全 文 ：收稿日期：2008-10-15
基金项目：广东省自然科学基金（7005189）
作者简介： 高慧灵 （1983-）， 男， 硕士研究生， 电话:020-61648167，
E-mail: btslq10@163.com
通讯作者 ：雷林生 ，教授 ，博士生导师 ，电话 ：020-61648167，E-mail:
lls@fimmu.com
木蹄层孔菌多糖对小鼠免疫功能的影响
高慧灵，雷林生，余传林，朱正光，陈娜娜，吴曙光（南方医科大学药学院药物研究所，广东 广州 510515）
摘要：目的 初步探讨木蹄层孔菌多糖(FFP)的免疫调节作用。 方法 MTT 法检测免疫细胞的代谢活力, ELISA 法检测肿
瘤坏死因子 α（TNF-α）、干扰素 γ(IFN-γ)、白细胞介素 2(IL-2)的含量，鸡红细胞吞噬法检测巨噬细胞的吞噬功能，绵羊
红细胞免疫法检测小鼠体液免疫功能。 结果 发现 FFP（100，50，25 μg/ml）可以明显促进小鼠脾细胞代谢活力，促进脾
细胞分泌细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-2；显著增强腹腔渗出细胞代谢活力，促进腹腔渗出细胞分泌 TNF-α。 FFP（100、50、
25 mg/kg）显著增强绵羊红细胞（SRBC）所致小鼠特异性抗体生成。 FFP（100、50 mg/kg）可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞
噬鸡红细胞（CRBC）的吞噬率和吞噬指数。 结论 木蹄多糖可促进小鼠免疫细胞分泌细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-2 和增
强小鼠的体液免疫功能及巨噬细胞的吞噬功能。
关键词：木蹄层孔菌；多糖；细胞因子；溶血素；免疫调节
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)03-0458-04
Immunomodulatory effects of Fomes fomentarius polysaccharides: an experimental study in mice
GAO Hui-ling, LEI Lin-sheng, YU Chuan-lin, ZHU Zheng-guang, CHEN Na-na, WU Shu-guang
Institute of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Abstract: Objective To investigate the immunomodulatory effects of Fomes fomentarius polysaccharides (FFP) in mice.
Methods MTT assay was employed to evaluate the in vitro metabolic activity of the mouse splenocytes treated with FFP at
different concentrations, and the secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (INF-γ) and interleukin 2 (IL-2)
from the cells were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The changes in the phagocytotic activity of mouse
macrophage in response to FFP treatment were evaluated by phagocytosis percentage of chicken red blood cells (CRBCs). The
effect of FFP on the humoral immunity was assessed in mice immunized with sheep red blood cells (SRBCs) by measuring the
serum levels of specific antibody (hemolysin) against SRBCs. Results FFP at the concentrations of 25, 50, and 100 μg/ml all
significantly enhanced the metabolic activity of mouse splenocytes in vitro and increased the production of TNF-α, IFN-γ and
IL-2. FFP treatment also markedly enhanced the metabolic activity of mouse peritoneal exudate cells and TNF-α production
by the cells. At the doses of 25, 50, and 100 mg/kg, FFP significantly increased serum hemolysin level in mice immunized
with SRBCs, and FFP at 50 and 100 mg/kg obviously increased the capacity of mouse peritoneal macrophages in vivo for
CRBC phagocytosis. Conclusion FFP can promote the secretion of TNF-α, IFN-γ and IL-2 by mouse immunocytes and
enhance mouse humoral immune response and the phagocytotic activity of the macrophages.
