全 文 ：水分胁迫下钙 、钙调素对小麦幼苗生长
及过氧化物酶同工酶的影响
谷俊涛1 , 郭秀林2 , 李广敏2 , 崔四平2 , 张荣芝1
(1.河北农业大学生物技术中心 , 河北保定 071001;
2.河北省农林科学院农业物理植物生理生化研究所 , 河北 石家庄 050051)
摘要:以丰抗 8号冬小麦幼苗为材料 , 研究了水分胁迫下 Ca2+和钙调素(CaM)对叶片和根系过
氧化物酶(POD)同工酶的影响。结果表明 , Ca2+/CaM 作为第二信使参与了干旱信号的传导 , 同
时提高了 POD 同工酶活性 、 增强了小麦幼苗适应旱胁迫的能力 , 并存在明显的剂量效应。在多
种逆境信使系统中 , POD同工酶基因可能优先感受 Ca2+/CaM 信使系统传导的干旱信号。小麦
幼苗不同器官之间存在着干旱信号相互传递。与叶片相比 , 根系 POD 同工酶基因感受干旱信号
的能力更强。
关键词:小麦;水分胁迫;干旱信号;Ca2+/ CaM;过氧化物酶同工酶
中图分类号:S512.101 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2001)03-0062-06
植物在逆境条件下基因表达的改变通过逆境信使传导逆境信号得以实现。干旱信号传导
的研究日益被国内外科技工作者所关注 , 并将是今后生物技术研究领域的重点之一〔1 ,2〕 。研
究表明 , 信使系统有胞间第一信使和胞内第二信使。目前 , 有关第一信使与干旱诱导蛋白 、
生理代谢的关系研究较多〔3 ,4〕 , 而 Ca2+ 、 CaM 作为第二信使对抗旱有关的基因表达及生理
代谢的影响报道不多 。干旱信号诱导有关基因表达 , 产生一类解毒酶(Detoxification En-
zymes),即保护酶〔5〕 。这类酶有利于清除干旱胁迫下细胞产生的毒性物质 , 如活性氧(Acti-
vated Oxygen AO)。POD是植物细胞内一种重要保护酶 , 对清除干旱胁迫和其他逆境中细胞
产生的活性氧具有重要作用〔6 , 7〕 。本研究通过用不同浓度 Ca2+和 CaM 活性抑制剂 TFP 处理
小麦幼苗 , 较系统地研究了干旱胁迫下小麦幼苗 POD同工酶的蛋白质组分和活性变化 , 以
探讨水分胁迫下信使系统与 POD同工酶基因表达的内在联系 , 旨在为干旱信号传递及植物
抗旱生理的深入研究奠定基础 。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为冬小麦(Tri ticum aestivum)品种丰抗 8号(河北省农科院理化所提供)。小麦
种子经 0.1%HgCl2消毒 10 min , 用无离子水反复漂洗干净 , 25 ℃培养箱黑暗催芽 。露白
后选取发芽一致的种子 , 腹沟朝下均匀排在白瓷盘尼龙网上 , 光下进行水培。培养和处理期
收稿日期:2000-03-08
作者简介:谷俊涛(1967-),男 , 助研 , 农学硕士 , 主要从事小麦抗旱育种研究和植物生理教学工作。
华北农学报 2001 , 16(3):62～ 67
Acta Agriculturae Boreali-Sinica
间保持种子与水培液面接触 , 每天光照 14 h , 温度为 25 ℃/21 ℃。6 d后换 Hoagland 完全
培养液 , 隔天换液。
1.2 方法
1.2.1 不同浓度 Ca2+处理 待小麦长到二叶一心期 , 用不同浓度 Ca2+处理 。幼苗适应 4 d
后 , 用 PEG-6000胁迫处理 , 使溶液渗透势达-1.0 MPa。(1)Ca1处理 [ Ca2+=0(无钙)] ,
培养液中不加 CaCl2 ,用 3 mmol/L EGTA保证细胞外无Ca2+;(2)Ca2处理 [ Ca2+=5 mmol/
L(正常钙)] :培养液中加入 CaCl2 0.555 g/L ;(3)Ca3处理 [ Ca2+=20 mmol/L(高浓度钙)] :
培养液中加入 CaCl2 2.22 g/L。
1.2.2 不同浓度 TFP 处理 在正常 Hoag land培养液中用钙调素(CaM)专一抑制剂 TFP 加
PEG进行干旱胁迫处理。各处理渗透势均调整为-1.0 MPa 。(1)T0处理 [ TFP=0 μmol/
