全 文 ：第 28卷第 2期
2010年 6月
湖北民族学院学报(自然科学版)
JournalofHubeiUniversityforNationalities(NaturalScienceEdition)
Vol.28　No.2
Jun.2010
收稿日期:2010-04-01.
基金项目:国家民委科研项目(08HB06);湖北民族学院大学生素质拓展基地专业项目.
作者简介:张泽(1976-),男 ,主要从事药用植物资源保护与利用的研究;＊通讯作者:武芸(1971-),女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事植物资源保护
与利用的研究.
植物生长调节剂对五鹤续断组织培养的影响
张　泽1 ,武　芸 2
(1.湖北民族学院 附属医院 ,湖北 恩施 445000;
2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院),湖北 恩施 445000)
摘要:通过不同植物生长调节剂的组合和配比 , 对五鹤续断茎尖 、幼嫩茎段和叶进行愈伤组织的诱导 、丛生芽
分化和增值及生根培养 , 确定了五鹤续断组织培养的最佳培养基为:(1)初代培养基为 MS+6-BA1.5mg/L+NAA
0.1mg/L;(2)丛生芽培养基为 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.6mg/L;(3)生根培养基为 1/2MS+IBA0.4mg/L+
PP333 0.4mg/L.
关键词:五鹤续断;植物生长调节剂;组织培养
中图分类号:R282 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2010)02-0219-03
EffectofPlantGrowthRegulatoronTissueCultureofWu-HeDipsacusasper
ZHANGZe1 , WUYun2
(1.UniversityHospitalofHubeiUniversityforNationalities, Enshi445000, China;
2.KeyLaboratoryofBiologicResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince,
HubeiUniversityforNationalities, Enshi445000, China)
Abstract:Shoottipandtenderstemswhichsproutedatthebeginningofspringwereusedasexplantsto
studyefectofplantgrowthregulatorontisuecultureofWu-HeDipsacusasper.Theoptimalmediawere
(1)calusmedium, MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)clumpbudinductionmedium, MS+6-BA
2.0(mg/L)+NAA0.5(mg/L);(3)rootingmedium, 1/2MS+NAA(1.0mg/L)+PP333(0.4mg/L).
Keywords:Wu-HeDipsacusasper;plant-growthregulator;tissueculture
五鹤续断属于川续断科植物(Dipsacusasper),其药用部位为干燥根 ,是川续断中的优质品 [ 1] ,具有补肝
益肾 ,续接筋骨 ,抗骨质疏松 ,止血安胎等功效 ,临床上主要用于治疗腰膝酸软 ,跌打损伤 ,骨折 ,腰椎骨质增
生 ,先兆性流产和习惯性流产等症状 [ 2] .五鹤续断多糖 、总皂甙和总生物碱含量较高[ 3 ～ 5] ,其根的热水提取物
中存在着抗补体多糖和具免疫调节活性的高分子活性成分 [ 6] ,其提取物有促进骨损伤愈合作用的活性成
分 [ 7] ,续断中的总生物碱能显著抑制子宫平滑肌的自发收缩活动 ,因此 ,在临床上可用来治疗先兆性流产和
习惯性流产等症状[ 8] .五鹤续断愈伤组织的诱导已有研究 [ 9] ,但组织培养的研究国内外均未见报道.本研究
用茎尖及多种外植体为材料 ,旨在解决品种退化问题 ,保证道地药材的品质并为其扩大种植提供一条有效途
径 ,同时还为进一步采用生物技术进行多倍体诱导作好技术准备.
1　材料和方法
1.1　材料
本实验所用五鹤续断均来自生物资源保护与利用重点实验室(湖北民族学院)植物培养室.
湖北民族学院学报(自然科学版) 第 28卷
1.2　方法
1.2.1　外植体处理　挑选健壮的五鹤续断植株 ,取其茎尖 、幼嫩的茎和叶作为外植体 ,用洗洁精清洗干净
后 ,流水冲洗 2h,用滤纸吸去多余的水分 ,在超净工作台上用 75%的酒精中消毒 30s左右 ,用无菌水冲洗 3
遍 ,再转入 0.1%的升汞溶液中振荡消毒:茎尖 6min、茎 8min、叶 6min,无菌水冲洗 3次 ,然后置于无菌培养皿
中 ,切除药液接触过的伤口并剥去茎的外表皮 ,切成 0.5cm长的小段 ,叶切成 0.5cm见方的正方形 ,接种于
附加不同植物生长调节物质及其组合的 MS培养基上培养.所有 MS培养基中均添加 6.0g/L琼脂和 20g/L
蔗糖 , pH在灭菌前调至 6.0 ～ 6.1.培养条件均为温度 23 ～ 25℃、光照强度 40μmol·m-2·s-1、光照时间 12h/d.
