全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 March 2009, 28(2): 261-267

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：国家自然科学基金重大国际（地区）合作研究项目（No. 30710103907）；哈尔滨市青年科学基金（No. 2002AFQXJ006）
*Corresponding author. E-mail: peikequan@ibcas.ac.cn
收稿日期: 2008-04-24, 接受日期: 2008-10-07

法国蜜环菌ISSR-PCR 反应体系的优化
孙立夫 1,2 张艳华 1 裴克全 2* 杨国亭 3 宋玉双 4 秦国夫 4 宋瑞清 3
1绍兴文理学院生命科学学院 绍兴 312000
2中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室 北京 100093
3东北林业大学林学院 哈尔滨 150040
4国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 110034



摘 要：本文用单因子试验分析了基于 ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子标记研究法国蜜环菌系统发生学的 PCR
（Polymerase Chain Reaction）扩增反应条件，并进行了引物筛选，同时对各个引物的退火温度以及甲酰胺对扩增效果的影
响进行了讨论。为利用 ISSR 标记技术研究蜜环菌生物种的系统发生学、遗传多样性及种质资源提供了参考。
关键词：分子标记，引物，退火温度，甲酰胺

Optimization of inter-simple sequence repeat PCR
(ISSR-PCR) reaction system for Armillaria gallica
SUN Li-Fu1, 2 ZHANG Yan-Hua1 PEI Ke-Quan2* YANG Guo-Ting3 SONG Yu-Shuang4 QIN Guo-Fu4
SONG Rui-Qing3
1Life Science Faculty, Shaoxing College of Arts and Sciences, Shaoxing 312000, China
2State Key Laboratory of Vegetation and Environmental Change, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
3School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
4Forest Diseases and Insect Pests Prevention and Cure General Station of Chinese State Forestry Department, Shenyang 110034, China
Abstract: The reaction conditions and primers of Armillaria gallica phylogeny analysis based on ISSR-PCR were studied. The
annealing point of every primer and the influence of formamide were analyzed especially. The result provided a consult for studying
on phylogenesis, genetic diversity and germplasm resource of Armillaria biological species.
Key words: molecule marker, primer, annealing point, formamide



