全 文 ：假蜜环菌深层发酵补料分批培养工艺研究
刘大岭 ,罗林波 ,陈子明 ,姚冬生
(暨南大学 生命科技学院 生物技术室 ,广东广州 510632)
摘　要:研究了 5L发酵罐上用酵母泥复合培养基 ,液体深层培养假蜜环菌的补料分批工艺。优化的补料流
加方式(根据还原糖浓度补料并添加微量钴离子)相对于分批培养 ,培养过程中最大菌体干重平均提高了 6. 284
g /L,即产量提高了 77. 3%。
关键词:假蜜环菌;补料分批培养;啤酒酵母泥
中图分类号:TQ920. 6　文献标识码:A　文章编号:1001 - 8581(2006)02 -0115 -03
Study on Batch Feed - add ing Culture Technology ofArm illariella
tabescens in Submerged Ferm entation
LIU Da - ling, LUO Lin -bo, CHEN Zi -m ing, YAO Dong - sheng
(Labo ra to ry of Bio techno logy, Ji’ nan Un iversity, Guangzhou 510632, China)
Abstrac t:Using 5L automatic fe rmento r andm ixedmedium w ith yeastmud, the subme rged fermen tation o f
Arm illariella tabescens was conducted to study batch feed - add ing techno logy. The resu lts revealed that the best
feed - adding cu lturemodew as adding feed according to the concentra tion of reductive sugar and traces ofC o ion
according to the concentration o fCo ion, this culturemode could increase the drymycelialw eigh tby an ave rage
of 6. 284g /L o r 77. 3% as compared w ith ba tch culture mode.
Key words:A. tabescens;Batch feed - adding cu lture;Yeastmud from beer production
假蜜环菌(Arm illariella tabescens),或称亮菌 ,属白磨科 ,为亚洲特有菌种 ,是药食兼用菌。假蜜环菌固体培
养物对胆源性急性胰腺炎 、胆囊炎和传染性肝炎有一定的疗效 [ 1] 。目前有用该菌的菌丝体制成亮菌糖浆 、亮菌
口服液等保健食品的报道 [ 2 , 3] ,其主要活性成分为亮菌多糖 ,开发应用前景广阔。
目前 ,补料分批培养方式是我国发酵工业中使用的最主要生产方式。这种方式是指在分批培养过程中 ,间
歇或连续地向培养基中补加一种或多种成分 ,以解除底物或代谢产物的抑制作用。大规模培养假蜜环菌 ,为降
低培养基成本 ,需探讨采用一些食品工厂的下脚料。啤酒酵母泥是啤酒生产的副产物 ,来源广 、价格低 ,富含蛋
白质 、氨基酸、维生素、糖类和多种微量元素 ,可为微生物培养提供必要的营养物质 [ 4] 。大力开发利用啤酒酵母
泥 ,既可减轻其大量排放造成的环境污染 ,又可提高企业的经济效益。冉艳红等 [ 5]的研究表明 ,废酵母可用于深
层培养假蜜环菌 ,并明确了初步的摇瓶培养条件。本文进一步研究了用酵母泥作培养基成分进行 5L发酵罐补
料分批发酵 ,探讨不同的补料策略对假蜜环菌生长的影响 ,对进一步开发酵母泥作为假蜜环菌工业化生产的培
养基成分具有较大的参考价值。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　菌株　假蜜环菌 EJLY2098,由本实验室保存。