1.2.2　初代培养　接种外植体的 MS培养基 ,附加不同植物生长调节物质及其组合 ,研究其对外植体愈伤
组织的诱导效应 ,从而筛选出诱导愈伤组织的最佳培养基.每个处理接种 10瓶 ,每瓶接种 4块外植体 , 30d
后计算出愈伤组织块数和诱导率[ 3] .诱导率 =形成愈伤组织的外植体块数 /接种外植体的块数 ×100%.
1.2.3　丛生芽诱导　用 NAA(0.1、0.3、0.5、0.7、1.0)mg/L和 6-BA(1.0、1.5、2.0)mg/L的不同配比 ,添
加到 MS基本培养基中 ,诱导丛生芽的产生.每个处理接种 40块生长比较一致的愈伤组织 ,培养 30d后测定
平均出芽数 [ 10] .
表 1　不同植物激素组合的诱导效应
Tab.1　Differentconcentrationsandcombinationsofplantgrowth
regulatorsefectedoncalusinductionofWu-HeDipsacusasper
组合因子/mg· L-1
诱导率 /%
6-BA(1.0)6-BA(1.5)6-BA(2.0)6-BA(3.0)
2, 4-D(1.0) 60.2++ 63.1++ 68.5+ 65.3 +
2, 4-D(1.5) 86.2++ 84.3++ 74.5++ 56.7
2, 4-D(2.0) 91.7+++ 86.3+++ 77.4+ 53.2 +NAA(0.1) 65.4++ 92.5++++ 85.1+++ 79.5 ++
NAA(0.3) 54.1++ 65.6++ 75.8++ 70.6 +
NAA(0.5) 39.9+ 60.1++ 31.7+ 28.4 +
　　　注:-:死亡 , +:生长势差 , ++:生长势一般 , +++:生长势较好, ++++:生长
　旺盛 ,以下同上.
1.2.4　生根培养　将高 2cm左右的芽苗剪下 ,转入到 1/2MS生根培养基中培养 ,培养基中附加激素(NAA
和多效唑)、6.0g/L琼脂和 20g/L蔗糖 , pH5.8.每个处理接种 30根芽苗 , 30d后测定平均生根数.
2　结果与讨论
2.1　不同植物生长调节物质组合的诱导效应
将外植体接种到 NAA+6-BA和 2, 4-D+6 -BA两种组合的 MS培养基中进行初代培养 ,结果表明
(见表 1), MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L和 MS+6-BA1.0mg/L+2, 4-D2.0mg/L的愈伤诱导效果
较好 ,其诱导率分别达到了 92.5%和 91.7%,但
愈伤组织在色泽 、质地和生长势方面均表现不同 ,
前者所得愈伤组织呈深绿色 、质地较好 ,生长较快 ,
适合于快速繁殖;后者诱导的愈伤呈黄绿色 ,质地
较硬 ,不利于快繁.因此 , MS+6 -BA1.5mg/L+
NAA0.1mg/L为初代培养的最佳培养基.
2.2　不同外植体的诱导效应
不同类型外植体诱导愈伤组织的效果不同:茎
尖 、幼嫩的茎段和叶作为外植体都能诱导出愈伤组
织 ,其诱导率分别为 76.67%、83.33%和 40.00%,其
中以茎尖和幼嫩的茎段诱导愈伤率较高 ,生长势好;叶诱导愈伤率较低 ,愈伤呈黄色泡状 ,继代后死掉了 ,不适于用
作快繁的外植体.茎尖培育的幼苗可达到脱毒效果 ,能有效防止品种退化 ,因此 ,茎尖是较理想的外植体.
