全 文 ：第 2卷 第 4 期 上 海 医 科 大 学 学 报 V o l . 2 2, N o . 4
1 99 5 年 7 月 A G r A A C A D E M I A E M E D I C I N A E S H A N e H A I J u l . 1例冷
掌叶半夏凝集素 A 的分离纯化及分析
孙光星份 丁声颂料 钱瑶君
(上海医科大学基础 医学院化学教研室 )
提要 首次从中草药掌叶半 夏 ( p : , 11` a p e d。 ,` se e如 S o h o优 ) 中通 过 Se p h a d e x 于工的 分
子筛层析 、 D E一 32 离子交换层析和制备电泳分离纯化出一种对兔红血球有血凝活性的凝集氟
称之 为掌叶半 夏凝 集素 A (p i , 21` a p e击 a` s o e云。 l e e: i n 人 , p p L尸人 ) 。 在 p 人。 E 、 s D~
p A G E 和等 电聚焦电泳上 P P卜 A 均显示出一条蛋白质着色 带。 经 S D斗 p人 G E 测 定 其 叮 r
为 16 . 3 又 10 ” , 用等电聚焦电泳测得其等电点为 5 . 8 , 经 D N S一 l分析法分析其氨基末端为丙氨
酸。 对所含的 18 种氨基酸作了定量分析 。 通过 oS ih 丘 试剂电泳染色法鉴定 P P L 一 A 为糖 蛋
白 , 用酶标凝集素结合法分析了糖链的结构 , 糖链部分含有甘露糖 ,岩藻糖和 乙酞氮基葡萄搪 。
关键词 掌叶半夏 ; 凝集素 : 纯化; 分析
掌叶半夏系天南星科半夏属植物掌叶半夏 ( p `en 乙咖 罗da “ s。 扬 cS h时幻的块茎 。 本
校妇产科医院等通过动物实验和临床应用发现掌叶半夏对子宫颈癌具有治疗作用 〔1 。 后
来研究又发现掌叶半夏的总蛋白成份对小 鼠肉瘤 S一 180 瘤株具有明显的抑制作用肉。 在
进一步寻找其有效成份的过程中 , 我们通过几种不同的分离纯化方法 , 得到一个单一的搪
蛋白成份 。 通过凝血试验发现它是一种植物凝集素 , 称之为掌叶半夏凝集素 A (凡二威`。
护de at ise ct “ l e 板 n A , P -L A )
。 我们对它的部分性质作了研究。
材料和方法
材抖 新鲜掌叶半夏购自河南许昌地区 ; 新鲜兔血由本校动物部提供 ; eS p h ad ex G一
10 为 hP a lrn ac ia 公司产品 ; D E e 3 2 纤维素为 为7 h a恤 a n 公司产品 ; 测分子量所用的 5
种标准蛋白质和 P H 3 . 5~ 10 载体两性 电解质 a m p h ol ln 。 购自上海生化所东风试剂公司 ;
辣根过氧化物酶 ( H R P ) 标记的 4 种凝集素即刀豆凝集素 ( o o n A 一H R P ) 、 麦胚凝 集 素
(WG A
一 H R功 、 红豆凝集素 ( E P H A 一H R P ) 、 小扁豆凝集素 ( L O A 一H R P )和 2 , 2’ 一连氮一
双〔-3 乙基苯并煌哇〕一 6 一磺酸盐 (A B T )S 由本校基础医学院生化教研室邵明川教授提供 ;
标准氨基酸购 自 B D H 公司 ; 其他试剂为国产分析纯 。
掌叶半夏总蛋 白的提取 同前文闭 。
P P L 一 A 的 分离纯化 将掌叶半夏总蛋白先径 eS p h ad ex G 一 1o 层析 柱 ( 2 . 2 o m 义 5 0
c m )
, 洗脱液为 H Z O , 流速每小时 20 iln 。 将洗脱下的第一峰上 D E 一32 离子交换柱 ( 1 . 5
e m X 3 2
e
m )
, 洗脱液为含 0 . 2 5 m o l / L N a C I 、 0 . o Zm o l / L 的 P B S , P H S . 0 、 流速 ZO m l / h 。
取第一峰透析 、 浓缩 、 冰冻干燥 , 产物进行制备电泳 。
纯度 鉴 定 用 P A G E 和 S D S一 r A G E 法 83t 。
分子量测 定 按 S D S一P A G E 法进行 。 标准蛋白质为磷酸化酶 B (触 只 1 0 3 ) , 牛血清
白蛋 白 (67 x 1 0 3 ) , 肌动蛋白 牲3 只 1 05) , 碳酸醉酶 (30 又 1 0 5) , 烟草花叶病毒外壳蛋 自
. 硕士研究生 , 现在徐州 医学院化学教研室 ;二 导师
第 2卷 第 4期 上 海 医 科 大 学 学 报 V o l . 22, N o . 4
1 99 5 年 7 月 A G r A A C A D E M I A E M E D I C I N A E S H A N e H A I J u l . 1例冷