DOI:10.13346/j.mycosystema.2009.02.018
262 Mycosystema

蜜环菌属 Armillaria (Fr.: Fr.) Staude 是担子菌亚
门中一个经济价值很高的属。它既是优良的药用和
食用真菌，也是寄主范围广，致病能力强，世界性
分布的重要病原菌（秦国夫 2001）。法国蜜环菌 A.
gallica Marxm. & Romagn.是蜜环菌属中一个在中
国乃至北半球分布相对广泛的生物种（孙立夫等
2007a, b），在土壤中能产生发达的网状菌索，主营
腐生或弱寄生生活；它还是天麻的优良共生菌（Cha
& Igarashi 1995；Sung et al. 1995；Kim 1997），而
不同的蜜环菌生物种对天麻生长的影响是较大的
（赵俊和赵杰 2007），因此，利用分子标记对不同
种质资源的蜜环菌进行快速鉴定，以及对蜜环菌属
进行系统发育学和遗传多样性的研究，是现代蜜环
菌生物种研究的热点之一。分子标记也是对基于互
交不育群概念鉴定蜜环菌生物种方法的重要补充
（Coetzee et al. 2000a, b）。
ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats，缩写为
ISSR）标记是Zietkiewicz et al.（1994）首次使用的
一种分子标记技术。它是利用加锚的微卫星寡核苷
酸作引物，对基因组节段进行扩增的，在SSR的5′
端或3′端加上2－4个随机选择的核苷酸，便可引起
特定位点退火（黎裕等 1999；邹喻苹等 2001）。
ISSR通常为显性标记，呈Mendel式遗传，有很好的
稳定性和多态性，经济高效，是近年来非常理想的
分子标记之一（王伟继和孔杰 2002；Lefrancois et al.
2002）。目前，蜜环菌系统发育研究中ISSR标记的
使用还不多（孙立夫等 2003），本文通过单因子分
析实验，优化了蜜环菌ISSR-PCR扩增反应条件，筛
选出合适的引物，为进一步利用ISSR标记研究蜜环
菌生物种提供了参考。
1 材料与方法
1.1 引物的设计与合成
引物设计是基于开花植物 SSR 基序（Wolfe et
al. 1998a, b; Wolfe & Liston 1998）和美国俄亥俄州
生 物 科 学 网 站 （ http://www.biosci.ohiostate.edu/
~awolfe/ISSR/ISSR.html）上所推荐的序列，由上海
生工（Shenggong Inc. Shanghai, China）合成的。此
外，还参考了秦国夫等（2001）以及秦国夫和 Hantula
（2002）所用的 2 个引物，共 16 个引物（表 1）。
表1 法国蜜环菌ISSR-PCR备选引物及其退火温度
Table 1 ISSR-PCR optional primers and their annealing point for
Armillaria gallica
引物编号
Primer No.
序列
Sequence
退火温度
Annealing
point
1#(814) (CT)8TG 54℃
2#(844) (CG)8RC 72℃
3#(M1) CAA(GA)5 38℃
4#(855) (AC)8YT 44℃
5#(AW3) (GT)5RG 44℃
6#(17898) (CA)6RY 42℃
7#(17899) (CA)6RG 44℃
8#(17901) (GT)6YR 42℃
9#(MAO) (CTC)4RC 48℃
10#(HB15) (GTG)3GC 38℃
11#(GUO) BDB(ACA)5 49℃
12#(GAAA) G/T/C G/T/C G/T/C(GAAA)3GAA 43℃
13#(857) (CA)8YG 54℃
14#(MANNY) (CAC)4RC 60℃
15#(TCG) XDH(TCG)5 61℃
16#(CGA) DHB(CGA)5 61℃
Note: D: A/G/T; B: C/G/T; Y: C/G; R: A/T; H: A/T/C; X: A/C/G.
1.2 扩增反应体系各组分浓度的确定
参考中国科学院植物研究所分子实验室有关
反应体系配制 PCR 混合液。在灭菌离心管中先加
ddH2O，然后逐步加入 dNTPs、MgCl2、缓冲液、
引物，再加 Taq 聚合酶，最后加 DNA 模板，使之
与底液充分混匀。整个过程于冰上操作。扩增体系
为 25µL，参考盛岩等（2004）的研究，各反应物浓
度 分 别 设 定 为 ： MgCl2 1.5mmol/L ， dNTPs
0.2mmol/L，引物 1.25mol/L，Taq 聚合酶 1.25U
（Promega），1× Taq buffer；DNA 模板浓度的确定
见本文 1.3。
1.3 DNA 模板浓度的确定