2.3　光照的影响
用诱导愈伤组织的最优培养基 MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L进行继代培养.每瓶接种鲜重 1g
图 1　五鹤续断愈伤组织的增殖曲线
Fig.1　ThecalusgrowthcurveofWu-HeDipsacusasper
且色泽一致的愈伤组织 ,一部分置于光强为 40μmol· m-2· s-1 , 12h/d,温度为 25℃左右条件下培养;另一
部分置于暗培养箱中对照培养.每 3d取两种条件下
培养的愈伤组织称重 ,计算愈伤组织的鲜重 ,并重复
3次 ,取其平均值 ,其结果如图 1所示.
研究结果显示 ,其愈伤组织的生长可明显地分为
3个时期:延迟生长期(0 ～ 9d)、指数生长期(9 ～ 24
d)和静止(24 ～ 30d)期.愈伤组织在延迟期生长缓
慢 ,在指数生长期愈伤组织鲜重急剧增加 ,在静止期
愈伤组织鲜重增加几乎停止 ,由此可见愈伤组织在光
照下长势好 ,并且愈伤组织的颜色呈深绿色 ,结构较
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第 2期 张　泽等:植物生长调节剂对五鹤续断组织培养的影响
疏松;在暗培养中愈伤组织呈黄白色 ,长势较慢.
2.4　丛生芽诱导
用生长较一致的绿色愈伤组织为材料 ,用 6-BA和 NAA的不同质量分数诱导丛生芽产生 ,结果表明
(见表 2),培养基 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.6mg/L诱导丛生芽个数最高 ,芽苗生长健壮 ,因此 , MS+6-
BA2.0mg/L+NAA0.6mg/L为诱导丛生芽的最优培养基.
表 2　不同激素配比诱导丛生芽的效果(质量分数均为 mg/L)
Tab.2　Effectsofdifferenthormonecombination
oninductionofmultipleshoot
激素水平 平均出芽数
6-BA(1.0)6-BA(1.5)6-BA(2.0)6-BA(3.0)
NAA(0.2) 0.0 3.3 8.5 8.6
NAA(0.4) 2.8 9.8 12.3 12.1
NAA(0.6) 6.7 11.9 14.5 12.3
NAA(0.8) 4.0 7.7 9.8 4.5
NAA(1.0) 0 1.4 2.0 0
表 3　不同激素配比诱导生根的效果(质量分数均为 mg/L)
Tab.3　Effectsofdiferenthormonecombinationoninductionofroot
激素水平 平均生根数PP333(0.0) PP333(0.2) PP333(0.4) PP333(0.6)
IBA(0.2) 5.8 11.7 15.3 6.9
IBA(0.4) 9.5 16.4 20.9 14.1
IBA(0.6) 6.7 10.2 12.6 7.6
2.5　生根培养
用 IBA和多效唑(PP333)的不同质量分数来诱
导五鹤续断生根 ,结果表明 (见表 3):单独使用
IBA时可以诱导生根 ,以质量分数为 0.4mg/L时
最佳;在培养基中添加多效唑(PP333)后可促进生
根 ,使生根数大大增加 ,综合考虑因素 IBA和 PP333
的影响 ,诱导生根的最佳培养基为 1 /2MS+IBA0.
4mg/L+PP3330.4mg/L.
2.5　炼苗与移栽
将生根后的芽苗长到高 5 ～ 6cm、根长约 3cm
时开始炼苗.先打开培养瓶盖 ,置于室温散射光下 ,
补加适当的蒸馏水进行炼苗.炼苗 3 ～ 4d后取出
试管苗 ,洗去根部培养基 ,移栽入装有灭过菌的草
炭 +蛭石(2∶1)的花盆中 ,并适时浇以霍格兰营养
液 ,放入温室中培养 ,湿度保持 90%左右 ,三周后
移栽.移栽后每天至少两次喷洒适量水(土润湿为止),移栽后的小苗注意保湿 、遮荫和适当通风 ,小苗成活
率可达 85%以上.
3　结论
在五鹤续断组织培养过程中 ,以茎尖为外植体可避免内生菌的产生 ,是较理想的实验材料.茎尖产生的
愈伤组织分化较好 ,是防止品种退化的最有效途径.本研究确定了五鹤续断组织培养的最佳培养基为:
1)初代培养基 MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L;
2)丛生芽诱导培养基 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.6mg/L;
3)生根培养基 1/2MS+IBA0.4mg/L+PP333 0.4mg/L.
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