全 文 ：收稿日期:2012 － 01 － 09;修回日期:2012 － 01 － 31
基金项目:安徽大学研究生学术创新研究项目(yqh090033)
作者简介:宋 淼(1987 －) ，女，汉，硕士研究生，研究方向为发酵工程，E-mail:mi_aosong@ 126． com;
通讯作者:张书祥(1962 －) ，男，汉，副教授，硕士生导师，E-mail:zhangshux578@ 126． com。
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2012. 05. 064
假蜜环菌液体种子培养条件的优化及其应用研究
宋 淼1，王 清2，张书祥1
(1． 安徽大学生命科学学院，安徽 合肥 230039;2． 合肥诚志生物制药有限公司，安徽 合肥 230088)
摘 要:目前国内多采用固体菌种进行假蜜环菌的发酵生产。在假蜜环菌液体种子的培养及培养条件优化等方面
进行了探讨，优化条件为:玉米淀粉为较适宜碳源;酵母浸出粉为较适宜氮源;添加 KH2 PO4、吐温 － 80 对菌丝生长
有一定的促进作用。正交试验结果显示，适合假蜜环菌菌丝体生长的培养基配方为玉米淀粉 30 g /L，酵母浸出粉 3
g /L，KH2PO4 1. 5 g /L。此外，还探讨了液体种子与传统的固体种子对固体发酵产物的影响，结果表明，接种液体种
子能提高固体发酵的主要代谢产物的产量。该实验为改善假蜜环菌现行的生产工艺提供参考。
关键词:假蜜环菌;液体种子;菌丝生物量;代谢产物
中图分类号:Q93 － 335 文献标识码:A 文章编号:2095 － 1736(2012)05 － 0064 － 04
The conditions optimization of liquid seed culture of
Armillariella tabescens and its application
SONG Miao1，WANG Qing2，ZHANG Shu-xiang1
(1． School of Life Science，Anhui University，Hefei 230039;
2． Cheng Zhi Biological Pharmaceutical Co Ltd，Hefei 230088，China)
Abstract:At present，most of the traditional fermentation of Armillariella tabescens were carried on with being vaccinated solid seed． It
was discussed in this paper about the conditions optimization of liquid strain culture of Armillariella tabescens． The optimized results
showed that corn starch meal was suitable for the growth of Armillariella tabescens，and the satisfactory nitrogen source was yeast ex-
tract，and it was also found that KH2PO4 and tween 80 could greatly stimulate the growth． Through the result of orthogonal experiment，
it was known that the optimum formula for the mycelia growth of Armillariella tabescens was made up of 30 g /L corn starch meal，3 g /
L yeast extract and1. 5 g /L KH2PO4 ． Based on these references，the paper had also discussed the influence on the solid fermentation
products when vaccinated different strains． It was proved that it could enhance the output of solid fermentation metabolite obviously
