全 文 ：食用菌学报 2007.14(3):29 ～ 32
收稿日期:2007-07-26原稿;2007-08-20 修改稿
作者简介:回 晶(1977-), 女 , 2003 年毕业于辽宁师范大学生命科学学院 , 硕士 , 讲师 ,主要从事天然产物的研究 ,
发表主笔论文 6篇。
文章编号:1005-9873(2007)03-0029-04
金耳液体培养过程中几种胞外酶活性的变化规律
回　晶1 , 赵文静2 , 邹志远1 , 张　月1
(1辽宁大学生命科学学院 ,沈阳 110036;2沈阳华润雪花啤酒有限公司检验科 ,沈阳 110021)
摘　要:测定了金耳液体培养过程中 , 培养基中的淀粉酶 、羧甲基纤维素酶 、半纤维素酶 、果胶酶 、邻苯二酚氧
化酶 、愈创木酚氧化酶和漆酶的活性变化规律。结果表明 , 在整个培养期内 , 7 种酶均有活性 , 但活性差异较
大 ,产酶高峰也不尽相同。
关键词:金耳;液体培养;胞外酶活性;高峰期
中图分类号:S567.350.1　　　　文献标识码:A
　　金耳(Tremella aurant ialba)又名橙黄银
耳 、黄金银耳 、脑耳 ,是异担子菌纲(Heterobasi-
diomyce tes), 银 耳目(Tremellales), 银耳科
(Tremellaceae)的名贵食药用真菌[ 1] , 具有止咳
化痰 、补气养心 、平肝健胃等功效 ,主要分布于我
国云贵高原地区。我国从上个世纪八十年代开
始进行金耳野生资源调查及驯化栽培研究[ 2] ,现
已实现了段木和代料栽培及液体发酵培养[ 3-5] 。
本文重点探讨了金耳液体培养过程中 ,培养基中
胞外酶活性的变化规律 ,旨在为其营养生理研究
提供一定的科学依据。
1　材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
金耳(Tremel la aurant ialba)菌株购至东北
食(药)真菌研究所 ,由辽宁大学生命科学学院微
生物实验室保存。
1.1.2 半纤维素制备[ 6]
用4%NaOH 、90 ℃浸泡小麦秸粉2 h ,过滤得
滤液 ,用浓盐酸调 pH 值至 4.5后 ,加入等体积的
乙醇 ,离心得沉淀 ,用无水乙醇洗涤沉淀两次 ,沉淀
于 80 ℃下烘干 ,即得浅黄色 、粉末状的半纤维素。
1.1.3 果胶制备[ 7]
称干燥粉碎(过 100目)的桔皮 40 g ,用盐酸
调 pH 值至 3 ,放于水浴锅中 , 80 ℃下搅拌(每
5 min 1次), 90 min 后过滤除去残渣 ,滤液浓缩
至300 mL后加等体积的 95%乙醇 ,搅拌(5 min),
静置2 h使果胶沉淀析出 ,滤液于 24 ℃、3000 r/min
(750×g)离心 15 min ,除去上清液 ,回收乙醇 ,沉
淀放入干燥箱中干燥 ,得粗果胶。
1.2 培养基
　　麦麸斜面培养基:麦麸 10%,马铃薯20%,蛋
白胨 0.5%,琼脂 2%, pH 自然 。
液体发酵培养基:马铃薯 20%,葡萄糖 2%,
硫酸镁 0.1%,磷酸二氢钾 0.1%,pH 自然。
1.3 培养方法和样品制备
1.3.1 接种母液培养
取培养 6 d的供试菌株斜面 ,轻轻刮下幼嫩
菌丝片段 , 接入液体培养基中(150 mL 三角瓶中
装 80 mL 培养液), 28 ℃、110 r/min恒温振荡培
养 5 d得母液。
1.3.2 菌丝培养
装有 80 mL 液体培养基的 150 mL 三角瓶中
接入母液 ,接种量为 2%, 28 ℃、110 r/min恒温
振荡培养 16 d。
1.3.3 样品制备
每2 d定时取1次发酵液样品 ,4 ℃、3500 r/min
(1000×g)离心10 min ,上清液即为粗酶液。
1.4 酶活性测定
1.4.1 淀粉酶活性测定
试管中加入 0.5%的可溶性淀粉(国产AR)溶
液(用 pH 5.8 、0.1M 乙酸盐缓冲液配制)1.5 mL ,
加稀释 10倍的粗酶液 0.5 mL 混匀 ,38 ℃水浴准
食　用　菌　学　报 第 14 卷
确保温 30 min ,取出后立即加入按文献[ 8]的方法