从法国蜜环菌单孢菌丝中提取总 DNA。根据总
DNA 电泳图谱中主带亮度，选择亮度最大（编号
g27）和最小（编号 u40）各 1 个模板，这两个模板
的总 DNA 原液浓度约为 58.2µg/µL 和 1.1µg/µL，并
分别将其稀释为原液浓度的 1/10、1/50、1/100 和
1/200，加上原液共 2 × 5 = 10 个模板。每个反应体
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系中加 1µL 模板 DNA，用 11#引物（表 1）进行 PCR
扩增以确定 DNA 模板浓度。反应程序为：95℃预
变性3min；进入循环，94℃变性30s，49℃退火1min，
72℃延伸 2min，37 个循环；最后 72℃延长 10min；
4℃保存。取 8µL 产物用 2.0%琼脂糖进行电泳检测，
然后用 Alpha Ease FC 成像系统照相，Labworks 4.0
分析电泳带，条带的分子大小用 200bp DNA ladder
Marker（Life Technologies, Gibco）估测。
1.4 PCR 反应程序与退火温度的测定
参考本文 1.3 的反应程序，将 PCR 反应程序调
整为：95℃预变性 3min；进入循环，94℃变性 30s，
50℃退火 1min，72℃延伸 2min，35 个循环；最后
72℃延长 10min；4℃保存。根据 DNA 模板浓度测
定的结果，选择 DNA 模板中主带亮度最大（编号
g27）的 1/100 稀释液（浓度约为 582ng/µL）作为
加入 DNA 模板时的参考浓度，用 1－14#引物分别
进行扩增。根据一些研究者（Zietkiewicz et al. 1994；
邹喻苹等 2001）的方法，在运行 ISSR-PCR 时，不
论引物如何，均采用 50－52℃的退火温度得到较好
的扩增结果的结论，将 PCR 反应的退火温度统一设
定为 50℃。扩增产物用琼脂糖进行电泳检测。
1.5 PCR 反应程序与退火温度的调整
参考秦国夫和 Hantula（2002）有关蜜环菌狭义
种研究中的 PCR 反应程序，选择 6#引物（退火温
度为 42℃），将 PCR仪调到温度梯度模式进行扩增，
在 40－60℃之间设定 10 个梯度（PCR 仪自动给出
10 个温度梯度：40.5℃、41.5℃、43.5℃、45.5℃、
48.4℃、51.7℃、54.6℃、56.8℃、58.4℃、59.6℃），
以判断 6#引物的适宜退火温度；再选择 8#引物，
对随机选择的 5 个模板按所提供的退火温度（42℃）
进行 PCR 扩增，以判断所提供的退火温度对不同模
板的适用性和通用性。反应程序调整为：95℃预变
性 10min；进入循环，94℃变性 30s，40－60℃间
10 个温度梯度中的某一温度退火 1min，72℃延伸
2min，35 个循环；最后 72℃延长 10min；4℃保存。
根据电泳检测结果调整 PCR 反应程序和退火温度。
1.6 甲酰胺（formamide）对 PCR 反应的影响
王伟继和孔杰（2002）用 ISSR 研究对虾时认
为，PCR 反应体系中加入适当浓度的甲酰胺可有效
提高 PCR 反应的稳定性和产物的特异性。本研究也
进行了这方面的测定，在 5 个相同 PCR 反应体系中
分别加入甲酰胺溶液（浓度为 98%），使之终浓度
分别为 0.2%、0.5%、1%、1.5%和 2%，保持各反应
体系终量为 25µL，检测对 PCR 反应的作用和影响。
1.7 引物的筛选
待选引物共16个（表1）。引物筛选标准为：多
态性与稳定性好，主带清晰，无杂带、背景和弥散
现象，退火温度相对高，特异性强。引物筛选时都
用同样5个不同编号的模板。
2 结果与分析
2.1 扩增混合液浓度的确定
经模板浓度测定、PCR 反应程序与退火温度的
摸索与调试等优化过程，表明所用 PCR 扩增混合液
的各成分浓度是适宜的，不需要再做调整。
2.2 模板浓度与扩增反应的关系
模板浓度测定的电泳结果。Marker 左侧为总
DNA 主带亮度最小的 u40 模板，其原液及各浓度稀
释液基本都有条带扩增出来；而 Marker 右侧为主
带亮度最大的 g27模板，其 1/100稀释液（582ng/µL）
和 1/200（291ng/µL）稀释液扩增效果均较好，条
带较为清晰。但 g27 原液、1/10 及 1/50 稀释液都没
有扩增出条带，其原因可能是在提取总 DNA 时，
获得 DNA 沉淀较多，而伴随 DNA 沉淀的杂质也相
对较多，在没有经过纯化的情况下，浓度较高时（原
液、1/10 和 1/50）这些杂质干扰了扩增反应而无扩
增结果，当 DNA 模板被稀释到一定浓度后，这些
杂质的浓度也随之降低，从而不再起到干扰作用，
扩增反应得以顺利进行（图 1）。

