全 文 ：中 国 酿 造
2012年 第 31卷 第 4期
总第 241期
5 结论
5.1 单因素试验表明，在4.50%菌体接种量，乙醇浓度小于
10%vol，发酵温度20℃～32℃范围内，产酸量随乙醇浓度
增加、温度升高、转速增大而升高；接种量的变化对产酸
量影响不明显。
5.2 响应面优化发酵条件显示，产酸量受发酵温度影响最
大，其中转速和乙醇浓度的交互影响最为显著。最佳醋酸
发酵条件为4.50%的接种量，在6.1%vol的乙醇浓度下，31℃
发酵，转速为142r/min，72h即可达到23.96g/L。
5.3 椭圆和杆状的菌体形态与发酵条件形成了对应，且发
酵温度的影响比转速更为显著。
参考文献：
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亮菌是我国首次发现并拥有自主知识产权的一种真
菌，在民间主要用于治疗慢性肝炎、胆囊炎、新生儿高胆红
素血症等[1]，目前对亮菌的研究主要有固体、液体发酵生
产，亮菌多糖的提取，多糖的结构及多糖的药理作用等[2]。
亮菌菌丝体多糖的提取方法有很多，主要有酸提、碱提
和热水提取法，但这些方法容易破坏多糖的结构和活性[3]，
收稿日期：2011-11-09
基金项目：浙江省教育厅科研项目（Y200805814）
作者简介：董丽辉（1978-），女，讲师，主要从事生物技术制药和食品生物技术研究工作。
酶法提取亮菌多糖的研究
董丽辉1，范三微1，凌庆枝1，2，高莉莉1，黄贝贝1，袁怀波2，魏兆军2
（1.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）
摘 要：以液体发酵培养的亮菌菌丝体为原料，利用纤维素酶和中性蛋白酶复合酶法提取菌丝体胞内多糖。结果表明，复合酶法提取
可以提高亮菌多糖的提取率，通过单因素试验和正交试验，复合酶提取多糖的最适条件是料液比为1∶40加酶量为2%，pH值为5.5，提
取温度为45℃，提取时间是1h，然后加中性蛋白酶，加酶量为1.2%，pH值为7.2，酶解温度为55℃，酶解时间是2.5h。紫外光谱分析表明，
亮菌多糖经过3次脱蛋白在波长200nm~400nm处没有明显的吸收峰。
关 键 词：亮菌；胞内多糖；分步酶解
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2012）04-0051-04
Extraction of Armillariella tabescens polysaccharide by enzymatic method
DONG Lihui1, FAN Sanwei1, LING Qingzhi1,2, GAO Lili1, HUANG Beibei1, YUAN Huaibo2, WEI Zhaojun2
(1.Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China；2. School of Biotechnology and Food Engineering,
Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
Abstract: The intracellular polysaccharides of Armillariella tabescens by submerged culture were extracted by application of combined neutral pro-
tease and cellulase. The results showed that the extraction yield could be increased by application of complex enzymes. By single-factor and orthogo-
nal tests, the optimum polysaccharides extraction conditions were obtained as follows: ratio of material and water 1∶40, and the first step treated with
cellulose, the amount of cellulase 2%, pH value 5.5, the extraction temperature 45℃, the extracting time 1h, followed with addition of neutral pro-
tease 1.2%, pH value 7.2, the extracting temperature 55℃ and the extracting time was 2.5h. The UV spectrophotometry revealed that the intracellular
polysaccharides of Armillariella tabescens would be no protein absorption after three times purification.
