全 文 ：功能的生物学原理 ,还有待进一步研究。
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假蜜环菌液体深层发酵条件的研究
刘大岭 ,张静 ,冉艳红 ,梁郁强 ,谢春芳 ,姚冬生＊(暨南大学 ,生命科技学院生物技术室 , 广东 广州 510632)
摘要:对该真菌菌丝体的液体深层培养条件进行了探讨为进一步工业化发酵提供参考数据。方法:在基本培养基的基础上
分别改变碳源 、氮源 、无机元素和C/N比对该菌的液体深层发酵情况 ,包括测量各培养条件下耗糖情况 、绘制生长曲线 ,观察菌体
的生长形态等等。结果:假蜜环菌的菌丝产量在第 6d可达到最大值 ,其后会逐渐降低 , 并伴有溶菌的现象发生。在培养初期加
入微量钴元素有利于刺激糖代谢提高菌体对糖的利用率 , 其作用主要是缩短延滞期。进入指数生长期后连续补加碳源有利于菌
体迅速生长。优化后培养基组成为:葡萄糖 1%和蔗糖 1%为碳源 , 以酵母浸膏 1%为氮源 , KH2PO4 0.1%,MgSO4 0.05%Z , 元素钴适量。液体深层发酵培养 6d 后菌丝生长状态已达到最佳 ,在此条件下搅拌发酵培养可收获 20mg/ml(干重)的菌丝体。
关键词:假蜜环菌(Armillariella tabescens);液体深层发酵;碳源;氮源;C/N;无机元素
中图分类号:TQ920.6　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)03-0047-02
收稿日期:2003-01-10;修回日期:2004-03-30
攻关项目:广东省科技攻关项目(C30109)
作者简介:刘大岭(1963-),女 ,博士 ,副教授 , 研究方向:应用微生物
学;＊通讯作者 , Tel:020-85228422 , Fax:020-85226223 , E-mail:tldl@
juc.edu.cn。
　　假蜜环菌 Armillariella tabescens , 为白磨科真菌。菌丝或假
蜜环菌甲素用于治疗急性胆囊炎及慢性胆囊炎急性发作 、急
性传染性肝炎 、迁延性肝炎 、慢性肝炎有较好疗效。杂多糖组
分体外实验证实能抑制小鼠 S180 肿瘤的生长和增强巨噬细胞
的活性[ 1] 。用乙醇 、乙酸乙酯提取可得到假蜜环菌甲素 、假蜜
环菌乙素 、假蜜环菌丙素。用水提或碱提法可提取到杂多糖
ATM3、AT-HW和 AT-AC[ 2-5] 。其多糖成分据报道具有抗肿
瘤和免疫调节活性[ 6] , 也有报道该菌对霉菌毒素具有一定解
毒作用[ 4] 。
假蜜环菌的工业化发酵培养是解决其药用及其他用途的
原料的根本做法 , 本文对该真菌菌丝体的液体深层培养条件
进行探讨 ,比较于学娟等人的报道[ 7] , 培养周期更短 , 更全面
探讨了无机盐 、C/ N 比对培养结果的影响。为进一步工业化
发酵提供参考。
1　材料与方法
1.1　菌株:假蜜环菌(Armillariella tabescens), 购自中科院菌种
保藏中心 ,本室保存。
1.2　仪器和试剂:CaCl2、CuCl2 、FeCl3、MnCl2 、NaCl、Co(NO3)2 均
为国产分析纯。
1.3　培养基
1.3.1　种子培养基:真菌培养基,购自广州环凯微生物科技公司。
1.3.2　固体培养基:马铃薯斜面培养基(马铃薯 200g , 蔗糖
20g ,琼脂 20g , 水 1000ml)。
1.3.3　摇瓶发酵培养基
1)优选碳源培养基的配制:以大豆蛋白胨 0.5%, KH2PO4
0.1%,MgSO4 0.05%, pH 6.0 作对照培养基 , 再分别添加 2%葡
萄糖 、2%蔗糖 、2%麦芽糖 、2%淀粉 、2%麦芽汁作碳源。
2)优选氮源培养基的配制:葡萄糖 2%, KH2PO4 0.1%,Mg-
SO4 0.05%, pH 6.0 作对照培养基 , 再分别添加 0.5%蛋白胨 、
0.5%牛肉浸膏 、0.5%酵母浸膏粉 、0.5%(NH4)2SO4。
3)优选碳/氮比的培养基配制:以碳源和氮源筛选所得的
最适培养基为基础 , 保持碳源浓度不变 , 改变氮源浓度 , 使 C/
N值分别为7∶1、15∶1 、20∶1 和 32∶1。
4)无机盐的影响的培养基配制:以碳/氮比优选实验结果
为基础 ,再分别添加 NaCl 0.1g/ L、CaCl2 0.2g/L、FeCl3 0.1mg/ L、
MnCl2 0.1mg/ L、CuCl2 0.1mg/L、Co(NO3)2 0.1mg/ L。
1.4　实验方法
1.4.1　种子液的制备:经固体培养基复苏后 ,转接到已灭菌的
种子培养基中 , 28℃ 120r/ min 振荡培养 3d。
1.4.2　配制各种培养基 , 取 1L瓶 , 每瓶装培养基 400ml , 灭菌
后 ,接种量 20ml种子培养液/瓶 , 28℃, 150r/min 振荡培养。从
第3d(C/N 优选实验组和无机元素优选实验从第 2d)起 ,每隔 1-2d各取 20ml发酵液 , 过滤后 , 用阿贝折射仪测发酵液的总
糖 , 测 pH 值。菌丝于 80℃烘箱中烘干至恒重 , 称重。 实验设
平行复组 , 结果数值取平均值。
图 1　碳源对总糖的影响