Key words: Fomes fomentarius; polysaccharides; cytokine; hemolysin; immunomodulation
木蹄层孔菌（Fomes fomentarius L.ex.Fr）为多孔
菌科褐层孔菌属植物的菌体， 多寄生在阔叶树上，资
源丰富。 研究表明，其化学成分为有机酸、糖、多糖及
其苷类、内酯、香豆素及其苷类、植物甾醇、萜类化合
物、 蒽醌及其苷类 ［1］。 有研究报道其乙醇提取物对
S-180荷瘤鼠有很强的抑瘤活性［2, 3］，其甲醇提取物对
小鼠有抗炎和抗伤害性疼痛作用［4］。 但尚未见木蹄层
孔菌多糖（FFP）对免疫功能影响的报道，为此我们对
木蹄层孔菌多糖的免疫作用进行了实验研究，以初步
探讨 FFP的免疫调节作用及其机制。
1 材料与方法
1.1药品与试剂
木蹄层孔菌购于广州市宝芝林大药房； 小鼠
TNF-α、IFN-γ、IL-2 试剂盒， 购于深圳达科为公司，
eBioscience 公司生产；RPMI 1640 培养基，GIBCO 公
司；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；
MTT(噻唑兰)、LPS(细菌脂多糖 )、Con A（刀豆蛋白
A）， Sigma；姬姆氏色素，国药集团化学试剂有限公
司；DMSO、淀粉、氯化钠等均为分析纯；无菌绵羊血，
由南方医科大学实验动物中心提供；灵芝多糖系参照
文献方法［5］提取。
1.2 动物
豚鼠，雄性，体质量（275±25） g；Balb/c 小鼠，昆
明种小鼠，SPF级，雌雄兼用，8~10周龄，体质量（20±2）
g，由南方医科大学实验动物中心提供。
1.3 仪器
南方医科大学学报(J South Med Univ) 2009;29(3)458· ·
连续波长酶标仪（Bio-RAD公司，型号：Benchmark
PlusTM）； 高速冷冻离心机 (美国杜邦公司， 型号 ST-
21)；低速离心机（Ttettich 公司，型号：Universal 16A）；
CO2培养箱（Thermo 公司，型号：5410）；电子天平（上
海上天公司，型号：FA2004）；真空干燥箱（上海博迅
实业有限公，型号：DZF-6050，）。
1.4 木蹄层孔菌多糖的制备
采用水提醇沉法提取木蹄层孔菌中的水溶性多
糖。称取一定量的木蹄层孔菌样品，粉碎后加 10倍体
积水，100 ℃浸提 3 次，时间分别为 3、2、1 h。 合并提
取液并浓缩，4 ℃过夜，4000 r/min 离心 10 min 去渣，
上清加入终浓度为 80%的乙醇沉淀， 沉淀经 Sevage
法脱蛋白后置真空干燥箱（60℃）干燥得 FFP。
1.5对免疫细胞代谢活力及细胞因子产生的影响
1.5.1 小鼠脾细胞悬液的制备 取健康 Balb/c 小鼠两
只，脱颈椎处死，无菌取出脾脏，常规制备脾细胞悬
液，用含 10%新生牛血清 RPMl l640 培养液（以下简
称全培）调整细胞浓度为 8×106/ml，在已加好待测样
品或者对照试剂的 96孔板中每孔加入上述细胞悬液
100 μl。
1.5.2 小鼠腹腔渗出细胞悬液的制备 取健康 Balb/c
小鼠两只，脱颈椎处死，无菌条件下用 8 ml Hanks 液
冲洗腹腔， 收集灌洗液， 室温下 2000 r/min 离心 5
min，用 Hanks液洗 3 遍，计数，用全培调整细胞浓度
为 2×106/mL， 在已加好待测样品或者对照试剂的 96
孔板中每孔加入上述细胞悬液 100 μl。
1.5.3 细胞培养及分组 用全培将 FFP配制成高、中、
低三个浓度， 无菌过滤后在 96 孔板中每孔加入 100
μl，使终浓度为 100、50、25 μg/ml；正常对照组每孔加
入全培 100 μl；LPS 阳性对照组每孔加全培配制的
LPS 100 μl，终浓度为 10 μg/ml；Con A阳性对照组每
孔加全培配制的 Con A 100 μl，终浓度为 4 μg/ml。在
此基础上按 1.5.1 或 1.5.2 准备的细胞每孔加入小鼠