Key words: Armillariella tabescens; intracellular polysaccharides; stepwise enzymatic hydrolysis
研究报告
℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃
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2012 Vol.31 No．4
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纤维素酶，中性蛋白酶，果胶酶等都能降解细胞壁，从而增
大胞内有效成分向提取介质的扩散[4]。本试验采用实验室
发酵的亮菌菌丝体为原料，采用混合酶法提取菌丝体多糖。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
亮菌（Armillariella tabescens）：中国科学院中国普通微
生物保藏中心。
1.1.2 试剂
中性蛋白酶（10×104U/g）、酸性蛋白酶（10×104U/g）、果
胶酶（10×104U/g）、纤维素酶（2.2×104U/g）、木瓜蛋白酶
（10×104U/g）：济宁和美生物制剂有限公司。其他试剂：国
产分析纯。
1.1.3 原料
土豆、黄豆粉（过100目筛）、玉米粉（过100目筛）、山芋
粉（过100目筛）麦麸、大麦粉。
1.1.4 仪器
立式压力蒸汽灭菌锅：上海博申安医疗器械厂；RE-52B
型旋转蒸发仪：上海博通生物技术有限公司；420型三用水
箱：常州奥华仪器有限公司；UV2550紫外可见分光光度计
岛津；PHS-3C pH计：上海精科仪器有限公司；BCM-1000型
生物净化工作台：苏州净化设备有限公司；光照全温恒温
摇床，RXZ智能型人工气候箱：宁波江南仪器厂；DZF-6090
真空干燥箱：上海一恒科技有限公司。
1.1.5 培养基[1]
斜面培养基：葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.15%、KH2PO4
0.3%、VB1微量、琼脂粉1.8%、土豆汁20%。
种子培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1.5%、KH2PO4 0.5%、
MgSO4·7H2O0.1%、（NH4）2SO40.5%、VB1 0.001%、玉米粉2%。
液体发酵培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1.5%、黄豆粉2%、
KH2PO4 0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、（NH4）2SO4 0.5%、VB1
0.001%、玉米粉4%、pH值为6.0。
1.2 方法
1.2.1 菌丝体的制备
用100mL摇瓶装30mL种子培养基，接入2~3块黄豆粒大
小的活化后的斜面菌种，然后置旋转式摇床，28℃、180r/min
培养72h。将培养好的种子液按10%接种量接入发酵培养
基（发酵摇瓶为250mL摇瓶装液量为100mL），置于转速
180r/min、28℃的摇床培养7d。将深层发酵的发酵液过滤的
菌丝体，在将菌丝体用去蒸馏水洗至无还原糖反应，于60℃
以下真空干燥，研磨，备用。
1.2.2 不同酶对亮菌菌丝体多糖的提取
取亮菌菌丝体干粉按1∶40加入蒸馏水，再于样品中分
别加入中性蛋白酶、酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、木瓜
蛋白酶 5种酶，使酶的最终浓度都为2%，按各种酶的使用
说明在各自的最适pH值和温度条件下进行酶解 2h，以不
加酶为对照，酶解结束后，将酶解液置于80℃水浴中浸提
2h，离心取上清液，在旋转蒸发仪上将上清液浓缩，然后向
溶液中加入3倍体积乙醇，置4℃冰箱中24h得沉淀，沉淀用
适当水溶解后，用Sevage[5]法除蛋白，在用3倍体积的乙醇
醇沉，离心取沉淀用无水乙醇洗涤2次，取沉淀加蒸馏水溶
解，用蒽酮硫酸法测定多糖含量[6]。
1.2.3 纤维素酶和中性蛋白酶双酶对亮菌菌丝体的提取
取亮菌菌丝体干粉按1∶40加入蒸馏水，调节 pH值为
5.5，加入2%纤维素酶，45℃水浴中恒温酶促反应1h。调整
pH值，加入适量中性蛋白酶，于一定温度的水浴中酶促反
应一定时间。酶解结束后，将酶解液置于80℃水浴中浸提
2h，离心取上清液，在旋转蒸发仪上将上清液浓缩，然后向
溶液中加入3倍体积乙醇，置4℃冰箱中24h得沉淀，沉淀用
适当水溶解后，用Sevage法除蛋白，在用3倍体积的乙醇醇
沉，离心取沉淀用无水乙醇洗涤2次，取沉淀加蒸馏水溶
解，用蒽酮硫酸法测定多糖含量。
1.2.4 中性蛋白酶酶解作用条件单因素试验
单因素试验各个因素的选择，中性蛋白酶加酶量分别
为0.1%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%，酶解作用pH值分别为6.0、
