全 文 ：SEAP and contro l vec to r we re transiently transfec ted into HEK-
293 ce lls pretreated w ith 25 μm o l L -1 H2O2. SEAP activ ity
w as assayed after flavonol compounds trea tm en.t R esu lts　 In
the 25μmo l L- 1 H2O 2 pre trea ted HEK-293 ce ll ox idative dam-
age model, G enistin show ed the highe st antiox idant activ ity w ith
SEAP induc tion 1.3 tim es h igher than con tro l in 100μmo l L -1
g roup;K aemp fe ro l show ed the h ighest antiox idant activ ity w ith
SEAP induc tion 1.5 tim es higher than control in 25 μm o l L - 1
group. Conclusion　Th ism ode l can be used to de tectH2O2 ox-
idative stre ss re sponse and sc reen flavono l com pounds w ith high
antioxidan t activ ity.
Keyw ords:an tiox idant response e lemen t(ARE);reporte r gene;
drug sc reen ingm ode l;flavono l com pound
生物转化法从金盏菊提取物中制备叶黄素的研究
郑建新 1 ,邹登峰 2
(1.青海省妇女儿童医院药剂科 , 青海 西宁　810007;2.桂林医学院天然药物教研室 ,广西 桂林　541004)
中国图书分类号:R282. 71;R284. 1;R318. 2;R379
文献标识码:A 文章编号:1001 -1978(2006)12 - 1528 -04
摘要:目的　研究用生物转化法从金盏菊提取物中制备叶黄
素。方法　采用平板诱导培养基考察了糙皮侧耳 、黑曲酶 、
青霉对金盏菊提取物中叶黄素酯进行降解反应。 用青霉摇
瓶发酵转化叶黄素酯法制备叶黄素 ,考察了 pH值为 6.0、接
种量和发酵时间对转化效果的影响。结果　表明在酸性条
件有利于转化;接种量的增加会加快转化速度;叶黄素的浓
度在发酵时间为 12 ～ 24 h间出现最大值。结论　可以采用
生物转化法从金盏菊提取物中制备叶黄素。
关键词:金盏菊;叶黄素;生物转化
　　叶黄素属于 “类胡萝卜素”类物质 , 它是构成玉米 、蔬
菜 、水果 、花卉等植物色素的重要组分。洋甘蓝 、羽衣甘蓝 、
菠菜等深绿色叶菜以及金盏花等花卉中即含大量的叶黄素 ,
而南瓜 、桃子 、辣椒 、芒果 、柑桔中则含丰富的叶黄素酯。在
中草药中植物色素类分布很广 、主要有脂溶性色素与水溶性
色素两类。脂溶性色素主要为叶绿素 、叶黄素与胡萝卜素 、
三者常共存。 此外尚有藏红花素 、辣椒红素等 [ 1 ～ 2] 。据报
道 [ 3～ 4] ,叶黄素广泛存在于各类蔬菜 、水果和花卉中。
　　叶黄素独特的化学结构不仅决定了其颜色 ,也决定了其
物理化学性质。叶黄素分子有一条含 40个碳原子的长链 ,
其中有多个共扼双键 , 正是这些共扼双键使叶黄素具有鲜明
的颜色和抑制自由基的能力 [ 5～ 7] 。叶黄素的结构式见 F ig
1。叶黄素对光热都不稳定 ,极易降解 , 植物体中游离态叶黄
素含量非常低 [ 8 ～9] 。
　　目前叶黄素生产工艺为将金盏菊中叶黄素酯提取并在
碱性条件下皂化生成叶黄素 ,此时叶黄素极易分解 , 产品收
收稿日期:2006 - 05 - 08,修回日期:2006 - 08 - 12
基金项目:广西壮族自治区科技攻关项目 (N o 0235022-1B);广西壮
族自治区回国人员科技基金项目(No桂科回 0009004)
作者介绍:郑建新(1963 - ),男 ,主管药师 ,研究方向:天然药物有效
成分的分离与分析 , E-mai l:zdf1226@163. com
F ig 1　The structure of luten
率非常低 ,溶剂残留严重 , 整个生产工艺复杂 , 试剂量大 , 成
本难以控制。生物转化 (b io transform a tion)是利用生物体系
或其产生的酶对外源性化合物进行结构修饰的生物化学过
程 ,其本质为酶催化反应。生物转化反应具有选择性强 , 催
化效率高 ,反应条件温和 ,反应类型多 , 以及环境污染小等特
点。本文采用生物转化法从金盏菊提取物中制备叶黄素。
1　材料与方法
1. 1　试剂 、仪器和材料　金盏菊正己烷提取物由长沙华欣
科技有限公司提供;所用化学试剂均为分析纯 , 购自湖南师
范大学。W aters 600E液相色谱 , 美国W ate rs;K-2501紫外可
见检测器 ,德国 KNAUER;C-R6A色谱数据处理机;日本 Shi-