脾细胞或腹腔渗出细胞悬液 100 μl。测定小鼠脾细胞
代谢活力及分泌 IL-2 时，用 Con A做阳性对照；测定
小鼠腹腔渗出细胞代谢活力和分泌 TNF-α 时， 以及
测定小鼠脾细胞分泌 TNF-α、IFN-γ 时， 用 LPS做阳
性对照。 每组设 6个复孔。 将 96孔板置于培养箱中，
在饱和湿度、5%CO2、37 ℃条件下， 根据需要培养相
应的时间。 测定细胞代谢活力时培养 48 h。 测定脾细
胞分泌 TNF-α、IFN-γ、IL-2 时，培养 48 h 后收集培养
上清液用于相应的测定。 测定腹腔渗出细胞分泌
TNF-α时，培养 10 h后收集培养上清液用于测定。
1.5.4 MTT 法检测细胞代谢活力 在细胞培养结束
前 4 h， 于 96 孔板每孔中加入 20 μl MTT 溶液 (5
mg/ml，生理盐水配制)，再继续培养至 4 h，吸弃上清，
每孔加入 DMSO 100 μl，充分振荡混匀 10 min 后，用
全自动酶标仪检测其 570 nm处的吸光度值。 细胞生
长增殖速度加快或细胞代谢旺盛，570 nm 处的吸光
度值均会增加。
1.5.5 TNF-α、IFN-γ和 IL-2检测 依照 1.5.3 中方案，
脾细胞培养 48 h后，腹腔渗出细胞培养 10 h后，分别
每孔取 50 μl细胞培养液上清，用 ELISA方法分别检
测其 TNF-α、IFN-γ和 IL-2含量， 严格按照试剂盒说
明书操作。
1.6 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取昆明种小鼠 50 只，雌雄各半，随机分为 5 组，
即正常对照组、阳性药物（灵芝多糖 100 mg/kg）对照
组，FFP 高、中、低剂量（100，50，25 mg/kg）处理组，每
组 10 只，腹腔注射给药，给药体积为每 10 g 体质量
给 0.1 ml，正常对照组用等体积生理盐水代替，每天
1 次，连续 7 d，停药 24 h 后，每只小鼠腹腔注射 10%
鸡红细胞悬液 1 ml，30 min 后，脱颈椎处死动物 , 按
照文献［6］方法检测腹腔巨噬细胞的吞噬活力。 吞噬
百分率 = 已吞噬鸡红细胞的巨噬细胞总数 / 被检巨
噬细胞总数（200）×100%；吞噬指数 =[（被吞噬的鸡红
细胞总数 /被检巨噬细胞总数（200））/2。
1.7 对小鼠血清溶血素水平的影响
小鼠分组与给药方法同 1.6，给药 2 d 后，各鼠腹
腔注射 20%（v/v）的生理盐水绵羊红细胞 0.2 ml 进行
免疫，同日下午继续给药，每天 1 次，免疫后 d 4(免疫
当天为 d 0)动物摘眼球取血，分离血清，按照文献［7］
方法测定溶血素水平。
1.8 统计分析
结果以均数±标准差表示， 采用 SPSS 11.5 统计
软件中的单向方差分析（One-way ANOVA）法对数据
进行统计分析，以 P<0.05 时，组间差异判断为具有统
计学意义。
2 结果
2.1 FFP 对脾细胞代谢活力及分泌细胞因子 TNF-α、
IFN-γ和 IL-2的影响
由表 1可见，FFP高、中、低浓度（100，50，25 μg/ml)
均可明显促进脾细胞代谢 MTT 活力，促进脾细胞分
泌细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-2， 与对照组比较有统
计学意义（P<0.001, 0.01），且在一定范围内有浓度依
赖趋势。
2.2 FFP 对腹腔渗出细胞代谢活力及分泌 TNF-α 的
影响
由表 2可见，FFP高、中、低浓度（100，50，25 μg/ml)
均可显著增强腹腔渗出细胞代谢 MTT 活力，促进腹
腔渗出细胞分泌 TNF-α， 与对照组比较有统计学意
高慧灵,等.木蹄层孔菌多糖对小鼠免疫功能的影响第 3 期 459· ·
*P<0.05 vs corresponding control group. GLP: Ganoderma
lucidum polysaccharides.