L] ;(2)T1处理 [ TFP=30μmol/L(低浓度)] ;(3)T2处理 [ TFP=70μmol/L(高浓度)] 。
1.3 测定指标
于各处理 0 , 12 , 24 , 36 , 48 , 72 , 96 h后分别取样测定所需指标。
1.3.1 相对含水量 取小麦幼苗根系和第一真叶 , 称重法测定 。
1.3.2 过氧化物酶(Peroxidase POD)同工酶的电泳分析 (1)同工酶提取 分别选取不同处
理时期幼苗根系和第一叶片 0.1 g 速冻保存备用 。测定时 , 将材料放入冰浴的研钵中 , 加入
1.0 mL 预冷的提取液(0.1 mol/L Tris-HCl ,pH 值 8.0),充分研磨后 , 4 ℃10 000 r/min离心
20 min , 取上清液与等量的 40%蔗糖混合 , 混合后的酶液用于电泳;(2)电泳 采用聚丙烯
酰胺凝胶电泳法 , 用北京六一仪器厂生产的 ECP3000型稳压电泳仪和垂直板双电泳槽进行 。
浓缩胶浓度 3.5 %, 分离胶浓度 6.5 %, 电极缓冲液为 pH 值 8.3的 Tris-甘氨酸缓冲液 。
在 4 ℃下进行电泳 , 开始电压为 90 V , 30 min后为 140 V , 电泳 4 h 。胶板染色采用联苯胺
染色法;(3)电泳胶板扫描 用 CS-9000 薄层扫描仪进行电泳胶板扫描 , 吸收波长为 370
nm , 参考波长为 470 nm 。扫描曲线的峰数表示同工酶的谱带数(即不同分子量的酶蛋白),
每条酶带的曲线峰面积值表示酶的活性 , 以取样时间为横坐标 , 曲线峰面积值为纵坐标作
图。
2 结果与分析
2.1 不同浓度钙离子处理对小麦幼苗生长及 POD同工酶的影响
2.1.1 对小麦幼苗含水量的影响 从图 1可见 , 用不同浓度钙离子处理 , 小麦叶片含水量
相近 , 且处理期间基本保持在 89.0%左右 。表明旱胁迫下 Ca2+对叶片含水量影响较小 。随
着胁迫时间的延长 , 不同处理的根系含水量均呈下降趋势 , 其中 48 h之前根系含水量下降
缓慢 , 48 h以后下降较快 。不同浓度相比 , 高浓度钙处理根系含水量下降较慢 。96 h时无
钙 、 正常钙和高浓度钙处理根系含水量分别为 70.53%, 73.46%和 77.88%。表明 , 高浓度
钙处理在胁迫后期能维持较高的根系含水量 , 使小麦幼苗适应旱胁迫的能力增强。
2.1.2 对小麦幼苗 POD同工酶的影响
(1)对根系 POD同工酶的影响 干旱胁迫下 , 无钙处理后根中 POD同工酶开始是 4条
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图 1 不同钙离子浓度对小麦幼苗含水量的影响
酶带 , 三弱一强 , 处理 12 h时各酶带活性有所升高 , 36 h 时主带活性最高 , 96 h时变为 3
条酶带且活性减弱;正常钙处理后根中 POD同工酶开始是 4条酶带 , 处理前期酶活性增强 ,
处理 36 h时 , 主带活性最高 , 处理 96 h时减为 3条酶带 , 各酶带的活性减弱 , 且程度较无
钙处理低;高钙处理旱胁迫后 , 一直保持 4条酶带 , 各酶带尤其主带活性一直保持较高 , 胁
迫期间酶的活性高于正常钙处理。上述结果表明 , 干旱胁迫后 , 不同浓度 Ca2+处理对根系
POD同工酶活性和组分有一定的影响(图 2)。
a:Ca1处理 b:Ca2处理 c:Ca3处理(下同)
图 2 水分胁迫条件下 , 不同浓度钙离子加旱胁迫处理对小麦幼苗根系 POD同工酶的影响
(2)对叶 POD同工酶的影响 干旱胁迫时 , 无钙处理在处理 48 h 之前一直是 3条酶带 ,
72 h以后减为2条 , 各时期均有 1条主带 , 测定期间该主带活性略有增加 , 但变化不大;正
常钙处理 POD同工酶开始是 3条酶带 , 其中一条主带 , 36 h时有一弱带出现 , 48 h以后又
减为 3条 , 主带活性在处理 12 h时有所升高 , 以后保持平稳;高钙处理 , 12 h后 POD同工
图 3 水分胁迫条件下 , 不同浓度钙离子加旱胁迫处理对小麦幼苗叶片 POD同工酶的影响
