全 文 ：食用菌学报 2010.17(3):51 ～ 54
收稿日期:2010-07-16原稿;2010-08-24 修改稿
基金项目:福建省教育厅科技项目(编号:JA08159)的部分研究内容
作者简介:张丹凤(1979-), 女 , 2007 年毕业于厦门大学生命科学学院 ,博士 , 讲师 ,研究方向为微生物 , 在学报级刊
物上发表主笔论文 4篇 。　E-mail:zh danfeng@163.com
文章编号:1005-9873(2010)03-0051-04
白背毛木耳胞内多糖的提取与纯化
张丹凤1 , 郑仕栋1 , 陈国平2 , 郑丽珠1 , 潘裕添1
(1漳州师范学院生物科学与技术系 ,福建漳州 363000;2漳州市农业局种植业管理站 ,福建漳州 363000)
摘　要:通过正交试验确定了白背毛木耳(Auricularia poly tricha)43-26 液体发酵培养基的最优配方(g/ L):
土豆 20、玉米粉 20、蛋白胨 10 和磷酸二氢钾 5;利用超声波辅助水提醇沉法提取胞内粗多糖 , 多糖含量为
75.5%;多糖粗提物经 DEAE-52 纤维素离子交换层析和 Sephadex G-200层析分离纯化 ,分别得到 4 个相对均
一的纯多糖组分 AP1 、AP2 、AP3 和 AP4。
关键词:白背毛木耳 43-26;胞内多糖;提取;纯化
　　白背毛木耳(Auricularia poly tricha)属于
真菌门担子菌纲银耳目黑木耳科黑木耳属[ 1] ,其
子实体质地脆滑 ,营养丰富 ,药理作用与毛木耳
相近 ,其多糖具有抗凝血 、降血脂 、增强免疫功能
和抗肿瘤等作用[ 2 , 3] 。目前国内外对白背毛木耳
的研究主要集中在栽培技术方面 ,而对其多糖的
研究较少 。利用液体深层发酵培养菌丝体并提
取多糖等生物活性物质具有培养周期短 、能大规
模生产 、易于标准化等特点 ,因此 ,笔者对漳州市
白背毛木耳当家品种 43-26进行液体发酵培养 ,
对提取的胞内粗多糖进行纯化 ,为白背毛木耳
43-26多糖的精深加工提供参考。
1　材料与方法
1.1 材料
　　白背毛木耳(A.polytricha)43-26菌种由原
三明真菌研究所吴淑珍老师惠赠 。
1.2 方法
1.2 .1 液体菌种的制备
　　挑取 4 ℃保存的白背毛木耳 43-26 菌块
(2 cm ×2 cm)转接于 PDA斜面 , 28 ℃培养10 d ,
取 6块 0.5 cm×0.5 cm 大小的菌块接于 PD液
体培养基中 ,28 ℃,120 r/min 振荡培养 7 d后得
液体菌种[ 4] 。
1.2 .2 发酵培养基的优化
　　按正交表(表 1)配制液体发酵培养基 ,土豆
和玉米粉文火煮沸 30 min , 8层纱布过滤 ,取滤
液 ,添加相应量的蛋白胨和磷酸二氢钾 , 500 mL
三角瓶装 150 mL 培养基 , 121 ℃灭菌 30 min ,
接入 10%的液体菌种 , 28 ℃,120 r/min振荡培
养 7 d 。
表 1　正交因素水平表
Table 1　Factors and levels of the orthogonal test
水平
Level
因素 Factor(g/ L)
A 土豆
Potato
B玉米粉
Corn powder
C 蛋白胨
Peptone
D 磷酸二氢钾
KH2PO4
1 15 0 10 1.5
2 20 10 20 5.0
3 25 20 30 8.5
1.2 .3 胞内多糖的提取[ 5 ～ 7]
　　取白背毛木耳 43-26发酵液 ,过滤 ,菌丝体用
蒸馏水洗涤后用超声波(1 600 W , JY99-2D 超声
波细胞粉碎机)破碎 40 min ,工作时间 10 s ,间歇
时间 10 s ,按照蒸馏水和菌丝体 20∶1的质量比加
入蒸馏水 ,在 100 ℃水浴中浸提2 h ,7 500 g ,4 ℃
离心 5 min ,收集上清液 ,旋转蒸发浓缩至原体积
的 30%,加无水乙醇至浓度为 85%, 4 ℃静置过
夜 , 9 000 g离心 15 min ,收集沉淀 ,加适量的超
纯水溶解沉淀 ,多次加入等体积的氯仿-异戊醇混
合液(氯仿∶异戊醇体积比为4∶1)至无白色沉淀 ,
9 000 g离心 5 min ,收集上清液 , 4 ℃在蒸馏水里
透析(MD34 ,3 500)2 d ,冷冻干燥后得白背毛木
食　用　菌　学　报 第 17 卷
耳 43-26胞内粗多糖 ,计算不同配方每升发酵液
的多糖得率 ,其中最优配方提取得到的粗多糖用
于以下实验。
1.2 .4 多糖含量测定
　　采用蒽酮-硫酸法测定多糖含量 ,用葡萄糖制
作标准曲线[ 8] 。
1.2 .5 DEAE-Cellulose 52柱层析
　　将处理好的 DEAE 纤维素装入玻璃层析柱
(1.6 cm ×40 cm),装填高度为柱高的 4/5 。用
0.02 mol/L pH 7.2 Tris-HCl缓冲溶液平衡 5 h
后 ,取 60 mg粗多糖上样 。先用 3 倍柱体积缓冲
溶液进行洗脱 ,洗脱速度为 0.2 mL/min ,每管
3 mL ,收集洗脱液 ,减压浓缩至 30 mL ,在蒸馏水
中 4 ℃透析 24 h ,真空冷冻干燥得 Tris-HCl洗脱
多糖 。然后用 0.5 ～ 0.7 mol/L NaCl溶液进行
梯度洗脱 ,洗脱速度为 0.2 mL/min ,每管 3 mL ,