掌叶半夏凝集素 A 的分离纯化及分析
孙光星份 丁声颂料 钱瑶君
(上海医科大学基础 医学院化学教研室 )
提要 首次从中草药掌叶半 夏 ( p : , 11` a p e d。 ,` se e如 S o h o优 ) 中通 过 Se p h a d e x 于工的 分
子筛层析 、 D E一 32 离子交换层析和制备电泳分离纯化出一种对兔红血球有血凝活性的凝集氟
称之 为掌叶半 夏凝 集素 A (p i , 21` a p e击 a` s o e云。 l e e: i n 人 , p p L尸人 ) 。 在 p 人。 E 、 s D~
p A G E 和等 电聚焦电泳上 P P卜 A 均显示出一条蛋白质着色 带。 经 S D斗 p人 G E 测 定 其 叮 r
为 16 . 3 又 10 ” , 用等电聚焦电泳测得其等电点为 5 . 8 , 经 D N S一 l分析法分析其氨基末端为丙氨
酸。 对所含的 18 种氨基酸作了定量分析 。 通过 oS ih 丘 试剂电泳染色法鉴定 P P L 一 A 为糖 蛋
白 , 用酶标凝集素结合法分析了糖链的结构 , 糖链部分含有甘露糖 ,岩藻糖和 乙酞氮基葡萄搪 。
关键词 掌叶半夏 ; 凝集素 : 纯化; 分析
掌叶半夏系天南星科半夏属植物掌叶半夏 ( p `en 乙咖 罗da “ s。 扬 cS h时幻的块茎 。 本
校妇产科医院等通过动物实验和临床应用发现掌叶半夏对子宫颈癌具有治疗作用 〔1 。 后
来研究又发现掌叶半夏的总蛋白成份对小 鼠肉瘤 S一 180 瘤株具有明显的抑制作用肉。 在
进一步寻找其有效成份的过程中 , 我们通过几种不同的分离纯化方法 , 得到一个单一的搪
蛋白成份 。 通过凝血试验发现它是一种植物凝集素 , 称之为掌叶半夏凝集素 A (凡二威`。
护de at ise ct “ l e 板 n A , P -L A )
。 我们对它的部分性质作了研究。
材料和方法
材抖 新鲜掌叶半夏购自河南许昌地区 ; 新鲜兔血由本校动物部提供 ; eS p h ad ex G一
10 为 hP a lrn ac ia 公司产品 ; D E e 3 2 纤维素为 为7 h a恤 a n 公司产品 ; 测分子量所用的 5
种标准蛋白质和 P H 3 . 5~ 10 载体两性 电解质 a m p h ol ln 。 购自上海生化所东风试剂公司 ;
辣根过氧化物酶 ( H R P ) 标记的 4 种凝集素即刀豆凝集素 ( o o n A 一H R P ) 、 麦胚凝 集 素
(WG A
一 H R功 、 红豆凝集素 ( E P H A 一H R P ) 、 小扁豆凝集素 ( L O A 一H R P )和 2 , 2’ 一连氮一
双〔-3 乙基苯并煌哇〕一 6 一磺酸盐 (A B T )S 由本校基础医学院生化教研室邵明川教授提供 ;
标准氨基酸购 自 B D H 公司 ; 其他试剂为国产分析纯 。
掌叶半夏总蛋 白的提取 同前文闭 。
P P L 一 A 的 分离纯化 将掌叶半夏总蛋白先径 eS p h ad ex G 一 1o 层析 柱 ( 2 . 2 o m 义 5 0
c m )
, 洗脱液为 H Z O , 流速每小时 20 iln 。 将洗脱下的第一峰上 D E 一32 离子交换柱 ( 1 . 5
e m X 3 2
e
m )
, 洗脱液为含 0 . 2 5 m o l / L N a C I 、 0 . o Zm o l / L 的 P B S , P H S . 0 、 流速 ZO m l / h 。
取第一峰透析 、 浓缩 、 冰冻干燥 , 产物进行制备电泳 。
纯度 鉴 定 用 P A G E 和 S D S一 r A G E 法 83t 。
分子量测 定 按 S D S一P A G E 法进行 。 标准蛋白质为磷酸化酶 B (触 只 1 0 3 ) , 牛血清
白蛋 白 (67 x 1 0 3 ) , 肌动蛋白 牲3 只 1 05) , 碳酸醉酶 (30 又 1 0 5) , 烟草花叶病毒外壳蛋 自
. 硕士研究生 , 现在徐州 医学院化学教研室 ;二 导师
4 期 脑急性缺血期鞘塘脂糖基转移酶的变化 3 0 1
表 ! PP L一 A 的氮基酸组成
氨基酸 ”鬓瓤霍翼 } 氨基酸 暮鑫“ 1~ 器霭缪天冬氨酸 1 0 . 6
{
丙氨酸 7 · `
}
。 氨酸 1· 8
苏氨酸 3 . 8 } 半胧氨酸 1.0 } 苯丙氨酸 “
·了
丝氨酸 4 . 3 1 撷氨酸 5.8 } 组氨酸 1 .0谷氨酸 9 . 0 】 甲硫 氨酸 ” .4 1 赖氨酸 “ .2脯氨酸 4. 9 } 异亮 氨酸 ” .8 】 精骊酸 ” ·。甘氨酸 9 . 1 ! 亮 氨酸 7 . 2 ! 色氨酸 1.1
