全 文 ：47 卷　5 期
2007 年 10月 4 日
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
47(5):817～ 822
4 October 2007
基金项目:上海市重大科研项目(03DZ19315);上海检验检疫局项目(HK012-2007)
＊通讯作者。 Tel:86-21-68549999转 15175;Fax:86-21-68546481;E-mail:yijp@shciq.gov.cn
作者简介:周业琴(1982-),女 ,江苏扬州人 ,硕士研究生 ,主要从事食品与生物技术的研究。 E-mail:zhouyeqin@163.com
收稿日期:2007-01-04;接受日期:2007-02-26;修回日期:2007-07-05
小麦印度腥黑粉菌线粒体 DNA提取及其 ATP6基因
在真菌遗传发育分析中的应用
周业琴1 ,易建平2＊ ,周国梁2 ,董 　英1
(1江苏大学食品与生物工程学院　镇江　212013)　(2上海出入境检验检疫局　上海　200135)
摘　要:小麦印度腥黑粉菌(Tilletia indica Mitra)是一种世界范围的重要检疫性有害真菌 ,该病原菌和近似种之间冬
孢子的形态特征极为相似 ,遗传关系非常相近。为了从分子水平上探讨小麦印度腥黑粉菌和近似种之间线粒体基
因序列的差异 ,从新鲜菌丝中提取总 DNA , 经两次氯化铯密度梯度超速离心分离线粒体 DNA(mtDNA), 提取的
mtDNA纯度较高 , 可用于克隆 、酶切分析和 PCR扩增等分析。选取基因 ATP(adenosine triphosphate)6 的序列 , 并结合
GenBank 中相关种类的 ATP6基因 DNA序列进行了系统发育分析。结果表明 ,线粒体基因 ATP6 可用于科属水平的
分类鉴定。
关键词:小麦印度腥黑粉菌;线粒体 DNA;系统发育分析
中图分类号:Q933　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2007)05-0817-06
　　小麦印度腥黑粉菌 Tilletia indica Mitra 是一种
世界性的重要检疫性真菌。主要分布在印度 、巴基
斯坦 、伊朗 、伊拉克 、尼泊尔 、阿富汗 、巴西 、墨西哥 、
美国和南非等地[ 1 , 2] 。长期以来小麦印度腥黑粉菌
因其检疫重要性一直是各国口岸检疫系统所关注的
有害生物[ 2 ～ 4] 。该菌和近似种冬孢子之间的形态特
征非常相似 ,比如进境粮食类产品中常混杂的黑麦
草腥黑粉菌 Tilletia walkeri 、水稻腥黑粉菌 Tilletia
horrida和沙地牧草腥黑粉菌 Tilletia ehrhartae 等腥黑
粉病菌冬孢子 ,这几种病菌冬孢子的表面纹饰都是
疣状(瘤状)突起 ,容易误诊而造成粮食类产品的贸
易纠纷[ 1 , 4～ 8] 。应用光学显微镜和扫描电镜能将
Tilletia indica 与除Tilletia walkeri之外的其它近似种
区别开 ,但在区别 Tilletia indica 与 Tilletia walkeri 方
面则有一定的局限性[ 9] 。近年来国内外已经报道了
一系列的分子生物学检测方法[ 3 , 4, 10 ～ 13] ,小麦印度腥
黑粉菌和近似种黑麦草腥黑粉菌在 ITS(internal
transcribed spacers)序列上只有一个碱基序列的差
异 ,这给病原菌的分子鉴定带来了一定的困难 。由
于线粒体基因在真核生物中比较保守 ,且进化速度
是核基因的 5 ～ 10倍[ 14] ,通过不同种线粒体基因序
列的同源性分析易于发现种间的亲缘关系 ,为分子
鉴定提供理论基础。
GenBank中腥黑粉菌的线粒体基因序列只有同
一个属的 Tilletia hyalospora 500bp的序列 ,黑粉菌目
有玉米瘤黑粉菌 Ustilago maydis(DQ157700)mtDNA
的全序列 ,其和腥黑粉菌线粒体序列之间的相似性
不足 80%,根据线粒体基因片段设计 PCR引物直接
从总DNA 中扩增线粒体基因 ,不能得到预期的结
果。对GenBank中现有的黑粉菌线粒体基因序列进
行分析发现 ,部分线粒体基因的序列比较少而难以
进行对比分析 ,部分基因序列的分析结果与传统分
类方法不符 ,ATP 合成酶的第六亚基(ATP Synthase
subunit 6)与传统的分类方法一致。因此本文报道
了一种分离纯化小麦印度腥黑粉菌 mtDNA的方法 ,
利用两次氯化铯密度梯度超速离心分离得到了小麦
印度腥黑粉菌的 mtDNA ,克隆测序得到了其线粒体