1. 1. 2　啤酒酵母泥　由广东某啤酒厂提供。
1. 1. 3　啤酒废酵母泥的处理　啤酒废酵母泥经固液分离得湿酵母 ,烘干成干燥酵母粉。按重量体积比(1∶2)加
入蒸馏水混匀后离心弃上清液 ,在所获的酵母泥中加入等体积 2%NaC l溶液和适量蛋白酶 ,调 pH至 7. 0, 50℃
　江西农业学报　2006, 18(2):115 ～ 117
Ac ta Ag ricu ltu rae Jiangxi　　　　　 　
收稿日期:2006- 01- 18
　作者简介:刘大岭(1963 -),女,山西太原人 ,博士 ,教授 ,从事生物化学与新活性物质研究工作。
恒温水浴 54h,然后用 4层纱布过滤 ,所得滤液用于配制基本发酵培养基。
1. 1. 4　培养基　液体种子培养基:马铃薯(20%,表示质量百分含量 ,下同),蔗糖(2%), pH5. 5 ～ 6. 0。
基本发酵培养基:干燥啤酒酵母泥(0. 5%),葡萄糖 (2. 5%), KH2PO4 (0. 3%),M gSO4 7H2O(0. 15%),
pH6. 0。
发酵补料培养基:大豆蛋白胨(0. 5%),葡萄糖(3%), KH2PO4(0. 3%),MgSO4 7H2O(0. 15%), pH6. 0。
1. 2　方法
1. 2. 1　种子培养　将活化好的菌株斜面切成均匀小块 ,接入液体种子培养基中(250mL摇瓶 ,装培养基 50mL),
26℃, 160r /m in恒温振荡培养 4 ～ 6d。
1. 2. 2　摇瓶二级培养　液体种子培养好后 ,转接入酵母泥复合培养基中(500mL摇瓶 ,装培养基 100mL), 26℃,
180r /m in振荡培养 3 ～ 5d。
1. 2. 3　发酵罐和发酵条件　Biotop - 5L全自动发酵罐 ,中国台湾顶生公司生产 ,有效容积 5L ,初始投料体积
2. 5L ,培养基 121℃灭菌 30m in;通气量 1. 22 vvm ,培养温度 26. 0±0. 5℃, DO控制在 15%以上 , pH值和 DO值采
用 H am inton pH电极和溶氧电极在线检测;搅拌转速在 80 ～ 250r /m in内无级调速 ,可通过设定 DO值进行串级
控制。采用不同的流加方式进行发酵。
1. 2. 4　发酵液中菌丝体干重的测量　将一定体积的发酵物 ,用已烘干至恒重之滤纸过滤水洗 ,连滤纸在 80℃下
烘干至恒重。称重 ,减去滤纸的质量后 ,换算成每升发酵液中菌丝的干重 [ 6] 。
1. 2. 5　发酵液还原糖测定　用斐林试剂比色法 [ 7] 。
2　结果与分析
2. 1　假蜜环菌在 5L发酵罐中分批培养生长曲线的确定
将二级摇瓶菌种按照 5%的接种量接到 2. 5L基本发酵培养基中进行分批培养 ,每隔 6h取样测定发酵液中
的菌体干重和还原糖含量(重复 3次)。结果见图 1、图 2。
图 1　假蜜环菌生长曲线 图 2　还原糖变化曲线
F igure 1　The grow th curve ofA. tabescens F igure 2　The var iation curve of reduc tive sugar
由图 1可以看出 ,在培养 0 ～ 24h间 ,菌株在基本发酵培养基中生长缓慢;24h后迅速生长 ,进入对数生长期;
75 ～ 92h期间菌体干重保持在一个相对稳定的数值;而 92h后菌体干重呈下降趋势 ,进入了衰亡期。图 2表明
在培养 24 ～ 72h间 ,随着发酵液中菌数的迅速增加 ,发酵液中的还原糖含量迅速下降 ,从 18. 59mg /mL下降到
2. 12m g /mL。此后发酵液中的还原糖一直保持在 1. 50 m g /mL左右。根据分批培养的结果 ,确定了以下的补料
策略。
2. 2　根据 pH补料
根据培养基 pH的变化流加发酵补料培养基(葡萄糖浓度为 30g /L)。在发酵过程中 ,当 pH降到 5. 8时自动
流加 2m ol /L的 NaOH溶液使 pH升高;当 pH在 6. 0以上时自动流加补料培养基 ,由于葡萄糖的分解使 pH下
降 ,当 pH下降到一定程度之后 ,则又加入适量的碱液使 pH升高 ,使 pH值控制在 6. 0。培养 96h后收罐。