m adzu;PH S-3C型精密 pH计 ,上海雷磁仪器厂。
1. 2　微生物培养　青霉菌 、黑曲霉菌种由中南大学矿物工
程学院提供 , 糙皮侧耳菌种由湖南师范大学生命科学院提
供。
基础培养基:NH4NO 3:2. 0 g, K2H PO4:2.0 g, KH2PO4:
1.0 g, MgSO 4:0.2 g, CaC l2 2H2O:0. 14 g, NaC l:0. 2 g, 用水
定容至 1. 0 l后 , 以 HNO
3
调整 pH值为 7. 0。
普通固体培养基:162. 3 m l基本培养基 , 1.5 ～ 2.0 g琼
脂 ,于 70 ～ 80℃铺平板。
诱导产酶固体培养基:162.3 m l基本培养基 , 1. 5 ～ 2. 0
g琼脂 , 叶黄素粗提物 4.33 g,加入适量 T riton-100分散均匀
后 ,于 70 ～ 80℃铺平板。
诱导产酶液体培养基:162. 3 m l基本培养基 , 叶黄素粗
提物 4.33 g,加入适量 T riton-100分散均匀后。
1. 3　微生物转化方法
以诱导培养基铺平板后 , 分别接种青霉菌 、黑曲霉菌 、糙
皮侧耳菌孢子和糙皮侧耳菌 , 于 26℃恒温培养 72 h后取等
1528 中国药理学通报　ChinesePharmacolog ical Bulletin　2006 Dec;22(12):1528 ～ 31
质量培养基 , 以流动相溶解定容至 25 m l。进行 HPLC分析。
液体培养基接种青霉菌 , 于 26℃置于摇床上发酵 72 h
后 , 直接进行 HPLC分析。
结合实验室实际情况 ,选择青霉菌 、黑曲霉菌 、糙皮侧耳
菌作为筛选的候选菌种。
1. 4　RP-HPLC分析叶黄素和叶黄素酯类衍生物的色谱条
件　色谱柱 , Eu rospher-100 C
18
色谱柱 (3.9 mm ×300 mm,
4. 6μm);流动相 , 乙腈 -甲醇 -乙酸乙酯(45:10:45);流
速 , 1. 0 m l m in- 1;检测波长 , 454 nm;进样体积 , 10 μl。在
此条件下 , 定量分析叶黄素及叶黄素酯类衍生物通过进样量
对被测组分的峰面积作图 ,所得线性回归方程 Y =16.231+
11648X(mg L - 1), r=0.9999。加标回收率在 97% ～ 101%
之间满足测定要求。
1. 5　转化效果的评价方法
用 N L0表示转化开始时溶液中叶黄素物质的量 , NL t表示
转化结束时溶液中叶黄素物质的量 , NE0表示转化开始时溶
液中叶黄素酯类衍生物物质的量 , NE t表示转化结束时溶液
中叶黄素酯类衍生物物质的量 ,则转化率可表示为:
R=(NL t -NL0) /(NE0 -NE t)
　　在这里我们使用转化率 R作为转化效果的评价指标。
2　结果与讨论
2. 1　接种糙皮侧耳孢子的转化效果　接种糙皮侧耳孢子的
诱导产酶固体培养基并没有生长 ,而普通固体培养基的生长
非常好。叶黄素酯的加入抑制糙皮侧耳孢子在固体培养基
上的生长 , 因此叶黄素酯作为诱导剂 , 不能使糙皮侧耳孢子
在生长过程中不能够分泌能够将叶黄素酯转化为更小的分
子 , 使其能够将其作为碳源吸收。
2. 2　接种糙皮侧耳菌种的转化效果　在验证接种糙皮侧耳
孢子不能获得降解叶黄素酯的目标酶后 ,尝试了直接在诱导
产酶固体培养基接种糙皮侧耳菌种。接种 72 h后 , 以接种
点为中心出现三个界限明显区域(F ig 2), 颜色由外向内逐
渐变浅 , 在中心诱导产酶固体培养基叶黄素的颜色完全褪
去。结果表明接种糙皮侧耳菌种 ,能够在诱导产酶固体培养
基生长 , 并有确切降解叶黄素的能力。
　　为了考察叶黄素酯的降解产物 , 3个区域各取了 0.5 g
F ig 2　The bacteria inoculated O streatus ord inary so lid m ediun
培养基 , 用流动相萃取其中的残存叶黄素 , 膜过滤后 , 用
H PLC分析其化学成分 ,色谱图如 F ig 3 ～ 5。
F ig 3　Ex ternal l iquid chrom atography ex traction p lans
1. lu ten;2. lu tein 14-acid m onoesters;3. lu tein 16-acidm onoes-
ters;4. lutein 18-acid m onoesters;5. lu tein 14-acid d ies ters;6. lu tein
14-acid;7. lu tein 16-acid d iesters;8. lu tein 14-acid;9. lutein 16-acid
dies ters;10. Im pu rity
F ig 4　 Intermed ia te l iquid chrom a tography
extraction plans (1-lutein)
F ig 5　 Internal l iquid chrom a tography ex traction plans
2. 3　比较　比较 3个色谱图可以看出 ,外圈的叶黄素和叶
黄素酯的成份组成基本没有什么变化 , 中圈颜色变浅 , 色谱
图显示叶黄素酯基本转化为游离态的叶黄素;而在内圈颜色
