三萜化合物中得率高且细胞毒性较强的1种.
图 1　Hederagenin 化学结构式
Fig 1 Chemical structur e of heder agenin
有关常春藤皂苷元抗肿瘤研究很少 , 李祖
强[ 11]等用小鼠白血病细胞(L 1210)、 人结肠癌细胞
(LS174T)等癌细胞株对山苦瓜中常春藤皂苷元成
分进行了体外细胞毒性测试 , 结果表明 , 常春藤皂
苷元有较好的细胞毒活性.因此 , 进一步研究该化
合物的抗肿瘤作用及其机理 , 对于明晰异叶败酱抗
癌化学成分以及发现其中的抗癌先导化合物非常必
要.笔者研究了常春藤皂苷元在不同浓度及时间条
件下对人早幼粒白血病细胞 HL-60的增殖 、 细胞
周期及凋亡的影响 , 以期为进一步阐明抗癌中药墓
头回的抗癌成分及作用机理提供科学依据.
1　材料与方法
1.1　材料
单体化合物常春藤皂苷元(HG), 由本课题组
从甘肃陇南地区的异叶败酱中分离得到[ 6 ] , 将药
物溶于 DMSO , 在 4 ℃冰箱中保存备用.
人早幼粒白血病细胞 HL-60 引自兰州大学生
命科学学院.
RPM I-1640培养基为 Gibco 原装;胰蛋白酶
购自 Sigma 公司;新生小牛血清购自杭州四季青
生物技术有限公司;Hoechst33258荧光染料 、 溴
化乙啶(EB)购自美国 Sigma 公司.
细胞培养板为美国 Costar;超净工作台为苏净
集团安泰公司生产;二氧化碳饱和湿度恒温箱(美
国 Fo rma Scientific);Lei tz-diavert 倒置显微镜;
Olympus荧光显微镜.
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　人早幼粒白血病细胞 HL-60培
养于含 10%小牛血清的 RPM I 1640培养液中 , 加
青霉素 100 U·mL-1 , 链霉素 10-4 g·mL-1 , 置于
5%CO 2 , 37 ℃饱和湿度恒温箱中培养.
1.2.2　HG对 HL-60 细胞生长影响的形态学观察
将处于对数生长期的 HL-60 细胞以 5 ×104
个·mL-1浓度接种于培养瓶中 , 同时加入不同浓度
的 HG 母液 , 使培养液中 HG 的终浓度分别为 0 ,
10 ,20 , 30 ,40 ,50 μmo l·L-1 , 然后将培养瓶置于培
养箱中培养.分别在培养 24 , 48 , 72 h 后取出细胞
培养瓶 , 在倒置显微镜下观察拍照.
1.2.3　生长曲线法测定 HG 对 H L-60细胞增殖的
影响　将浓度为 5×104 个·mL-1细胞接种于 24孔
板中 , 每孔接种 1 mL , 每浓度设立 3个平行组 ,
接种的同时加入药物 , 培养液药物的终浓度分别为
0 , 10 ,20 ,30 ,40 ,50μmol·L-1 .将培养板置于培养
箱中培养 , 每隔 12 h , 取 0.05 mL 台盼蓝染液与
0.45 mL 细胞悬液充分混匀 , 染色 5 min后吸取适
量细胞悬液 , 注入血细胞计数板小室 , 对活细胞计
数 , 重复 3次 , 取平均值.以时间为横坐标(h),
细胞数为纵坐标(×104), 绘制生长曲线.
1.2.4　Hoechst33258 荧光染色法检测 HG 诱导
H L-60细胞凋亡　取 1×105 个·mL-1浓度的细胞
悬液 , 接种于 6孔板中 , 每孔 2 mL , 同时加入药
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西　北　师　范　大　学　学　报 (自然科学版)　　 第 45 卷　
Journal of Nor thw est Normal Unive rsity (Natural Science)　　 Vo l.45　
物 , 6个孔中药物的终浓度依次为 0 ,10 ,20 , 30 ,40 ,
50μmol·L-1 , 分别培养 24 ,48 ,72 h后取出 , 离心
收集(500 r·min-1), 用预冷的 PBS 洗 2 次 , 甲醇
固定 10 min , 再用预冷的 PBS 洗 3次 , 涂片晾干.
用 10-5 g·mL-1的 Hoechst33258在室温避光下染
色 10 min , 蒸馏水冲洗 3 次 , 晾干后 , 荧光显微
镜下观察并拍照(激发波长为 340 nm).