Group Dose(mg/kg) Hemolysin activity(kU/L)
Control -- 23200±7955
FFP 100 36800±14211*
FFP 50 34400±9834*
FFP 25 32400±9131*
GLP 100 35600±11692*
表 4 木蹄多糖（FFP）对小鼠血清溶血素水平的影响
Tab.4 Effects of FFP on the serum level of hemolysin
in mice immunized with sheep red blood cells (n=10)
**P<0.01, ***P<0.001 vs corresponding control group. GLP:
Ganoderma lucidum polysaccharides.
Group Dose(mg/kg) Percentage phagocytosis Phagocytic index
Control -- 24.6±3.6 0.26±0.04
FFP 100 37.2±5.6*** 0.39±0.06***
FFP 50 31.3±4.9** 0.33±0.06**
FFP 25 26.0±3.5 0.28±0.04
GLP 100 35.2±5.1*** 0.38±0.05***
表 3 木蹄多糖（FFP）对小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬功能
的影响
Tab.3 Effects of FFP on the phagocytotic capacity of
mouse peritoneal macrophages in vivo（n=10）
表 2 木蹄多糖（FFP）对小鼠腹腔渗出细胞代谢活力及分
泌 TNF-α 的影响
Tab.2 Effects of FFP on metabolic activity of mouse
peritoneal exudate cells and production of TNF-α by
the cells（n=6）
Concentration Metabolic Activity TNF-α level
(μg/ml) (OD570) (pg/ml)
Control -- 0.1270±0.005 545.9±66.0
FFP 100 0.1515±0.009*** 899.9±118.9***
FFP 50 0.1494±0.010*** 878.8±112.4***
FFP 20 0.1431±0.010** 796.34±92.0***
LPS 100 0.1439±0.009** 651.1±80.0*
*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001 vs corresponding control group.
LPS: lipopolysaccharide
Group
Group Conc.(μg/ml) Metabolic activity(OD570) TNF-α level(pg/ml) IFN-γlevel(pg/ml) IL-2 level(pg/ml)
Control -- 0.2479±0.051 41.26±5.9 211.7±33 0.5007±0.098
FFP 100 0.4487±0.032*** 265.8±44.4*** 547.1±89*** 1.296±0.25***
FFP 50 0.3430±0.032** 90.83±11.4*** 394.2±65*** 0.9910±0.17***
FFP 25 0.3242±0.031** 76.71±11.0*** 360.7±62** 0.8121±0.155**
Con A 4 0.4672±0.056*** -- -- 2.809±0.614***
LPS 10 -- 77.97±8.6*** 465.9±80*** --
表 1 木蹄多糖（FFP）对小鼠脾细胞代谢活力及分泌细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影响
Tab.1 Effects of Fomes fomentarius polysaccharides (FFP) on mouse splenocyte
metabolism and production of TNF-α, IFN-γ and IL-2（n=6）
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs corresponding control group. Conc: Concentration;
Con A: Concanavalin A; LPS: lipopolysaccharide