蒽酮-硫酸法检测收集 ,按上述方法浓缩 、透析 、干
燥得 NaCl洗脱多糖[ 9 ～ 11] 。
1.2 .6 Sephadex G-200柱层析
　　将处理好的 Sephadex G-200 装入玻璃层析
柱(1.6 cm ×40 cm),装填高度为柱高的 4/5 ,用
0.02 mol/ L NaCl缓冲溶液(pH 7 .0)平衡 5 h ,
T ris-HCl洗脱多糖上样量为 15 mg ,NaCl洗脱多
糖上样量为 45 mg 。用 0.02 mol/ L NaCl缓冲溶
液洗脱 ,洗脱速度为 0.1 mL/min ,每管 3 mL ,蒽
酮-硫酸法检测收集洗脱峰 ,按 1.2 .5 中方法浓
缩 、透析 、干燥得纯化的多糖。取 15 mg 纯多糖
样品按上述操作分别上样于 Sephadex G-200层
析柱 ,检验其纯度。
1.2 .7 聚丙烯凝胶电泳鉴定多糖的纯度
　　聚丙烯酰胺凝胶的浓度为 7.5 %,电泳缓冲
液为 pH 9 .0硼砂缓冲液 ,样品浓度为 3.0%,每
个样品进样 25 μL ,电压 110 V ,电泳 2 h 。电泳
结束后用 0 .2%麝香草酚浸泡凝胶 10 min , 80%
浓硫酸进行显色[ 12] 。
2　结果与分析
2.1 液体发酵培养基的优化
　　白背毛木耳 43-26液体菌种在各发酵培养基
中发酵培养 7 d 后培养液清澈透明 ,其中悬浮着
大量的小菌丝球。由表 2 可看出 , 4 个因素对每
升发酵液提取胞内粗多糖得率的影响大小依次
为:玉米粉(B)>磷酸二氢钾(D)>蛋白胨(C)>
土豆(A)。培养基配方的最优组合为 A 2 B3 C1
D2 ,即培养基配方为(g/L):土豆 20 、玉米粉 20 、
蛋白胨 10 、磷酸二氢钾 5。
表 2　正交试验结果
Table 2　Orthogonal test results
试验号
No.
A B C D 粗多糖
得率 Yield(g/ L)
1 1 1 1 1 0.451
2 1 2 2 2 0.583
3 1 3 3 3 0.624
4 2 1 2 3 0.400
5 2 2 3 1 0.486
6 2 3 1 2 0.990
7 3 1 3 2 0.467
8 3 2 1 3 0.540
9 3 3 2 1 0.545
K1 0.553 0.439 0.660 0.476
K2 0.625 0.536 0.510 0.680
K3 0.517 0.720 0.519 0.521
R 0.108 0.281 0.15 0.204
2.2 多糖含量
　　利用蒽酮-硫酸法制作的葡萄糖标准曲线回
归方程为 y =5.4357x+0.0015(R2 =0 .9992),计
算最优配方提取得到的粗多糖中多糖含量为
75.5%, 因此还需要进一步对该粗多糖进行
纯化 。
2.3 DEAE-Cellulose 52柱层析
　　大多数情况下 ,多糖分子带有负电荷 ,所以
本研究利用 DEAE-Cellulose 52作为分离介质对
白背毛木耳 43-26胞内粗多糖进行初步纯化 。用
T ris-HCl缓冲溶液进行洗脱 ,收集得到 T ris-HCl
洗脱多糖 ,再通过 0.5 ～ 0.7mol/L N aCl溶液进
行梯度洗脱 ,获得 NaCl洗脱多糖 ,结果如图 1 所
示 ,共得到 1 个洗脱峰 ,收集主峰部分进行进一
步的纯化 。
图 1　NaCl洗脱粗多糖 DEAE-Cellulose 52 的柱层析图
Fig.1　Elution of crude polysaccharide fraction from a
DEAE-Cellulose 52 chromatography column with NaCl
52
第 3 期 张丹凤 , 等:白背毛木耳胞内多糖的提取与纯化
2.4 Sephadex G-200柱层析
2.4 .1 Tris-HCl洗脱多糖 Sephadex G-200柱层析
　　将经 DEA E-Cel lulo se色谱柱用 Tris-HCl洗
脱得到的多糖上进行 Sephadex G-200柱层析 ,用
0.02 mol/ L NaCl 洗脱 ,结果见图 2。 Tris-HCl
洗脱多糖出现 2个洗脱峰 ,均为单一对称峰 ,分
别收集主峰部分 ,按 1.2.5 中方法透析 、冻干得
白背毛木耳 43-26多糖 AP1(第 1个峰的组分)和
AP2(第 2个峰的组分)。
图 2　Tris-HCl洗脱多糖 Sephadex G-200 层析图
Fig.2 Sephadex column chromatography of a polysaccharide
fraction eluted from a DEAE-Cellulose 52 column with
Tris-HCl buffer
2.4.2 NaCl洗脱多糖Sephadex G-200柱层析纯化
　　用 DEAE-Cellulose 层析柱分离得到的 NaCl
洗脱多糖经Sephadex G-200层析柱分离后也分
离为 2个组分 ,根据洗脱峰出现顺序分别命名为
AP3和 AP4(图 3)。
图 3　NaCl洗脱多糖 Sephadex G-200 柱层析图
Fig.3　Sephadex lycolumn chromatography of a
polysaccharide fraction eluted from a DEAE-Cellulose