1.2.5　流式细胞仪检测 HG影响 H L-60细胞周期
及诱导细胞凋亡　将处于对数生长期的 HL-60 细
胞 , 以 5 ×104 个·mL-1接种于培养瓶中 , 培养
24 h后 , 加入药物 , 终浓度为 40 μmo l·L-1 .于
24 ,36 ,48 ,60 ,72 h分别收集细胞 , 于 4 ℃下 75%
乙醇中固定 24 h 以上 , 取出后 PBS 洗 2 遍.加入
PI(5×10-5 g·mL-1)在黑暗条件下染色30 min ,
用流式细胞仪进行细胞周期和凋亡分析.
1.2.6　DNA ladde r 电泳法检测 HG 诱导 HL-60
细胞凋亡　分别离心(800 r·min-1)收集 0 ,10 ,20 ,
30 ,40 ,50 μmol·L -1浓度 HG 处理的 HL-60 细胞 ,
用预冷的 PBS 洗 2 次 , 加入细胞裂解液(10
mmol·L-1 Tris-HCl , pH =8.0 , 10 mmol·L-1
EDTA , 0.5%的 T ri tonX-100), 于 50 ℃恒温水浴
锅中消化 2 h 后 , 取出离心(12 000 r·min-1), 取
上清液.在上清液中加入 5.0 μL 的 RNaseA(0.02
g·mL-1), 在 37 ℃下孵育 1 h后 , 加入5 μL的蛋
白酶 K(0.02 g·mL-1), 又在 37 ℃下孵育 1 h 后 ,
取出离心 10 min(12 000 r·min-1).上清液用 2.5
倍体积的异丙醇和 1/10 体积 0.5 mol·L-1的 NaCl
溶液沉淀 DNA , 于-20 ℃下 24 h 后取出 , 离心
10 min(12 000 r·min-1), 弃去上清液 , 沉淀用 TE
溶液(10 mmol·L-1 Tris-HCl , pH=8.0 , 1 mmol·L-1
EDTA)溶解.用 1.5%琼脂糖凝胶在 90 V 恒压下
电泳 2.5 h , EB 染色 , UVI 凝胶图像分析仪下检
测 , 并用自动成像系统拍照.
2　结果与讨论
2.1　HG对 HL-60细胞生长的影响
倒置显微镜下观察 HG 诱导 HL-60细胞形态
改变的结果如图 2所示.
A 0 μmo l·L-1 , 24 h;B 10 μmol·L -1 , 24 h;C 20 μmol·L -1 , 24 h;D 30 μmo l·L-1 , 24 h;E 40 μmol·L -1 , 24 h;
F 0μmo l·L-1 , 48 h;G 10 μmo l·L-1 , 48 h;H 20 μmo l·L-1 , 48 h;I 30 μmol·L-1 , 48 h;J 40 μmo l·L-1 , 48 h;
K 0 μmo l·L-1 , 72 h;L 10 μmol·L-1 , 72 h;M 20 μmo l·L-1 , 72 h;N 30 μmo l·L-1 , 72 h;O 40 μmol·L-1 , 72 h.
图 2　倒置显微镜下 HG 诱导 H L-60 细胞形态改变
F ig 2 Mo rpho lo gical change s o f H L-60 cells induced by HG under the inve rted micro scope
　　如图 2示 , 当浓度为 10 , 20 , 30 , 40 μmol·L-1
的 HG 作用于 H L-60 细胞 24 h 时 , 10 , 20 , 30
μmol·L-1的 HG 对细胞形态影响很小 , 与对照组
相比细胞形态正常 , 有小细胞团的形成 , 但细胞增
殖有逐渐降低的趋势;当 40 μmo l·L-1药物作用于
细胞时 , 细胞形态改变 , 体积缩小 , 细胞表面皱
缩 , 并可见明显的颗粒沉淀.当同样药物浓度作用
于细胞 48 h后 , 10μmol·L-1细胞形态正常 , 细胞
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　2009 年第 1 期 丁　兰等:常春藤皂苷元对人早幼粒白血病细胞 HL-60的增殖抑制 、周期阻滞及凋亡诱导作用
　2009　No.1 The effect o f HG on the prolifera tion inhibition , cell cycle a rrest and apopto sis o f H L-60 cells　
克隆形成细胞团 , 与对照组相比没有明显区别;但
当 20 ,30μmol·L-1 HG 处理时 , 细胞团明显变小 ,
细胞数变少 , 说明细胞生长受到明显抑制;
40 μmol·L-1使细胞形态完全改变 , 细胞数进一步
减少 , 细胞膜丧失完整性.当同样药物浓度作用于
细胞 72 h后 , 10μmol·L-1处理组的细胞除明显减
少外 , 细胞表面皱缩 , 细胞质内可见颗粒状物质;
20 ,30 ,40 μmo l·L -1处理组细胞大量死亡 , 并开始
解体 , 随浓度的升高 , 死亡和解体细胞增多.