天冬氨酸
表 2 尸P L一 A 的糖链结构分析
酶标凝集素 反应颜色 与凝集素结合的搪链结构
C o n A 一 H R P
习叮 e A 一 H R P
L OA 一H R P
GN 一M 。 N一M / M es司 3N es G N -
E P H A 一H R P 无色
M : M
a
n 。阳 , 甘露搪 ; F : 孔 c ose , 岩藻搪 ; GN : N一 a oe 七yl gl uc os a m i en , N 一乙酞氨基葡萄搪
含有由甘露糖组成的单聚糖和复合聚糖 , 这些复合聚糖含有插入型的 乙酞氨基葡萄搪和
岩藻糖。 据报道有些植物糖蛋白中的聚糖具有这种结构特征 s3[ , 与本实验结果此一致 。
血凝活性浏 定 即L 一 A 对兔红血球有凝集作用最低凝集浓度为 20 m g/ L ; 10 m g / L
时则凝集反应呈阴性。
讨论
夭南星科半夏属共有 3 种植物 : 半夏 ( P 艺二叮乙化 et 。 时。 B : ie )t 、 掌叶半夏和滴水珠 。上
海生物化学研究所陶宗晋等曾从半夏中分离出半夏蛋 白 , 该蛋白是一种植物凝集素 , 并具
有抗早孕作用〔们 。 掌叶半夏在临床上具有治疗子宫颈癌的作用 , 其总蛋 白成份对小 鼠 S -
180 瘤株具有明显的抑制作用 。 为了寻找其有效成份 , 在分离总蛋 白的过程中 , 我们使用
了不同的分子筛层析和离子交换层析 , 但都没有得到单一的成份 。 电泳分析表明总蛋白
中含有一组性质相似的蛋白质 。 由于 P A G E 是最有效的分离方法 , 所以最终用制备电泳
得到了一种成份单一的糖蛋白。 经 P A G E 、 S D S 一 P A G E 、 等电聚胶电泳和 N 一末端分析都
显示了该蛋白的高纯度 。 将该蛋白称之为掌叶半夏凝集素 A 是考虑到今后 有 可 能从 掌
叶半夏中分离出凝集素 B 、 0 等。
由于凝集素能与糖专一性结合 , 所以将酶连接到凝集素上 , 对糖蛋白中糖链部分进行
分析是一种方便 、 快速 、 灵敏的方法 。 我们用这种方法初步分析了 P P L 一 A 的搪链 结构。
该方法 已用于某些疾病患者血清中搪蛋白某种糖链结构数量变化的分析 。
据报道有的凝集素能抑制肿瘤细胞的生长 1t 01 , 而从中分离出 P P I厂 A 的掌叶半夏总
30 2 上 海 医 科 大 学 学 报 2 2 卷
蛋白具有抑瘤活性 , 所以 r 卫L 一 A 是否也具有抑瘤活性 以及 P P -L A 的其他生物学性质有
待作进一步的研究 。
致谢 本校基础医学院生化教研室邵明川教授对本研究中塘链结构分析部分给予了热情指导 , 并提供了珍贵的
试剂 ; 丁昌荣教授指导血凝实验。
参 考 文 献
1 上海第一医学院妇产科医院 、 化学教研组 : 掌叶半夏治疗子宫颈癌的研究。 上海 医学 1 9 78 L 13
2 孙光星等: 掌叶半夏总蛋白的提取 、 化学分析和对小鼠 日以 8 0 瘤株的抑制作用 。 上海 医科大学学报 1 9 92 1. : 17
3 L ae m m li U K : C le a v a g e o f 鱿 r u et u ar l P r o怕 i朋 d u ir n g th e a s se m b l y o f h o ad o f b a c et r io Ph a g e T . N a 才“ 尹沙
1 9 7 0 盯7 ; 68 0
` 袁玉荪等 : 生物化学实验 。 第 1 版 , 北京 :人民教育出版社 , 1 9 79 , 68
5 张龙翔等: 生化实验方法和技术。 北京 : 高等教育出版社 , 第 1版 , 1 9 81 , 62
7 oR be rt M
, e t a l : G l y co P r o t e i n a at i n in g f o l l o w i n g e 1e ot r o Ph o r e s i s o n a cr y l
a面 d e g e ls . A朋乙刀众招加 ,
1 9 6 9 3 0二 1 4 8
7 孙 册等: 凝集素。 第 1版 , 北京 :科学出版社 , 1 9 86 , 20
名 Y e t M G , e t a l : E血幽 o f 比 e P or et i n m a t r ix o n g l y ca n P or ce s i n g i n g l yC o Por t e i ns . 望加 尸口 J . 西 J 1 9 8 8
2 : 2 2