when vaccinated liquid seed． So this experiment would be helpful in improving the present techniques．
Keywords:Armillariella tabescens;liquid strain;mycelial biomass;metabolite
假蜜环菌(Armillariella tabescens)是层菌纲口蘑科
假蜜环菌属真菌，因菌丝体在暗处发出荧光，故称为亮
菌。假蜜环菌是中国首次发现并拥有自主知识产权的
一种真菌［1 － 2］，其固体培养物对胆囊炎、传染性肝炎以
及由顺铂化疗诱发的胃肠道反应有一定的疗效［3 － 4］。
现代研究表明，用乙醇、乙酸乙酯提取可得到假蜜环菌
甲素、假蜜环菌乙素、假蜜环菌丙素。用水提或碱提法
可提取得到杂多糖 ATM3、AT-HW 和 AT-AC
［5 － 6］。据
报道，其多糖成分是假蜜环菌生理生化活性的主要成
分之一，具有抗肿瘤活性［7］，且能显著提高机体免疫机
能［8 － 9］。
目前国内多采用固体菌种进行假蜜环菌的固体发
酵生产，这种生产方式生产周期长，生产规模受到一定
的限制，且容易染菌［10］。而采用液体菌种替代固体菌
种进行生产有很多诸如生产周期短、菌种纯度高、易于
量化、易操作等优点。
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本文在有关文献报道的基础上，对合肥诚志生物
制药有限公司的假蜜环菌进行液体培养，并对培养条
件进行了单因子筛选，再通过正交试验确定了适合假
蜜环菌菌丝体生长的培养条件，同时，进一步探索假蜜
环菌的液体种子对固体发酵代谢产物的影响，为改善
假蜜环菌现行的生产工艺提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种
假蜜环菌，由合肥诚志生物制药有限公司提供。
1. 1. 2 培养基
1. 1. 2. 1 试管种子斜面培养基:PDA培养基。
1. 1. 2. 2 液体种子培养基
碳、氮源基础培养基(g /L) :马铃薯去皮 200，KH2
PO42，MgSO4·7H2O 1。
矿质盐筛选试验基础培养基(g /L) :葡萄糖 20，蛋
白胨 2。
分散剂筛选试验基础培养基(g /L) :葡萄糖 20，蛋
白胨 2，KH2PO4 2，MgSO4·7H2O 1。
1. 1. 2. 3 固体发酵培养基
由诚志生物制药有限公司提供配方及原料，本实
验室制备。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 液体种子的培养［11］
试管菌种经过活化，用接种铲挑取 1 cm2大小的菌
体接种于 250 mL 三角瓶的液体种子培养基中，25℃、
150 r /min振荡培养 7 d，待形成菌丝球并均匀分散在
培养基中时，考察菌丝体干重。
1. 2. 2 固体发酵
按诚志生物制药有限公司提供配方配置固体培养
基，灭菌冷却后分别接种液体种子、固体种子，设 3 次
重复，置于 25℃培养箱中培养 50 ～ 60 d。考察接种不
同类型种子的发酵结果。
1. 3 测定方法
1. 3. 1 菌丝干重法测定［12］
收集菌球过滤，纯净水冲洗，直至菌丝无杂质，10
000 r /min 离心 15 min，80℃烘干至恒重，电子天平称
量菌丝体的干质量。
1. 3. 2 多糖含量测定
1. 3. 2. 1 热水浸提法提取假蜜环菌粗多糖［13］
称取一定质量的固体发酵物，捣碎，以 1 ∶ 5 的固
液比加入蒸馏水，在 80℃下水浴 2. 5 h，不断搅动，防止
黏壁。浸提完毕后取出冷却至室温，四层纱布过滤，
5000 r /min离心 10 min，去沉淀;沉淀重复浸提一次，
合并两次滤液，旋转蒸发仪(70℃)浓缩至原液的 1 /5
～ 1 /6，得多糖提取液。
1. 3. 2. 2 样品多糖含量测定
葡萄糖标准曲线的制备［14］。
精密量取 0. 1 g /L的葡萄糖标准溶液 0、0. 2、0. 4、
0. 6、0. 8、1 mL分别置于干净的具塞试管中，分别加入
蒸馏水补充至 1 mL。同时加入 6%的苯酚 1 mL，再迅
速加入浓硫酸 5 mL，旋涡振荡混匀，冷却至室温，490
nm处比色，测定吸光值。
样品多糖含量测定。
将提取的多糖溶液加入 95%乙醇，使含醇量达到
80%，静置过夜，10000 r /min 条件下离心 20 min 得到