不同浓度 HG 与 H L-60细胞共培养 , 取不同
培养时间的细胞 , 用台盼蓝排染法统计活细胞数 ,
绘制细胞生长曲线(图 3).HG 对HL-60细胞生长
的影响表现为低浓度抑制 , 高浓度致死 , 并呈浓度
和时间依赖性.在较低浓度条件下(10 ～ 40 μmo l·
L
-1), HG 对 HL-60细胞的影响表现为增殖抑制 ,
并且当药物浓度提高时 , 抑制作用加强;当浓度较
高(40 ～ 50 μmo l·L -1)时 , 药物对细胞有致死作
用 , 并随着处理时间加长其致死效应增强.
图 3　HG 作用下 H L-60 细胞生长曲线
F ig 3 G row th curve of HG treated HL-60 cells
2.2　Hoechst33258荧光染色法检测 HG诱导HL-60
细胞凋亡
荧光染料 Hoechst33258 可对细胞中 DNA 特
异性染色 , 紫外激发光下呈现蓝色荧光.如图 4所
示 , 对照组细胞(图 4-A 、E 、I)的细胞核蓝色荧光均
一 , 轮廓清晰;用 10 μmol·L-1的 HG 处理细胞
24 ,48 h后 , 处理组细胞与对照组细胞相比无明显
变化 , 细胞核染色均一 , 但药物处理 72 h 后细胞
变小 , 核染色均一;20 μmo l·L-1的药物处理 24 h
时的细胞与对照组细胞相比无明显变化 , 但处理
48 h时染色质发生凝聚 , 呈现出明亮的蓝色荧光
斑点 , 当该浓度条件下处理 72 h时 , 染色质凝聚
同时细胞体积比 24 h和 48 h 时的细胞体积明显缩
小;30μmol·L-1的药物处理 24 ～ 72 h 时的细胞与
对照组细胞相比其形态发生了明显变化 , 随处理时
间加长 , 染色质浓缩加剧 , 细胞体积变小 , 细胞轮
廓不清.
A 0 μmol·L-1 , 24 h;　B 10 μmol·L -1 , 24 h;
C 20 μmo l·L-1 , 24 h; D 30 μmo l·L-1 , 24 h;
E 0 μmol·L-1 , 48 h; F 10 μmol·L -1 , 48 h;
G 20 μmol·L-1 , 48 h; H 30 μmol·L-1 , 48 h;
I 0 μmol·L-1 , 72 h; J 10 μmol·L-1 , 72 h;
K 20 μmo l·L-1 , 72 h; L 30 μmol·L-1 , 72 h.
图 4　Hoechst33258荧光染色观察 HG 诱导
H L-60 细胞凋亡过程中染色质的变化
Fig 4 Chromatinic mo rpho lo gical changes o f H L-60 induced
by HG H oechst 33258 staining method
2.3　流式细胞仪检测 HG影响 HL-60 细胞周期及
诱导细胞凋亡
流式细胞仪可精确地检测细胞中 DNA 的含
量 , 统计周期中 G 1 期 、 S 期 、 G2 期 、 M 期以及亚
G 1 细胞的百分比 , 从而分析细胞周期及凋亡细胞.
从图 5可以看出 , 40 μmol·L-1的药物处理细
胞 24 h 后 , 培养细胞与对照细胞相比出现明显的
G 1 期阻滞.其中 , 细胞被处理 24 h 时 , G 1 期细
胞从 38%升至 56.3%;处理 36 h 时 , G 1 期细胞
升至 48.2%;处理 48 h 时 , G 1 期细胞升至
51.3%;处理 60 h时 , G1 期细胞升至 50.6%;处
理 72 h 时 , G 1 期细胞升至 63.8%.同时 , 随着
G 1 期阻滞时间的延长 , sub-G 1 期峰也伴随产生.