义（P<0.001, 0.01，0.05），且具有剂量依赖趋势。
2.3 FFP对小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬功能的影响
由表 3 可见，FFP中、高剂量（100,50 mg/kg）可以
明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率
和吞噬指数， 与对照组比较有统计学意义 （P<0.01,
0.001），低剂量(50 mg/kg）可以轻微提高，但无统计学
意义。
2.4 FFP对小鼠血清溶血素水平的影响
由表 4 可见，FFP 高、 中、 低剂量（100，50，25
mg/kg）均可提高小鼠血清溶血素水平，与对照组比较
有统计学意义（P<0.05），且具有剂量依赖趋势。
3 讨论
小鼠脾细胞主要为免疫细胞， 含有 T细胞、B细
胞、巨噬细胞、树突状细胞等，在促有丝分裂剂或免疫
增强剂的作用下会发生增殖反应和细胞因子的分泌，
不同的免疫增强剂所诱导的细胞种类和细胞因子种
类有所不同 ［8］。 MTT 法是通过检测细胞代谢活力而
间接反映细胞增殖程度的常规方法［9］。 本研究采用小
鼠脾细胞体外培养为实验模型，MTT 法作为检测手
段，简单易行，是初步研究免疫调节药物的常用方法。
结果表明木蹄多糖（FFP）能够明显促进脾淋巴细胞
增值，且在一定的范围内有浓度依赖趋势，提示其对
免疫细胞及其功能有直接的调节作用。 接着观察了
FFP对脾细胞分泌细胞因子的影响，发现 FFP可促进
脾细胞分泌细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-2。 由于
TNF-α 主要由单核巨噬细胞分泌，因此，我们观察了
FFP 对小鼠腹腔渗出细胞（主要为巨噬细胞）代谢活
力和分泌 TNF-α的影响， 以初步判断 FFP作用的靶
细胞。结果表明， FFP高、中、低 3个浓度（100，50，25
μg/ml) 均可显著增强腹腔渗出细胞代谢 MTT 活力，
促进腹腔渗出细胞分泌 TNF-α； 整体实验发现 FFP
高、中剂量（100，50 mg/kg）可以明显提高小鼠腹腔巨
噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数；说明巨噬
南方医科大学学报(J South Med Univ) 第 29 卷460· ·
（上接 453页）
中，MRMPI 延迟期均可确切地区分透壁性和非透壁
性增强。透壁增强提示自心内膜至心外膜全层心肌细
胞结构破坏，无存活心肌。非透壁性增强，反映心内膜
下心肌或心内膜下及中层心肌为不可逆性损伤，无增
强的中层心外膜下心肌或心外膜下心肌为存活心肌，
这是 MR 增强扫描的优势。 冠状动脉造影是公认的
检测冠状动脉及其分支狭窄或(和) 阻塞的重要手段，
但不能直接检测微血管损伤和心肌灌注功能,为其不
足之处。 18F-PET(18氟标记脱氧葡萄糖正电子发射计
算机体层摄影术)及 99m锝 SPECT 属心肌代谢和灌注
成像,可直接检测心肌细胞的活性及组织灌注，视为
检测心肌存活的“金标准”。但由于该方法空间分辨率
较低，难以反映心肌梗死的透壁程度为其不足之处。
随着 MR 扫描技术的不断进步， 不仅能够精确
判断梗死心肌的位置，还能够将梗死心肌与正常心肌
明确的区分开来。 尤其 MRMPI可结合形态、功能及
灌注多种方法综合分析检测存活心肌，可清晰显示心
内膜至心外膜间心肌梗死的透壁程度及梗死区存活
心肌的范围等为其优势，对冠心病心肌缺血、梗死病
例的诊断、治疗及预后评估，包括血运重建术适应证
的选择，具有重要意义。
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细胞是 FFP作用的靶细胞之一，FFP可以活化并增强
单核巨噬细胞的功能。
研究免疫药物对体液免疫功能影响时，测定小鼠
溶血素的水平是经典的方法 ［8］。 溶血素实际上就是
IgM，是初次免疫反应的抗体。 在免疫应答中，IL-2可
促使活化的 B 细胞增生和分泌抗体；IFN-γ 是免疫干
扰素，作用广泛，其中之一是促进 B 细胞分化、产生
抗体等，从而促进体液免疫反应［10］。基于以上思路，当
观察到 FFP体外可促进 IL-2、IFN-γ 分泌后， 我们又
从整体水平研究了 FFP 对小鼠产生溶血素的影响。
结果表明，FFP 对绵羊红细胞所致小鼠溶血素（IgM）
的形成有促进作用， 提示其能增强体液免疫功能，其
机制可能与促进 IL-2、IFN-γ分泌有关。
本文对木蹄多糖的免疫调节作用进行了初步研
究，由于采用的是总多糖，其化学结构复杂，而免疫细
胞间、细胞因子间以及免疫应答反应各环节的相互作
用、相互影响亦十分复杂，因此，需要进一步研究其化
学组成及确切的作用机制。
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