6.4、6.8、7.2、7.6，作用时间分别为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、
3.5h，作用温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，进行单
因素试验，分别测定亮菌多糖提取率。
在单因素试验的基础上，纤维素酶和中性蛋白酶的双
酶组合提取亮菌菌丝体多糖的工艺条件进行优化，确立
4因素3水平的正交试验（表1）。
1.2.5 多糖纯化的紫外光谱分析
双酶提取的亮菌粗多糖，分别经1、2、3、4、5次Sevage
除蛋白，得到不同纯化的样品在UV2550型紫外可见分光光
度计上在波长200nm~400nm处进行光谱扫描。
1.2.6 多糖测定方法
将亮菌多糖沉淀加蒸馏水定容至设定体积，用蒽酮-
硫酸显色后用紫外分光光度计在波长490nm处测定吸光
度值，以吸光度值为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，
标准曲线回归方程为y=0.0786x-0.0045（r=0.999），y为浓度
（mg/mL），x为吸光度值，根据回归方程和吸光度值计算多
糖的量。
表1 酶法提取多糖条件优化正交试验因素及水平
Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment of conditions
optimization for enzymatic extraction of polysaccharides
序号 A加酶量 B温度/℃ C pH值 D时间 / h
1 纤维素酶2%+中性蛋白酶0.8% 45 6.4 2.0
2 纤维素酶2%+中性蛋白酶1.2% 50 6.8 2.5
3 纤维素酶2%+中性蛋白酶1.6% 55 7.2 3.0
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图3 不同的pH值对多糖产量的影响
Figure 3. Effect of different pH values on polysaccharides production
图4 不同的酶解温度对多糖产量的影响
Figure 4. Effect of reaction temperature on polysaccharides production
图5 不同的酶解时间对多糖产量的影响
Figure 5. Effect of reaction time on polysaccharides production
图1 不同的酶类对多糖产量的影响
Figure 1. Effect of different enzymes on polysaccharides production
2 结果与分析
2.1 不同酶类对菌丝体多糖提取与传统水提的效果的比较
取亮菌菌丝体干粉按1∶40加入蒸馏水，再于样品中分
别加入中性蛋白酶A、酸性蛋白酶B、果胶酶C、纤维素酶D、
木瓜蛋白酶E 5种酶，使酶的最终浓度都为2%，按各种酶的
使用说明在各自的最适pH值和温度条件下进行酶解 2h，以
不加酶为对照，对亮菌发酵菌丝体多糖的提取效果见图1。
由图1可以看出，不同酶解法制备的多糖产量由高到
低依次是中性蛋白酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、酸
性蛋白酶、比热水提的多糖产量分别提高96.9%、66.4%、
49.4%、24.0%、2.5%，在相同酶量时，中性蛋白酶和纤维素
酶这2种酶对亮菌菌丝多糖的提取效果最显著，而中性蛋
白酶是最经济的，所以，在后面的试验中采用这2种酶提取。
2.2 中性蛋白酶酶解作用条件单因素试验
取亮菌菌丝体干粉按1∶40加入蒸馏水，调节pH值为5.5，
加入2%纤维素酶，45℃水浴中恒温酶促反应1h。调整不同
的pH值，加酶量不同，于不同的温度酶解不同时间，然后
升温至80℃热水浸提2.0h，经离心、浓缩、除蛋白、醇沉后
测定多糖含量，试验结果见图2~图5。
由图2可知，酶用量在 0.1%~2.0%时，多糖产量随酶用
量的增加显著地增加，但当酶用量超过 1.2%后，多糖产量
的增加显著性降低，这是因为在一定的酶解条件下，当酶
量不足时，用的酶越多裂解菌丝体细胞壁的效率越高，当酶
量达到饱和后，再增加酶量对结果的影响就很小了。所以
中性蛋白酶的用量选择为1.2%。
由图3可知，pH值为6.8时，中性蛋白酶体系中多糖产量
最高，故将中性蛋白酶的最佳提取pH值确定为6.8。
由图4可知，在 40℃~60℃的温度范围内，随着酶解温
度的升高多糖产量也增加，但当温度超过 50℃后，随着酶
解温度的升高多糖产量减少，原因是当温度高于酶的最适
温度时，温度升高会使酶的活性降低。因此，50℃是中性蛋
白酶的最适作用温度。
由图5可见，在1.0h~3.5h的酶解时间范围内，随着酶解
时间的增加多糖产量也增加，表明酶解时间为2.5h、3.0h和