细胞被处理 36 h 时 , sub-G 1 期峰仅为 0.9%;处
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理 48 h 时 , sub-G 1 期峰为 4.2%;处理 60 h 时 ,
sub-G1 期峰升至 14.2%;处理 60 h时 , sub-G 1 期
峰达到 36.2%.由此我们认为 , 药物对癌细胞增
殖的抑制作用是由 G 1 期周期阻滞引起 , 而药物对
细胞的致死作用是由药物诱导癌细胞凋亡所致.
图 5　HG(40 μmol·L-1)对 H L-60 细胞周期分布的影响
Fig 5 Cell cycle distribution of HL-60 cells after incubation H G(40 μmol·L -1)
2.4　DNA ladder 电泳检测 HG诱导 HL-60 细胞
凋亡
细胞凋亡的主要生化特征是其染色质发生浓
缩 , 细胞内核酸酶激活使染色质 DNA 核小体单位
之间的连接处断裂 , 形成 180 ～ 200 bp的整倍数的
寡聚核苷酸片段 , 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图
谱(DNA ladder).由图 6-A 可以看出 , HG 处理
HL-60细胞 24 h后 , 10 μmo l·L-1和 20 μmo l·L-1
处理组细胞与对照组相同 , 未见有梯形条带出现 ,
只有极少降解的小片段 DNA ;30 μmol·L -1和
40 μmol·L-1的浓度处理组有大片段 DNA 降解条
带和较明显的 200 , 400 , 600 , 800 bp 的条带(其中
40 μmol·L-1梯形条带不很明晰 , 这可能受实验操
作影响所致), 这说明该浓度下部分细胞发生了凋
亡.HG 处理 HL-60 细胞 72 h 后(如图 6-B),
10 μmol·L-1处理组细胞的 DNA 电泳呈现了凋亡
细胞的典型特征 DNA ladder , 而 30 ,40 , 50 μmo l·
L
-1处理组细胞的 DNA 降解成小于 100 ～ 600 bp
的小片段 , 无明显梯形条带 , 这表明 10 μmol·L-1
处理组细胞在 72 h时 DNA 已开始降解.
A HG 处理 H L-60 细 胞 24 h 的 DNA ladder 电泳:
M Mark , 标准 DNA 分子量;1 对照;2 10 μmol·L-1 ;
3 20μmo l·L-1 ;4 30 μmol·L -1 ;5 40 μmol·L-1 ;
B HG 处理 H L-60 细胞 72 h 的 DNA ladde r 电 泳:
M Mark , 标准 DNA 分子量;1 对照;2 10 μmol·L-1 ;
3 20μmo l·L-1 ;4 30 μmo l·L-1 ;5 40 μmo l·L-1
图 6　HG 处理的 H L-60 细胞 DNA ladder 图
Fig 6 DNA ladder o f H L-60 cells treated with HG
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　2009　No.1 The effect o f HG on the prolifera tion inhibition , cell cycle a rrest and apopto sis o f H L-60 cells　
3　结论
常春藤皂苷元(HG)是异叶败酱植物中的一种
三萜类化合物.生长曲线及倒置显微镜观察表明 ,
HG 在一定浓度和处理时间下可抑制 HL-60 细胞
的生长 , 随着药物浓度增加和处理时间增长 , 药物
对 HL-60 细胞有致死作用.Hoechst33258荧光染
色和 DNA ladder电泳检测表明 , 低浓度 HG 处理
(10 μmo l·L-1)和较长的处理时间(72 h), 以及较
高浓度 HG 处理(40 μmo l·L-1)和较短的处理时间
(48 h)可引起 HL-60 细胞凋亡.流式细胞技术分
析表明 , HG 极有可能通过干扰 H L-60细胞周期
调控途径 , 导致 G1期细胞阻滞 , 抑制 HL-60 细
胞 , 并启动细胞凋亡程序致细胞死亡.Shao-Yin
Wei等[ 12]在对三萜类化合物 jaspo lide B的研究中
发现 , jaspolide B 引起的 G 1 期细胞阻滞很有可能
是药物破坏细胞微管所致.对于 HG 导致 G 1 期细
胞阻滞和诱导细胞凋亡的确切机制还有待于进一步
的研究.
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(责任编辑　孙晓玲)
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