9 陶宗晋等 : 半夏蛋白的分离、 结晶、 生物活力和一些化学性质 。 生物 化学与生 物物理学报 1 9 81 1:5 17
10 彭金荣等 : 鼠李糖专一的蓖麻蚕血浴巴凝集素的分离纯化及性质研究 。 生物化学与生 物物理学报 1 9 9 1 2 3 : 3U
(收稿日期 : 1 9 4一 or 一 0匀
P U R I F I C A T I O N A N D C H A R A C T E R I Z A T I O N O F
尸刀妊法 L L A P E D A 不巧旧C T A L E C T I N A
S u n G u a n g劝 n g , D i n g S h e n g o o n g , Q i a n Y a o ju n
(刀即 a灯~
t of G为e , 初艺犷夕 , 召e为co 不of B a廊 万ed 公e a 乙S e蜘 e es , 8加几切她`肛 ed 落e a Z U 耐 v盯 s `t y , S加 , 夕加介
A n o v e l l e e t i n
,
w h i c h w a s n a m
e d P `二 e乙乙`。 夕e d a 公` s e。名a l e e七i n A ( P P L 一 A ) , w a s
p u r i if e d f r o m 七il e s加m t u b e r o f P 艺彻乙乙坛。 夕e面 t坛s e e t o S e h o七七 b y e h or m a 七o g r a p h y o n
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a d e x G一 1 0 0 a n d D E 一 3 2 e e l l u l o s e a n d P加 aP ar t i v e e l e e t or 恤 o er 。油 . P P L 一 A
s h o w e d a s i n g l e b a n d o n d i s e OP l y
a e r y l a m id e g e l e l e o otr p h
o r e s i。 , S D S一 r A G E a n d
i ; o e l e e t ir e f o e u s i n g
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T h e m o l e e u l a r w e i g h七 o f P P -L A w a s e s t im a 加 d t o b e 1 6
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I七5 i s o e l e e t r i e P o i n 七 15 5 . 8 . T h e N 一 et r m i n a l a m i n o a e i d 15 a l a n i n 。
P P L 一A 15 a g l y e o P r o et i n c o n 七a i n i n g m a n n o s e , f u e o s e , N 一 a e e t y l g l u e o s a m i d e a n d
1 8 a m i n o a e i d s a n d 15 r i e h i n a 日p a rt i c a e i d a n d g l y e i n e
.
T he
s t r u e七u r e o f 七h e s u g a r
e h a i n s i n 右加 zn o lec 记 a r o f P P L 一 A w a s a n a l y s e d 勿 h o r s e ar d i s h 详 r o x i d a阳 e o n ju g a -
t i l i g 4 d i任e , 川 l e e七i n s , L O A , W G A , o o n A , a n d E P H A . P P-L A e hx i b i七。 a h e m a于
g l u 桩n a t i n g a e七i v i t y t o r a b b i七 e r y七h r o e y加。 a t 七h e e o n ce n t ar 七i o n o f 2 0 m g / L .
K E Y W O丑 D S 乃肥忍z` 。 脚面`俪。沁 S e h o t t; l e o t in ; P团五. a t i o n ; e h a r朗七e r i么 a ` i血