变得非常浅 ,色谱图显示叶黄素含量已经非常低 , 而极性大
于叶黄素的物质大量出现。
1529 中国药理学通报　ChinesePharmacolog ica l Bulletin　2006 Dec;22(12)
　　试验结果表明 , 在糙皮侧耳菌种生长的过程中 , 能够释
放出胞外酶选择性降解叶黄素酯为游离态叶黄素 ,但一旦菌
种生长点周围叶黄素酯完全降解后 ,由于资源的缺乏 ,菌种
也会适应性地分泌能够降解游离态叶黄素为小分子的胞外
酶。
虽然接种糙皮侧耳菌种能够产生能选择性降解叶黄素
酯为游离态叶黄素的胞外酶 , 但由于不能进行大规模的液体
发酵试验 , 很难在实际生产中应用。为了工业生产的可行
性 , 我们对菌种进行筛选 , 以便找出能够直接接种孢子即可
生长并能够释放选择性转化叶黄素酯为游离态的叶黄素的
胞外酶。
2. 4　转化条件条件对转化效果影响
2. 4. 1　pH值对转化效果的影响　取 3份 100 m l含叶黄素
的培养基分别置于 250 m l药瓶中 ,分别以 HC l和 NH3 H2O
调节发酵液的 pH值为 6. 0, 7.0和 8. 0,在 26℃下置于摇床
上发酵 , 在 4、 8、12 h和 24 h取发酵液进行分析 , 考察不同
pH值下 , 叶黄素含量与转化时间的关系。
从 F ig 6可以看出酸性条件有利于转化 ,在碱性条件下 ,
转化不能进行。因为这个转化过程是通过细胞培养过程释
放出的酶对底物进行转化 , 而弱酸性条件有利霉的生长 , 使
得分泌胞外酶量增大;弱酸性条件也能促进酶的空间构型展
开 , 发挥其对叶黄素酯水解的催化作用。碱性条件下叶黄素
含量降低是因为叶黄素降解造成的。 pH值对转化效果的影
响体现在两个方面:对微生物生长的影响和对酶的反应的影
响。对微生物生长的影响 , 主要体现在引起细胞膜电荷变
化 , 以及影响营养物质的离子化 , 从而对微生物生长速度 , 同
时对微生物生长过程中释放酶的速度的影响;pH 值对酶的
影响主要体现在破坏酶的空间构型 ,使酶失活和通过改变反
应系统组成成分 , 主要改变酶的解离状态 ,底物的解离状态
及酶-底物复合物的解离 ,从而影响酶促反应的速度;除此以
外控制培养基的 pH值还能够改变各种不同酶间的比例 , 也
能起到诱导产酶的作用。因此在转化过程中必须对培养基
的 pH值进行适当的控制和调节。
F ig 6　pH on the content of Luten
2. 4. 2　接种量对转化效果的影响　接种量直接影响起始阶
段微生物生长速度和酶的释放速度 ,进而影响整个转化过程
动力学性质 , 而且微生物在过程中还能够根据生长的化学环
境变化 ,改变产酶体系 , 导致反应本质发生变化 , 对发酵液的
底物转化产物产生影响。
取 100 m l含叶黄素培养基 3份置于 250 m l药瓶中 , 分
别以 HC l调节 pH值为 6. 0, 分别接种 2、4、 6菌塞 , 置于摇床
上发酵 ,在 4、8、 12 h和 24 h取发酵液进行分析。考察接种
量对转化效果的影响。
从 F ig 7可以看出接种量在 4 ～ 12 h对转化速度影响较
大 ,而在 4 h前和 12 h后对转化速度的影响不大。这是因为
在反应开始发酵液中青霉产酶的浓度低 , 对叶黄素酯的转化
速度过慢 ,转化产物累计效果差别不大;而在 4 ～ 12 h间 ,酶
的浓度升高 ,催化作用增强 ,转化速度非常大 , 因而接种量的
影响比较明显;12 h后转化产物浓度增加对转化过程产生抑
制作用 ,降低了反应速度 ,产物累计变化差异不明显。
F ig 7　 Inoculum to change speed s
F ig 8　Lutein concentra tion and tim e into the relationsh ip
2. 4. 3　转化时间对叶黄素含量及浓度的影响　转化时间对
转化效果体现在两个方面 , 其一是随着反应时间的增长 , 微
生物种群不断扩大 , 产酶量也随之不断增长 , 从而促进了叶
黄素的量的累积;另外一方面是随着反应时间增长 , 叶黄素
在反应过程中因为外部化学和物理因素发生降解 , 造成叶黄
素含量的降低。
取 100 m l含叶黄素培养基一份置于 250 m l药瓶中 , 以
HC l调节 pH值为 6.0, 接种 2菌塞 , 置于摇床上发酵 , 在 4、
8、12、24 h和 48 h取发酵液进行分析。同时考查叶黄素含
量和叶黄素浓度与转化时间的关系。
1530 中国药理学通报　ChinesePharmacolog ica l Bulletin　2006 Dec;22(12)
　　叶黄素的含量随着发酵时间增长 , 到 12 ～ 24 h间出现
最大值 , 此后随着发酵时间增加反而会导致叶黄素浓度的降
低。比较叶黄素的生成和衰减速度 ,可以看出青霉对叶黄素
酯和叶黄素的降解具有选择性 , 对叶黄素降解能力较弱 , 而
对酯转化能力非常强。在转化基本完成后菌种没有继续将
叶黄素转化为极性更小的分子 ,这说明青霉在诱导以后具有
良好的遗传稳定性 , 在叶黄素酯转化完后未发生变异 ,使得
生成的叶黄素转化为更小分子。