酶带由 3条增至 4条 , 96 h 时减为 3条 , 主带活性在处理期间略有增加。与正常钙处理相
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比 , 高钙处理后叶片 POD不仅主带活性较强 , 且增加的酶带活性也相对较强(图 3)。上述
结果与根系相似 。
上述结果表明 , 不同浓度 Ca2+处理能不同程度地影响根系和叶片 POD同工酶活性和组
分 , 且Ca2+浓度越大 , 组分越复杂 , 酶活性越强。
2.2 不同浓度 TFP处理对小麦幼苗生长及 POD同工酶的影响
2.2.1 对小麦幼苗含水量的影响 干旱胁迫下 , 不同浓度 TFP 处理叶片含水量变化较小 ,
而根系含水量随着胁迫时间的延长呈持续下降趋势 , TFP 浓度越高 , 开始迅速下降的时间
越早 , 下降幅度越大。 96 h 时 , 高 、 低 、 0 TFP 处理的根系含水量分别变为 43.12%,
58.56%和 73.52%(图 4)。
图 4 不同浓度 CaM抑制剂 TFP 对小麦幼苗含水量的影响
2.2.2 对小麦幼苗 POD同工酶的影响
(1)对根 POD同工酶的影响 旱胁迫处理下 , 0 TFP 处理根中 POD同工酶开始是 4条
酶带 , 处理前期酶活性较强 , 36 h时主带活性最高 , 96 h 时减为 3条酶带且各酶带的活性
减弱;低浓度 TFP(T1)处理 , 根中 POD同工酶没有新酶带产生 , 胁迫期间保持 4 条酶带 ,
各酶带的活性始终保持较高水平 , 各条弱带随着胁迫时间的延长活性变化较小;高浓度
TFP(T2)处理 , 根中 POD 同样没有新的酶带产生 , 与低浓度 TFP 和 0 TFP 处理相比 ,
POD活性保持稳定 , 72 h后各酶带的活性减弱程度较低 。干旱胁迫下 , TFP 处理主要影响
POD同工酶活性 , TFP 浓度越大 , 酶活性变化幅度越小 。二者呈显著负相关(图 5)。
a:T0处理 b:T1处理 c:T2处理(下同)
图 5 水分胁迫条件下 , 不同浓度 TFP 加旱胁迫处理对小麦幼苗根系 POD同工酶的影响
(2)对叶 POD同工酶的影响 干旱胁迫下 , 0 TFP 处理叶片 POD同工酶开始是 3条
酶带 , 一条强带 , 36 h时有一弱带出现 , 48 h以后又减为 3条酶带;T1处理和 T2 处理开
始时均为 3条酶带 , 干旱胁迫期间酶带数量和活性变化不显著(图 6)。与根系相比 , 叶片
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POD同工酶的基因表达能力受到干旱胁迫的影响较小 。这可能是因为叶片并非像根系那样
直接处于干旱逆境下 , 叶片受逆境的伤害程度相对较小 , 另外 , 叶片较根系具有更复杂的信
号传导和生理调节机制。前人在玉米研究中已有类似报道〔8〕。
图 6 水分胁迫条件下 , 不同浓度 TFP 加旱胁迫处理对小麦幼苗叶片 POD同工酶的影响
3 讨论
目前 , 对干旱信号研究的重点是结合基因工程和分子生物学方法 , 利用转基因植物 , 深
入研究信号传导链 、 基因表达 、 生理适应的分子作用机制〔2 , 9〕 。其中 , Ca2+和 CaM 组成的
胞内第二信使系统为重点之一 。Ca2+通过在胞液内的浓度变化 , 把胞外信息传递给受体 ,
CaM 作为 Ca2+的一种主要受体 , 进一步传递信息 , 引起基因表达〔1〕 。POD为基因表达产
物 , 以 POD作为生化标记已广泛应用于材料的抗病 、 抗旱 、纯度鉴定等研究 , 对 POD同工
酶的编码基因也有所确定〔10〕 , 但对其受何信使系统制约及接受信号后如何表达尚未见报道 。
本试验初步确定了小麦幼苗 Ca2+-CaM 信使系统与 POD同工酶的关系 , 研究结果表明:干
旱胁迫下 , Ca2+处理使小麦幼苗叶片和根系 POD同工酶活性提高 , 组分增加 , 且 Ca2+浓度
越高 , 同工酶活性提高越显著 。说明 Ca2+在传递干旱信号 、 诱导 POD同工酶基因表达的过
程中具有重要作用。无 Ca2+处理时小麦幼苗叶片和根系 POD同工酶活性也有所提高 , 说明