图 1 DNA 模板浓度测定电泳图谱
1－5 泳道为 u40 原液，1/10，1/50，1/100，1/200；Marker（200bp DNA
ladder Marker）；6－10 泳道为 g27 原液，1/10，1/50，1/100，1/200.
Fig. 1 Electrophoretogram of DNA template concentration mensuration.
Electrophoretogram of DNA template concentration mensuration.
Sample order: 1－5 is u40 original sample, 1/10, 1/50, 1/100, 1/200;
Marker (200bp DNA ladder Marker); 6－10 is g27 original sample,
1/10, 1/50, 1/100, 1/200.
264 Mycosystema

2.3 退火温度与扩增效率
由 PCR 反应程序与退火温度测定的电泳结果
（图 2）显示，大部分引物已经有扩增产物，只是
扩增效率不高。这表明大部分引物是可使用的，但
需要进一步优化反应参数。扩增效率不高可能有两
个原因：一是 PCR 反应程序不合适，该程序参考的
是研究植物的 PCR 反应程序，可能不适合真菌材
料，应作调整；二是退火温度可能不合适，统一用
50℃作为退火温度对于本研究而言效果并不理想。

图 2 PCR 反应程序测定电泳图谱
点样次序：对照；1－7 泳道为 1#－7#引物；Marker（200bp DNA ladder
Marker）；8－14 泳道为 8#－14#引物.
Fig. 2 Electrophoretogram of PCR procedure testing. Sample order: CK;
1－7 is 1#－7# primer; Marker (200bp DNA ladder Marker); 8－14 is
8#－14# primer.
2.4 退火温度的确定
从 PCR 反应程序与退火温度调整的电泳图谱
（图 3，4）结果看，调整 PCR 反应程序后的扩增
效果和质量得到了明显的提高，条带较为清晰，多
态性也比较好。

图3 甲酰胺与退火温度确定的电泳图谱 1－5泳道为5个不同
甲酰胺浓度的模板；Marker（200bp DNA ladder Marker）；6－15 泳道
为 6#引物的 40－60℃间从低到高温度梯度的 10 个模板；CK 为对照.
Fig. 3 Electrophoretogram of adjusting annealing point and formamide
concentration. Sample order: 1 － 5 is 5 templates of different
formamide concentration; Marker (200bp DNA ladder Marker); 6－15
is 6# primer’s 10 templates of different anneal temperature from 40 ℃
to 60℃; CK.
从图 3 中自左而右（电泳点样次序下同）7－
16 泳道和图 4 中 7－13 泳道的电泳结果表明：6#
引物退火温度选择 40.5℃、41.5℃和 43.5℃的扩增
效果比较好，而这些退火温度十分接近参考退火温
度 42℃；8#引物按所提供的退火温度（42℃）进行
扩增均取得了较好的效果，说明所提供的参考退火
温度对待试的模板具一定的通用性。

图 4反应程序与退火温度调整后的电泳图谱
1－5 泳道为 8#引物对 5 个不同模板的扩增检测；Marker（200bp DNA
ladder Marker）；6－12 泳道为 6#引物 40－55℃间 7 个模板的扩增检测；
13－17 泳道为 6#引物对加甲酰胺的 5 个模板的扩增检测.
Fig. 4 Electrophoretogram of adjusting PCR procedure and anneal
temperature. Sample order: 1－5 is 5 different templates with 8# primer;
Marker (200bp DNA ladder Marker); 6－12 is 6# primer’s 7 templates
of different annealing point from 40 to 55 ; ℃ ℃ 13－17 is 6# primer’s 5
templates added with formamide.
2.5 甲酰胺对扩增反应的影响
甲酰胺对 PCR 扩增结果的影响见图 3 和图 4。
因 ISSR 引物包含简单重复序列，而甲酰胺可有效
地防止引物自身形成二级结构，所以加入适当浓度
的甲酰胺可提高 PCR 反应的稳定性和提高产物特
异性及保证整个 PCR 反应的顺利进行，但浓度高于
2%的甲酰胺则会明显抑制 PCR 反应的进行（王伟
继和孔杰 2002）。Tsumura et al.（1996）在用 ISSR
分析 Douglas-fir（Pseudotsuga）和 Sugi（Cryptoneria
japonica）中也认为，2%的甲酰胺可以提高大多数
引物的产物清晰度。但本研究结果表明：与不加甲
酰胺相比，甲酰胺的加入对 PCR 扩增效果没有明显
的提高作用，而将甲酰胺的终浓度增加到 2%时，
对 PCR 扩增还有一定的抑制作用。
2.6 引物筛选结果
对 16 个引物的筛选（图 5、图 6、图 7）结果
表明，1#、2#和 12#引物因没有扩增产物而将其排
除；3#引物产生的条带少，多态性差，也将其排除；
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8#引物产生的谱带有背景，主带不够清晰，而 10#
引物产生的谱带有明显的弥散现象，所以这两个引
物也不理想；其余的引物则均达到了引物筛选的标
准，可作为参考引物备用。
3 讨论
影响 ISSR-PCR 的因素较多，其中引物浓度、
Mg2+浓度、模板浓度与纯度、引物的退火温度等是
PCR 扩增的几个主要反应参数。
在 ISSR-PCR 的反应体系中，引物的合适浓度
不仅可以保证整个 PCR 反应的成功进行，而且在提
高产物特异性、清除背景、消除杂带等方面也起着
重要的作用。Mg2+浓度也是决定扩增产物的一个非
常重要的影响因子，高浓度 Mg2+虽然可以保证 PCR
反应的顺利进行，但有时会使产物带有明显的背
景，适当降低 Mg2+浓度则可以有效地消除背景，其
作用比提高退火温度更明显。dNTPs 和 Taq 聚合酶
的量应平衡，要尽量做到两个成分间能进行当量反
应。模板浓度测定结果表明，加入总 DNA 原液的
1/100 和 1/200 稀释液的扩增效果均较好，据此，在