粗多糖，再加入适量蒸馏水，复溶。采用苯酚硫酸法测
定吸光值［15］，根据标准曲线计算多糖浓度，再计算出
多糖含量。
1. 3. 3 样品蛋白质含量测定
以考马斯亮蓝染料法［16］测定固体发酵提取液的
吸光值，根据标准曲线计算蛋白质浓度，再计算出蛋白
质含量。
2 结果与分析
2. 1 液体种子培养条件的优化
2. 1. 1 碳源筛选试验结果
碳源在真菌生长中是很重要的营养物质，试验选
用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉及玉米淀粉作为碳源，以
20 g /L的量加入到碳源基础培养基中。结果(图 1)可
见，假蜜环菌菌丝在 4 种碳源中均能正常生长，但在不
同碳源中的菌丝体生长情况不同，在玉米淀粉培养基
中菌丝球的数量多，在培养过程中生长速度快，其菌丝
体干质量达到最大，为 684. 133 mg /(100 mL) ，比对照
组增加了 75. 3%;而添加其它碳源的培养基中菌丝球
数量相对少，菌丝体生长速度慢，其中菌丝体干质量最
小为 453. 467 mg /(100 mL) ，比对照组增加了 16. 2%。
2. 1. 2 氮源筛选试验结果
为了比较不同氮源对假蜜环菌的液体种子培养的
影响，选择酵母浸出粉、蛋白胨、尿素和硫酸铵作为氮
源，以 2 g /L 的量加入到氮源基础培养基中。结果见
图 2，假蜜环菌在酵母浸出粉培养基中，菌丝球数多，
生长速度快，其菌丝体干质量达到最大为 513. 44 mg /
(100 mL) ，比对照组增加了 38. 5%;而在尿素培养基
中菌丝球数量少，菌丝体生长慢，菌丝体干质量最低为
358. 21 mg /(100 mL) ，相对对照组降低 3. 4%，这可能
是因为尿素水解产生的中间产物影响了菌丝体的生
长。通过氮源筛选试验发现，相对于无机氮源，有机氮
源更有利于假蜜环菌菌丝的生长。
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2. 1. 3 矿质盐筛选试验结果
矿质元素在真菌的培养中也是非常重要的，因此，
选择将 1 g /L 的 K2 SO4、KH2 PO4、MgSO4 · 7H2 O、
CaSO4、K2HPO4分别加入到矿质盐筛选基础培养基中。
结果见图 3，假蜜环菌菌丝体在 KH2 PO4培养基中，菌
丝球数量多，菌丝体生长速度快，菌丝体干质量最大为
636. 44 mg /(100 mL) ，比对照组增加了 54. 8%;在不同
的矿质盐筛选培养基中菌丝体干质量大小依次为:
KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaSO4、K2HPO4、K2SO4。通过
矿质盐筛选试验发现，KH2 PO4与 MgSO4·7H2 O 有利
于假蜜环菌菌丝的生长。
2. 1. 4 分散剂筛选试验结果
在液体种子培养过程中加入分散剂是为了使菌丝
体在培养过程中能够独立的生长，降低了菌丝体之间
的连接性。据文献报道，吐温 － 80 作为一种表面活性
剂，它可以使细胞膜或者细胞壁的通透性改变，同时还
可以起到分散剂的作用［17］。不同浓度的吐温 － 80 对
假蜜环菌的液体种子产量有不同的影响，其中加入 2
mL /L的分散剂的菌丝体干重最大为 676. 92 mg /(100
mL) ，比对照组增加了 55. 6%;6 mL /L 的实验组次之，
为 653. 34 mg /(100 mL) ，比对照组增加了 50. 1%(图
4) ;通过菌丝体的形态观看，加入 6 mL /L吐温 － 80 的
菌丝体大小较为均一，且菌体较小，表面菌丝较多并呈
放射状，2 mL /L 的次之;从菌丝体产量的提高量以及
菌体形态综合考虑，加入 6 mL /L吐温 － 80 较好。
2. 1. 5 正交试验结果
选取玉米淀粉、酵母浸出粉、KH2 PO4设计三因素
三水平的 L9(3
4)正交试验［18］，筛选出适合假蜜环菌菌
丝生长的培养基组成，设 3 次重复，试验因子和水平见
表 1。结果见表 2。
表 1 培养基筛选的三因素三水平设计
Table 1 The different level and factors of orthogonal experiment(g /L)
水平
因素
玉米粉(A) 酵母浸出粉(B) KH2PO4(C)
1 10 1 1
2 20 2 1. 5
3 30 3 2
从表 2 中极差值可知，玉米淀粉对假蜜环菌菌丝