2. 3　恒流速补料
在培养 0 ～ 24 h间不流加补料 ,在 24 ～ 74 h间以 0. 5mL /m in的恒定速率自动流加发酵补料培养基 , 50h共
流加补料 1500mL;75h后停止流加补料 ,继续培养至 98h收罐。
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2. 4　根据还原糖浓度补料
在培养 0 ～ 24 h间不流加补料 ,在 24 ～ 74 h间每隔 2h测定 1次还原糖浓度 ,根据测定结果调节流加发酵补
料培养基的速率 ,使还原糖浓度控制在 10. 00 ～ 15. 00mg /mL范围内;75h后停止流加补料 ,继续培养至 98h。
2. 5　添加微量钴离子的复合流加
本室的摇瓶实验结果表明 ,在培养基中加入微量钴离子有利于提高菌丝体产量[ 8] 。故在根据还原糖浓度
补料的基础上 ,在培养 24 ～ 74h期间再加上 0. 1mg /L氯化钴的流加 ,控制发酵液中钴离子的浓度在 0. 1mmol /L。
2. 6　5种培养方案的结果比较
3次分批发酵和 12次补料发酵结果见表 1。由表 1可见 ,补料发酵各批次的菌体干重平均值都明显高于分
批发酵。其中添加微量钴离子的复合流加方式效果最优 ,比分批发酵的菌体干重要高出 6. 284 g /L,即产量提高
了 77. 3%。其原因主要是补料可及时满足菌体合成产物的需要 ,适宜的还原糖浓度使菌体的对数生长期延长;
加入微量钴离子有利于刺激糖代谢 ,提高菌体对糖的利用率。可见 ,优化的补料发酵方式是实现假蜜环菌高密
度培养的一条有效途径。
表 1　5种培养方案的参数比较
Tab le 1　Comparison of the param eters of five cultura l schemes
培养方式 流加方式 培养时间
(h)
流加葡萄糖总量
(g)
最大菌体干重
(g /L)
分批 对照 96 0 8. 134
补料 根据 pH流加 96 30 9. 214
补料 恒流速流加 98 45 11. 487
补料 根据还原糖浓度流加 98 53 13. 571
补料 添加微量钴离子的复合流加 98 53 14. 418
　注:表中数据为 3次实验的平均值。
3　结论
通过上罐发酵研究比较 ,找到了较优的补料分批培养工艺:控制还原糖浓度并添加微量钴离子的复合流加
方式。采用这种培养策略 ,假蜜环菌的菌体干重有了明显的提高 ,最大达 14. 418 g /L ,产量比分批发酵提高了
77. 3%。
用酵母泥作培养基主要成分 ,不仅可减少环境污染 ,而且价格低廉 、不失质量。本研究的结果为利用工业酿
酒下脚料酵母泥进行大规模生产假密环菌提供了有价值的参考数据。
参考文献:
[ 1] 方积年 ,叶淳渠 ,吴淑云 ,等.亮菌多糖的研究 [ J] .生物化学与生物物理学报 , 1984 , 16(5):222.
[ 2] 章灵华 ,肖培根.药用真菌中生物活性多糖的研究 [ J].中草药 , 1992, 23(2):95.
[ 3] 褚新红 ,陈光芝 ,于学娟 ,等.薄层扫描法测定亮菌糖浆中亮菌多糖的含量 [ J] .中成药 , 2002, 24(4):296 ～ 298.
[ 4] 冯霖 ,江泉.浅谈我国啤酒厂废弃物综合利用的现状及发展趋势 [ J] .酿酒科技 , 1995, (5):33～ 34.
[ 5] 冉艳红 ,邱皓坚 ,刘大岭 ,等.利用啤酒废酵母深层发酵培养假蜜环菌的研究 [ J] .食品工业科技 , 2005, (4):57～ 60.
[ 6] 刘勇 ,张长铠 ,李昆峰.金针菇 FV 088深层发酵工艺的研究 [ J].食品与发酵工业 , 1998, 24(3):7 ～ 12.
[ 7] 宁正祥.食品成分分析手册 [M] .北京:中国轻工业出版社 , 1998.
[ 8] 刘大岭 ,张静 ,冉艳红 ,等.假蜜环菌液体深层发酵条件的研究 [ J].生物技术 , 2004, 14(3):47 ～ 48.
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