无Ca2+信使时 , POD同工酶基因也感受到了其他信使系统传递的干旱信号 , 但该信使系统
的组成 、 作用机制 、 与 Ca2+-CaM 信使系统的关系如何 , 及基因接受信号后如何表达还有
待深入研究 。TFP 浓度越大 , POD同工酶活性及组分变化程度越小 , 表明 CaM 失活后 , 干
旱信号的传导受到限制。前人已有报道 , 干旱胁迫下 , CaM 失活后 , SOD 的活性没有变
化〔11〕。本研究从 POD同工酶的角度 , 证实了 CaM 作为第二信使 , 通过传递干旱信号对
POD同工酶基因的表达具有重要调节作用 。
本试验只对一个小麦品种幼苗进行了研究 , 还不能作出逆境下诱发蛋白新组分是否与酶
活性乃至抗旱性有关的全面评价。不同品种 、 不同时期干旱胁迫下 POD同工酶基因表达特
点可能有所不同 , 今后应开展同类研究 , 以进一步确定干旱诱导 POD同工酶蛋白组分的差
异 , 进而探讨诱导新蛋白与抗旱的相关性。这对于植物抗旱生理的深入研究具有重要意义。
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The Effects of Ca2+ and CaM on Growth and Peroxidase
Isoenzymes of Winter Wheat Seedling Under Water Stress
GU Jun-tao1 ,GUO Xiu-lin2 , LI Guang-min2 ,CUI Si-ping2 , ZHANG Rong-zhi1
(1.Bio technology Center of Hebei Agricultural University , Baoding Hebei 071001 , China;
2.Agro-phy sics , Plant Phy siology and Biochemistry Institute , Hebei Academy of Agricultural and
Forestry Sciences , Shijiazhuang Hebei 050051 , China)
Abstract:The ef fects of Ca2+/CaM on grow th and POD isoenzymes of w inter w heat (cv .w inter
No.8 fengkang)seedlings under water stress were studied.The results show ed that Ca2+/CaM , as
the second messengers , played important roles in t ransducting drought signal.They no t only in-
creased the activities of POD isoenzymes ,but also enhanced the adaptability of w heat seeding s to
drought.The effects w ere positive proportion to the Ca2+ concentration.Among drought signal
sy stems , POD isoenzyme genes were possibly more sensi tive to drought signal transfered by Ca2+/
CaM messengers.The drought signal could be transducted among the different org ans of w heat
plant.Compared to leaves ,POD isoenzyme genes in roots had higher adaptability to water st ress.
Key words:Wheat;Water st ress;Drought signal;Ca2+/CaM ;POD isoensyme
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