的生长量影响最大;酵母浸出粉次之;KH2 PO4的影响
最小。其最适配方为 A3 B3 C2，即玉米淀粉 30 g /L，酵
母浸出粉 3 g /L，KH2PO4 1. 5 g /L，此时，菌丝体产量最
大，为 1616. 1 mg /(100 mL)。
表 2 正交试验结果
Table 2 Result of L9(34)orthogonal experiment(g /L)
试验
序号
因素
玉米粉(A)
(g /L)
酵母浸出粉(B)
(g /L)
KH2PO4(C)
(g /L)
菌丝体干质量
/mg·(100 mL －1)
1 10 1 1 714. 9
2 10 2 1. 5 863. 9
3 10 3 2 946. 5
4 20 1 1. 5 976
5 20 2 2 958. 2
6 20 3 1 1036. 8
7 30 1 2 1517. 4
8 30 2 1 1328. 4
9 30 3 1. 5 1616. 1
K1 841. 77 1069. 43 1026. 7
K2 990. 33 1050. 17 1152
K3 1487. 3 1199. 8 1140. 7
R 645. 53 149. 63 125. 3
2. 2 液体种子的应用研究
分别接种液体种子、固体种子到固体发酵培养基，
进行固体的发酵研究，设 3 次重复，置于 25℃培养箱中
培养 50 ～ 60 d，发酵终止。对假蜜环菌固体发酵提取
液的主要成分进行分析，得出接种不同种子的固体发
酵结果。
2. 2. 1 苯酚硫酸法测多糖标准曲线
如图 5，其回归方程为 y = 11. 904x － 0. 0327(x 为
OD值，y为多糖浓度) ，回归率为 R2 = 0. 9905。
2. 2. 2 考马斯亮蓝法测蛋白质标准曲线
蛋白质可以通过考马斯亮蓝法检测，考马斯亮蓝
的标准曲线如图 6，其回归方程为 y = 0. 0076x + 0. 0029
(x为 OD值，y为蛋白质浓度) ，回归率为 R2 = 0. 996。
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2. 2. 3 固体发酵样品测定结果
分别对接种不同种子的固体发酵培养基进行多
糖、蛋白质含量测定，测定结果见表 3。通过表 3 发现，
接种液体种子的发酵培养基中，多糖与蛋白质含量高
于传统发酵培养基，故以多糖与蛋白质为目标产物的
假蜜环菌固体发酵，相比较于接种固体种子，接种液体
种子更有利于目标产物的积累。
表 3 固体发酵提取液成分分析
Table 3 The analysis of components in extract from
the yield of solid fermentation
接种不同种子的
固体培养基
发酵提取液成分(mg /g)
样品多糖含量 样品蛋白质含量
样品
1
样品
2
样品
3
平均
含量
样品
1
样品
2
样品
3
平均
含量
接种液体种子的培养基 34. 42 32. 4 32. 65 33. 15 2. 38 4. 41 3. 43 3. 74
接种固体种子的培养基 27. 36 25. 85 22. 61 25. 27 1. 26 2. 04 1. 98 1. 76
3 小结与讨论
3. 1 由单因子筛选实验得出，适合假蜜环菌菌丝体生
长的碳源、氮源分别为玉米淀粉和酵母浸出粉;KH2
PO4与 MgSO4·7H2 O 有利于假蜜环菌菌丝的生长;6
mL /L吐温 － 80 作为分散剂时，菌丝体的产量有所增
加，且分散效果较好。在实验中发现，玉米淀粉作为碳
源有利于假蜜环菌菌丝体的生长，但在培养终止后会
有小部分残留，所以，在测定试验结果时，要将附着于
菌球上的残留玉米淀粉除去，才能够保证结果的准确
性。
3. 2 多糖是假蜜环菌生长代谢的重要产物，是其重要
的功效成分之一。目前固态发酵多糖是假蜜环菌生产
的主要方式，这种发酵系统存在发酵周期较长、容易染
菌等问题，而假蜜环菌的液体发酵还处于实验室阶段，
尚未应用在工业大生产中，而本实验培养的液体种子
用于固体发酵时，多糖与蛋白质含量都高于传统的固
体发酵，且液体种子制备时间短，这就能够缩短发酵周
期，且液体种子能够量化，操作简单。因此，液体种子
用于假蜜环菌固态发酵的工业生产是合理可行的。有
关液体种子能提高假蜜环菌固态发酵有效成分含量的
机理尚待进一步研究。
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