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Preparation of lutein from the extraction ofMarigold flowers by b iotransformation
ZHENG Jian-xin1 , ZOU Deng-feng2
(1. Wom en s and Children sHospita l of Q ingha i, X in ing 810007, China;2. Guilin M edica l College, Guilin Guangxi　541004, China)
Abstrac t:A im　To study prepara tion of lute in from the extrac-
tion M a rigo ld flowe rs by b io transform a tion. M ethods　 Screen
bacterium fo r lutein esters b io transform ing by studying on the
bio transfo rm ation of lute in este rs by Penic illium on tabulate re-
vulsive cu lture medium. Po rule of and A spe rgillus nig er Penicil-
lium cou ld transfo rm lutein este rs into lute in, bu t b io transform a-
tion of Penic illium w as be tter than A sperg illus n ige r. Po rule o f
P leu ro tus ostreatus cou ld no t grow on revulsive culture m edium,
but P leuro tus ostrea tus cou ld grow on the cu ltu re medium and
transform ed lutein esters in to lu te in. Resea rch o f shaking flash
fe rmen ta tion o f Pen ic illium for trans-fo rm ing lute in este rs. When
pH is 6.0 , quantity o f incuba tion is 2 bacte ria plug s and fe r-
m entation time is 12 ～ 24 hou rs , the transform a tion is com pleted
and the con tent o f lu te in is 91. 6%(HPLC)。 Resu lt　P ro lon-
ging the transfo rm a tion tim e w ill improve the percen t of lutein
but the con tent o f lu tein decreased. Conc lu sion　 B iologica l
transrorm a tion can be used from ca lendula o fficinac is ex trac t
prepara tion.
Keyw ords:marigo ld f low ers;lute in;bio transfo rmation
◇消　　息◇
《中国药理学通报》理事会 (筹 )
理事长
　　徐叔云　原中国药理学会副理事长、原安徽医科大学校长 、原安
徽省科协主席 、中国药理学会临床药理专业委员会主
任委员
副理事长
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　　余细勇　广东省人民医院医学研究中心主任
常务理事
　　张银娣　南京医科大学教授
　　陈禹九　湖北咸宁学院院长 、教授
理　事
　　陈季强　浙江大学国家食品药品监督管理局 、浙江呼吸药物研
究实验室副主任 、教授
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　　郭次仪　苏州中药研究所董事长 、教授
　　杨宝峰　哈尔滨医科大学校长 、教授
　　黄燮南　遵义医学院院长 、教授
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　　宋海波　山东省医药工业研究所副所长
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临床前研究重点实验室主任
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　　郭建生　湖南中医学院药学院副院长
　　王喜军　黑龙江中医药大学副校长 、教授
　　王乃平　广西中医学院院长 、教授
　　王敏伟　沈阳药科大学药理教研室主任 、教授
　　吴基良　湖北咸宁医学院副院长 、教授
　　黄　武　成都泰盟科技有限公司总经理
1531 中国药理学通报　ChinesePharmacolog ica l Bulletin　2006 Dec;22(12)