配制的 DNS试剂 1.5 mL ,煮沸5 min ,取出 ,冷却
后加入蒸馏水 21.5 mL ,混匀 , 722型紫外可见分
光光度计(中国上海)测520 nm处的 OD值;以煮沸
15 min灭活的酶液作对照 ,每组 3个重复;酶活性
以样品与底物反应 30 min 后光密度的改变值
表示。
1.4.2 羧甲基纤维素酶活性测定
试管中加入 0.5%的羧甲基纤维素钠(国产
AR)溶液(用 pH 4.6 、0.1M 柠檬酸盐缓冲液配制)
1.5 mL ,加稀释10倍的粗酶液 0.5 mL ,50 ℃水浴
准确保温 30 min ,其后操作同淀粉酶活性测定。
1.4.3 半纤维素酶活性测定
试管中加入 0.5%的小麦秸半纤维素溶液
(用 pH 4.6 、0.1M 乙酸盐缓冲液配制)1.5 mL ,
加稀释 10倍的粗酶液 0.5 mL , 50 ℃水浴准确保
温 30 min ,其后操作同淀粉酶活性测定 。
1.4.4 果胶酶活性测定
试管中加人 1%的果胶溶液(用 pH 4.5 、0.1
M 乙酸盐缓冲液配制)1.5 mL ,加稀释10倍的粗
酶液 0.5 mL ,于 50 ℃反应 30 min ,其后操作同
淀粉酶活性测定。
1.4.5 漆酶活性测定
试管中加入 3.36 mM 的邻联甲苯胺(国产
AR)溶液 0.5 mL , 0.1 mo l/L 醋酸盐缓冲液(pH
4.6)3.4 mL 和稀释 10倍的粗酶液0.1 mL ,反
应液 28 ℃保温 30 min 后 ,立即用 722型紫外分
光光度计于 600 nm 处测光密度值 。酶活单位以
反应前后 OD值的变化表示 。
1.4.6 邻苯二酚氧化酶活性测定
试管中加入 0.1mM 的邻苯二酚(国产 AR)
溶液 2.0 mL , 0.05 mo l/L 磷酸盐缓冲液(pH
6.0)2.0 mL 和稀释 10 倍的粗酶液 0.1 mL ,反
应液 28 ℃保温 30 min 后 ,立即用 722型紫外分
光光度计于 400 nm 处测光密度值 。酶活单位以
反应前后 OD值的变化表示。
1.4.7 愈创木酚氧化酶活性测定
试管中加入 80 mM 的愈创木酚(国产 AR)
溶液 0.5 mL , 0.1 mol/ L 醋酸盐缓冲液(pH
4.6)3.0 mL 和稀释 10倍的粗酶液 0.5 mL ,反
应液 28 ℃保温 30 min 后 ,立即用 722型紫外分
光光度计于 490 nm 处测光密度值 。酶活单位以
反应前后 OD值的变化表示。
2　结果与分析
2.1 淀粉酶 、CMC酶 、半纤维素酶和果胶酶的活性
　　金耳液体发酵培养过程(16 d)中 ,发酵液中
的淀粉酶 、CMC 酶 、半纤维素酶和果胶酶的活性
变化见图 1 。
由图 1 可以看出 ,在整个发酵试验期内 , 淀
粉酶 、CMC 酶 、半纤维素酶和果胶酶均有活性 。
其中半纤维素酶活性高峰出现最早 ,在发酵培养
的第 2天 ,淀粉酶 、CMC 酶和果胶酶活性高峰出
现在发酵培养的第 4天 。淀粉酶的活性最高 ,表
明金耳菌丝在发酵培养过程中利用率较高的是
淀粉类物质 ,这可能与培养基中含有大量的淀粉
酶诱导物有关 。CMC 酶和果胶酶活性较淀粉酶
和半纤维素酶低。
图 1　金耳液体培养过程中淀粉酶 、CMC酶 、半纤维素酶和果胶酶活性的变化
Fig.1　Changes in amylase , carboxymethyl cellulase, hemicellulase and pectinase levels during submerged
culture of Tremella aurantialba
2.2 愈创木酚氧化酶 、邻苯二酚氧化酶和漆酶的活性
　　金耳液体发酵培养过程(16 d)中 ,发酵液中
的愈创木酚氧化酶 、邻苯二酚氧化酶和漆酶的活
性变化见图 2。
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第 3 期 回　晶 , 等:金耳液体培养过程中几种胞外酶活性的变化规律
图 2　金耳液体培养过程中愈创木酚氧化酶 、邻苯二酚氧化酶和漆酶活性的变化