图 5 1#、2#、3#、4#、5#和 6#引物扩增效果的电泳检测图谱
自左而右：1－5 为 1#引物；6－10 为 2#引物；12－16 为 3#引物；18－22 为 4#引物；23－27 为 5#引物；29－33 为 6#引物；M 为 Marker（200bp DNA
ladder Marker）.
Fig. 5 Electrophoretogram of amplification with 1#, 2#, 3#, 4#, 5# and 6# primer. Sample order (from left to right): 1－5 with 1# primer; 6－10 with
2# primer; 12－16 with 3# primer; 18－22 with 4# primer; 23－27 with 5# primer; 29－33 with 6# prime; M is Marker (200bp DNA ladder Marker).

图 6 7#、8#、9#、10#、11#和 12#引物扩增效果的电泳检测图谱
自左而右：1－5 为 7#引物；6－10 为 8#引物；11－15 为 9#引物；16－20 为 10#引物；21－25 为 11#引物；28－32 为 12#引物；M 为 Marker（200bp
DNA ladder Marker）.
Fig. 6 Electrophoretogram of amplification with 7#, 8#, 9#, 10#, 11# and 12# primer. Sample order (idem): 1－5 with 7# primer; 6－10 with 8#
primer; 11－15 with 9# primer; 16－20 with 10# primer; 21－25 with 11# primer; 28－32 with 12# primer; M is Marker (200bp DNA ladder
Marker).

图 7 13#、14#、15#和 16#引物扩增效果的电泳检测图谱
自左而右：1－5 为 13#引物；7－11 为 14#引物；13－17 为 15#引物；18－22 为 16#引物；M 为 Marker（200bp DNA ladder Marker）.
Fig. 7 Electrophoretogram of amplification with 13#, 14#, 15# and 16# primer. Sample order (idem): 1－5 with 13# primer; 7－11 with 14# primer;
13－17 with 15# primer; 18－22 with 16# primer; M is Marker (200bp DNA ladder Marker).
266 Mycosystema

未纯化的条件下，适宜的 DNA 模板浓度范围确定
为：5.5－582ng/µL，为操作方便，统一采用所提总
DNA 原液的 1/100 稀释液作为模板 DNA。
根据测定结果分析，本实验所用 PCR 反应体系
是适合的，不需要再做调整。即反应体系总体积为
25µL，各反应物浓度：MgCl2 1.5mmol/L，dNTPs
0.2mmol/L，引物 1.25mol/L，Taq 聚合酶 1.25U
（Promega，Madison，USA），1× Taq buffer；反应
体系中模板 DNA 含量为 5.5－582ng。本反应体系
为蜜环菌属 ISSR-PCR 扩增反应提供有价值参考。
综合分析图 3 和图 4，各引物所提供的参考退
火温度是可以采用的。采取统一的退火温度不适合
本实验，各引物适宜的退火温度应在筛选实验中进
一步摸索确定。根据 PCR 反应程序的测定结果，将
PCR 反应程序确定为：95℃预变性 10min；进入循
环，94℃变性 30s，各引物提供的退火温度 1min，
72℃延伸 2min，35 个循环；最后 72℃延长 10min；
4℃保存。
与对照相比，甲酰胺对提高 PCR 扩增产物的作
用并不明显，而且甲酰胺的终浓度为 2%时还有明
显抑制扩增反应的作用，所以在本反应体系中不加
甲酰胺。在一般的 PCR 扩增中，甲酰胺的加入与否
需经过试验来确定。
引物筛选应本着简单、经济、高效的原则来进
行，从 10 个备用的引物中选择 5－6 个作为最终的
使用引物。选择标准是：一是要多态性好，条带清
晰杂带少，既有共有带又有特征带；二是要退火温
度相对较高，因为退火温度低则扩增产物相对杂，
特异性差；三是要效果稳定，重复性好。根据这些
标准，所用引物最后确定为：9#、11#、13#、14#、
15#和 16#。
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