3.5h间的多糖产量差异不显著，而酶解时间为 2.5h和2.0h、
2.0h和1.5h间的多糖产量差异显著，所以酶解时间为2.5h是
图2 不同的酶用量对多糖产量的影响
Figure 2. Effect of enzymes dosage on polysaccharides production
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表2 酶法提取多糖条件优化正交试验结果与分析
Table 2. Results and analysis of orthogonal experiment of conditions
optimization for enzymatic extraction of polysaccharides
试验号 A B C D 多糖产量/（mg·g-1）
1 1 1 1 1 5.86
2 1 2 2 2 7.35
3 1 3 3 3 7.22
4 2 1 2 3 8.45
5 2 2 3 1 8.22
6 2 3 1 2 9.97
7 3 1 3 2 8.20
8 3 2 1 3 7.56
9 3 3 2 1 6.02
K1 20.43 22.51 23.39 20.10
K2 26.64 23.13 21.82 25.52
K3 21.78 23.21 23.64 23.23
R 6.21 0.69 1.82 4.42
表3 正交试验结果方差分析
Table 3. Variance analysis of orthogonal experiment results
来源 平方和 自由度 均方差 F值 p
加酶量 7.11111 2 3.55550 45.00358 0.02021
温度 0.09786 2 0.04893 5.50943 0.18312
pH值 0.64886 2 0.32443 13.65279 0.05415
提取时间 4.93526 2 2.46763 22.77830 0.03906
中性蛋白酶的最佳酶解时间。
2.3 提取胞内多糖工艺最佳条件的确定
通过L9（33）正交试验确定酶最佳作用条件，正交试验
结果见表2。
从表 2分析表明，极差分析表明，4个因素加酶量、酶
解温度、酶解时间和pH值对亮菌丝体胞内粗多糖的得率均
有不同程度的影响，其中加酶量和酶作用时间的影响比较
明显，各种因素对亮菌菌丝体胞内粗多糖的得率影响大小
顺序为A＞D＞C＞B，酶提取多糖的试验最优水平组合为
A2B3C3D2，最好的结果为先加纤维素酶，加酶量为2%，后
加入中性蛋白酶，加酶量为1.2%，温度55℃，pH值为7.2，时
间2.5h，多糖提取率最高。
为进一步判断上述4类受控制的因素对试验结果的
影响是否存在，将正交试验数据进行方差分析，找出这些
因素中起主导作用的变异来源。正交试验的方差分析结果
（表3）表明，加酶量和提取时间的差异显著（p<0.05），时间
差异的显著水平为0.05415，也相对较显著，说明加酶量和
提取时间比对多糖提取率起主要作用。温度则没有显著
性差异，即温度因素对最后结果的影响最小。
2.4 亮菌多糖的紫外光谱分析
亮菌粗多糖，分别经0、1、2、3次Sevage除蛋白，得到不
同纯化的样品在UV2550型紫外可见分光光度计上在波长
200nm~400nm区间进行光谱扫描见图6，亮菌多糖经过0，
1，2次Sevage除蛋白，在波长260nm~330nm区间都有不同程
度的吸收，这一段的吸收主要是有蛋白引起，亮菌多糖经
过3次Sevage除蛋白与前面几次比较，在波长260nm~330nm
区间吸收明显减少，但还是有少量的吸收，为了多糖的提
取产率考虑选择3次Sevage除蛋白。
3 结论
本实验的研究结果表明，用相同的酶量和在酶各自的
最适条件下，提取亮菌菌丝体多糖，都比热水提取的产量
要高，而中性蛋白酶和纤维素酶的提取产量最高，而且这
2种酶也是最为经济的。
亮菌菌丝体多糖的采用中性蛋白酶和纤维素酶提取
的最优提取方法：菌丝体干粉按1∶40料液比加入蒸馏水，
调节 pH值为5.5，加入2%纤维素酶，45℃水浴中恒温酶促反
应1h。调整pH值为7.2，加入中性蛋白酶量为1.2%，酶解温
度为55℃，酶促反应时间2.5h。
亮菌粗多糖，分别经0、1、2、3次Sevage除蛋白，得到不
同纯化的样品在UV2550型紫外可见分光光度计上在波长
200nm~400nm区间进行光谱扫描结果发现，经过3次脱蛋白
的样品中在260nm和280nm没有明显的吸收峰，说明亮菌
菌丝体多糖提取时Sevage脱蛋白3次就足够。
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图6 经过不同纯化次数的样品的紫外吸收图
Figure 6. UV spectrum of sample with different times of purification
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