Fig.2　Changes in guaiacol oxidase, catechol oxidase and laccase levels during submerged
culture of Tremella aurantialba
　　由图 2可以看出 ,在整个发酵试验期内 , 愈
创木酚氧化酶 、邻苯二酚氧化酶和漆酶均有活
性。愈创木酚氧化酶和漆酶的活性高峰均出现
在发酵培养的第 8天 ,愈创木酚氧化酶活性在发
酵培养的第 14 天又出现了一个小高峰 ,而漆酶
在第一个活性高峰后先下降 ,之后又开始攀升 ,
至发酵培养第 16 天最后一次取样时 ,它的活性
仍在上升 。邻苯二酚氧化酶的活性高峰出现的
最晚 ,在发酵培养的第 14天 。
3　讨论
　　本试验结果发现 ,愈创木酚氧化酶 、邻苯二
酚氧化酶和漆酶的活性高峰均是在淀粉酶 、CMC
酶 、半纤维素酶和果胶酶活性降到很低时才出现
的 ,这说明金耳是先利用非木质纤维素类物质后
利用木质纤维素类物质 ,这与文献中报道的漆
酶 、过氧化物酶和多酚氧化酶均参与木质纤维素
的分解[ 9-12]的结论一致 。
金耳出现两次漆酶和愈创木酚氧化酶的活
性高峰 ,推测金耳在生长过程中分泌的胞外漆酶
和愈创木酚氧化酚中可能含有同工酶(这两种酶
的产酶曲线极其相似),而两者对于分解木质纤
维素是否有某种协同作用 , 这有待进一步的
研究 。
本研究发现 ,金耳的酶活性与金针菇和平菇
的酶活性 [ 13-15]有类似之处 ,即在菌丝生长过程中
对于木质纤维素的利用要比非木质纤维素类物
质晚 。在金耳菌丝生长发育的前期 ,对淀粉类非
木质纤维素的利用能力较强 ,以致消耗过多 ,到
后期几乎没有被利用 ,从而进一步说明 ,金耳菌
丝生长的前期主要利用淀粉作碳源。
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[本文编辑] 　宋凤菊
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食　用　菌　学　报 第 14 卷
Changes in Extracellular Enzyme Activities Dur ing
Submerged Culture of Tremella aurantialba
HUI Jing , ZHAO Wenjing , ZOU Zhiyuan , ZHANG Yue
(1College of Lif e Sciences , Liaoning University , Shenyang , Liaoning 110036 , China;
2Depar tment of Inspection , Liaoning Resources Brewer ies Co., Ltd , Shenyang , Liaoning 110021 , China)
Abstract:Changes in the extr acellular levels of amylase , carboxymethyl cellulase , hemicellulase , pec tinase ,
guaiacol oxidase , catechol oxidase and laccase activities dur ing subme rged cultur e of Tremella aurantialba
were de term ined.All the enzymes were present at de te ctable levels throughout the cultur e per iod but r eached
peak levels at diff erent times.
Key words:Tremella aurantialba ;Submerged cultur e;Extr acellula r enzyme activity;Peak stage
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