Fig.1　Influence of carbon source on carbohydrate consumption
图 2　碳源对菌丝生长的影响
Fig.2　Influence of carbon source on mycelium growth
图 3　氮源对总糖的影响
Fig.2-1　Influence of nitrogen source on carbohydrate consumption
1.4.3　用优选后的培养基发酵培养 , 在不同的时间取样做镜
检 , 观察菌丝体生长情况。
1.4.4　用优选后的培养基做 5L 瓶通气搅拌发酵培养 , 2500ml
培养基中接种 250ml种子液 , 从第 4d 开始连续补充发酵培养
基 200ml/d ,第 6d 收获菌体。
2　结果与讨论
2.1　碳源的优选
第 14卷第 3 期:47
2004 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.3:47
Jun.2004
碳源对菌丝产量的影响见图 1、2。生长曲线显示 , 假蜜环
菌生长的延滞期时间为 3d 左右 , 期间 , 菌丝生长缓慢 ,总糖下
降也较慢 , 3d 后 , 进入指数期 , 菌丝产量剧增 , 6d 后达到最高
峰 ,与此同时总糖含量也快速下降。以葡萄糖和蔗糖为碳源 ,
总糖下降多且菌丝产量最高。生产上可以依据原料的成本适
当取舍。对照组虽然总糖下降大 ,但生长始终处于较低水平。
图 4　氮源对菌丝生长的影响
Fig.4　Inf luence of nitrogen source on mycelium growth
图 5　碳氮比对总糖的影响
Fig.5　Inf luence of carbon-nitrogen ratio on carbohydrate consumption
图 6　碳氮比对菌丝生长的影响
Fig.6　Inf luence of carbon-nitrogen ratio on mycelium growth
图 7　无机盐对总糖的影响
Fig.7　Inf luence of various metal ion on carbohydrate consumption
2.2　氮源的优选
从图 3、4 显示的菌体生长规律与图 1 、2 相似。延滞期为
3d , 7d 左右产量达到最高。酵母浸膏粉 、牛肉浸膏和蛋白胨的
总糖下降最快 , 硫酸铵作氮源 , 总糖下降慢 、菌丝产量少。从
菌丝生长的情况看 , 培养至第 7d 从高到低依次为牛肉浸膏 、
酵母浸膏 、蛋白胨 、硫酸铵。对于大量生产 , 由于牛肉浸膏较
贵 , 可选用酵母浸膏或蛋白胨为氮源。
2.3　碳氮比的优选
综合分析对碳源和氮源实验得出假蜜环菌液体发酵的适
宜培养基配方:葡萄糖 1%, 蔗糖 1%、酵母浸膏 0.5%,MgSO4
0.05%, KH2PO4 0.1%, pH 6.0。在此基础上 , 设置 4 种不同 C/
N值进行摇瓶发酵得到菌丝的生长曲线 , 如图 5 、6。 可看出适
当降低 C/ N可提高菌丝产量。 C/N 为 7∶1 的菌丝产量最高 ,
综合考虑效价比 , C/N值在 7∶1到 15∶1 之间是合适的。
2.4　无机元素的影响
以 C/ N为 10∶1 ,在培养基中分别添加不同无机元素进行
摇瓶发酵得到菌丝的生长曲线 , 如图 7 、8。可看出 , 锰 、钙 、铜
和铁元素对菌丝生长不利;添加钴离子有利于菌丝的生长。
从总糖的消耗来看 , 铁 、钴和铜元素都能够增强糖的代谢 , 尤
其是钴和铁元素 , 这种作用更持久。综合两种因素 , 添加钴元
素可以提高糖的利用率并且有利于菌丝生长。
图 8　无机盐对菌丝生长的影响
Fig.8　Influence of various metal ion on mycelium growth
2.5　培养基优化后不同发酵培养时间的菌丝体生长情况
观察结果表明 , 接种后随着培养时间的延长菌丝体内容
物逐渐增多 , 菌丝变的粗壮 ,在第 6d 生长状态达到最佳 , 再继
续培养则会因营养不良或菌丝球内部缺氧而出现菌丝变细甚
至溶菌的现象 , 菌丝体的生长情况与实验中所测得菌丝产量
结果一致。
2.6　5L瓶通气搅拌发酵培养
第 6d 收获菌体 , 菌体产量可高达 20mg/ml(干重)。菌体
产量高 , 一方面是由于通气和采用磁力搅拌替代摇瓶增加了
溶氧量 , 另一方面也说明所得到的培养基配方是合适的。 但
对发酵培养中所涉及到的通气量等影响因素的研究尚待进一
步探讨。
3　结论
综合以上实验 , 发现假蜜环菌的菌丝产量在第 6d 可达到
最大值。在培养初期加入微量钴元素有利于刺激糖代谢提高
菌体对糖的利用率。其作用主要是缩短延滞期。假蜜环菌对
蔗糖和葡萄糖利用率较高 , 在进入指数生长期后需不断补加
碳源有利于菌体生长。 合适的 C/ N有助于提高菌丝体产量。
最佳培养基配方:葡萄糖 1%(含碳量 0.35%),蔗糖 1%(含碳
量 0.42%)、酵母浸膏 1%(含氮量 0.06%), KH2PO4 0.1%,Mg-
SO4 0.05%, 微量元素钴(0.1mg/L)。
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