52 column with NaCl
2.5 多糖的纯度鉴定
2.5 .1 Sephadex G-200柱层析验证
　　上述分离收集得到的 A P1 、AP2 、AP3 和
AP4再次经过 Sephadex G-200层析柱时都出现
左右对称的单一洗脱峰(图 4),这表明 , AP1 、
AP2 、AP3和 AP4可能是单一均匀组分 。
图 4　多糖 AP1 、AP2 、AP3、AP4 的 Sephadex G-200 柱层析图
Fig.4　Separation of partially purified polysaccharide fractions AP1 , AP2 , AP3 and AP4 by
Sephadex G-200 column chromatography
2.5 .2 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
　　对 AP1 、AP2 、AP3和 AP4 进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳 ,结果表明 ,4 种组分均出现单一条带 ,
表明它们是相对均一的纯多糖(图 5)。
53
食　用　菌　学　报 第 17 卷
图 5　AP1、AP2 、AP3 和 AP4 聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig.5　Polyacrylamide gel electrophoresis profiles
of fractions AP1 , AP2 , AP3 and AP4
3　讨论
　　通过深层发酵法获得的食用菌菌丝体活性成
分的生理作用与子实体相似 ,其发酵产物直接作为
食品还未被人们接受 ,但是它的加工产品 ,如药品
和保健品已逐渐被人们所接受[ 2 , 13 , 14] 。本实验通
过正交试验确定了白背毛木耳 43-26发酵培养基
配方的最优组合 ,采用超声波辅助方法提取胞内多
糖 ,超声波使菌丝体的细胞壁充分破碎 ,加速目标
提取物的溶出 ,能提高胞内多糖的提取率[ 15] 。多
糖粗提物经DEAE-Cellulose 52层析柱和 Sephadex
G-200层析柱后 ,被分离为白背毛木耳 43-26多糖
AP1 、AP2 、AP3和AP4这 4种组分 ,并经过聚丙烯
凝胶电泳鉴定这 4种组分为纯多糖 ,但是这 4种多
糖组分的化学组成 、结构和生理功能等问题还需进
行进一步的探讨。
参考文献
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[本文编辑] 　朱丽娜
Extraction and Purification of Intracellular
Polysacchar ides f rom Auricularia polytricha Mycelium
Grown in Submerged Culture
ZHANG Danfeng
1 , ZHENG Shidong1 , CHEN Guoping2 , ZHENG Lizhu1 , PAN Yutian1
(1Depar tment of Biological Sc iences and Biotechnology of Zhangzhou Normal University ,
Zh angzhou , Fujian 363000 , China;2Crop Farming Management Station of Z hangzhou Agr icultur e
Bureau , Zh angzhou , Fujian 363000 , China)
Abstract:A growth medium for maximizing polysacchar ide produc tion by submerged cultur es of Auricularia
poly tricha 43-26 , consisting of(g/ L)20.0 potato , 20.0 corn powder , 10.0 peptone and 5.0 KH2 PO4 , was
derived by or thogonal testing.A crude fr ac tion containing 75.5% polysacchar ide was obtained by aqueous
extrac tion of ultr asound-tr eated fungal mycelium and precipitation with ethanol.Crude polysacchar ide was
separ ated into four par tially pur ified fr actions , AP1 , AP2 , AP3 and AP4 , by DEAE-cellulose 52 and
Sephadex G-200 column chroma tography.
Key words:Auricularia polytricha 43-26;intr acellula r polysacchar ide;extr action;pur if ica tion
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