基因组全序列 ,以其中 ATP6基因的 DNA序列为分
析对象 ,结合GenBank中相关种的ATP6基因序列分
析了小麦印度腥黑粉菌的系统进化 ,为小麦印度腥
黑粉菌的分类与演化提供一些分子水平的证据 ,并
对科属水平的分类研究进行初步探讨 。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　主要试剂和仪器:液氮 、无水乙醇 、溴化乙锭
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.2007.05.004
(EB)、荧光染料 Bisbenzimide(Hoechst 33258)、氯化铯
(CsCl)、酶(BstHH 、Bsh1236 、Msp 、Proteinase K 、RNase)
(上海生工生物工程技术有限公司)、Tris-HCl;显微
镜(ZEISS-Axiostar)、解剖镜(OLYMPUS-SZX12)、恒温
培养箱(SANYO)、控温摇床(HZQ-C , 空气浴振荡
器)、超速离心机(BeckMan Ultracentrifuge XL-90 ,转
子:BeckMan NVT 90)、凝胶成像系统(Syngene G-
box)、手持式紫外灯(Spectroline)、电泳仪(Amersham
Bioscienced EPS301)、核酸蛋白含量测定仪(Eppendorf
Biophotometer)、超低温冰箱(Angelantoni industrie)。
1.1.2　菌种来源:试验用小麦印度腥黑粉菌菌株
F11来源于上海出入境检验检疫局 1997年接种小
麦发病得到的菌瘿 ,接种用冬孢子是从印度面粉中
截获的小麦印度腥黑粉菌冬孢子。
1.1.3　培养基:固体培养基 PDA(琼脂粉 、蔗糖 、马
铃薯),液体培养基 PDB(蔗糖 、马铃薯)。
1.2　菌丝培养
取菌瘿置于解剖镜下 ,用解剖针从菌瘿中挑取
病菌冬孢子 ,用灭菌水洗涤一次 ,漂白粉溶液(0.5%
NaClO)表面消毒 30 s ,灭菌水洗两次 ,挑取冬孢子置
于2%琼脂平板上 ,20℃ 12h 光照条件下培养 5 ～
10d ,显微镜下观察有无冬孢子萌发 。冬孢子萌发后
将萌发的单个冬孢子转移至 PDA平板上 ,20℃培养
10d ,取菌丝块转入 PDB中 20℃, 108r min 振荡培养
15 ～ 20d , 10000r min(BeckMan AvantiTM-25 ,转子 JA-
14)离心 15min收集菌丝 ,吸干水分后-70℃冰箱保
存备用。
1.3　总 DNA提取
试验用菌丝 40g 提取菌丝总 DNA , 提取参考
Moller等[ 15] 的方法进行 。
1.4　线粒体 DNA提取
参考 Robert等提取丝状真菌mtDNA的方法[ 16] ,
并结合《分子克隆实验指南》中氯化铯-溴化乙锭梯
度平衡离心法纯化闭环 DNA 的方法[ 17] ,加以改进
后 ,使用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法分离 mtDNA ,
并用荧光染料 Bisbenzimide(=Hoechst 33258 ,Fluka )
进行染色 。mtDNA提取步骤如下:配制 CsCl密度梯
度离心溶液:用 0.1×TE配制 CsCl溶液 ,其密度为
1.55g mL ,此溶液中还包括约 6.4mg 的总 DNA 和终
浓度为 120μg mL 的荧光染料 Bisbenzimide 。将 CsCl
溶液分装于离心管(BeckMan 342412)中 ,每管 5mL
(用石蜡油封顶),将离心管热封后 ,放入超速离心机
(BeckMan Ultracentrifuge XL-90 , 转子 BeckMan NVT
90)中 ,20℃,780000r min 离心 5h;取出离心管 ,用手
持式紫外灯照射离心管 ,在长波长(365nm)的紫外
光的照射下 ,可看到三条蓝白色的条带 ,最上面一条
很细的条带是线粒体 DNA(mtDNA),中间的条带是
核糖体 DNA(rDNA), 最下面的条带是核 DNA
(nDNA)。用注射器(6号针头)从 DNA 带的下方刺
破离心管壁 ,慢慢取出 mtDNA 和 nDNA 的条带;为
了进一步纯化 mtDNA和 nDNA ,将取出的条带分别
进行第二次CsCl密度梯度离心。具体操作程序为:
将 mtDNA 分装于两个离心管 , DNA 放入一个离心
管 ,用 CsCl溶液(此溶液只含 CsCl和 TE ,其密度仍
为 1.55g mL)补足 5mL(用石蜡油封顶),离心方法及
取样过程同第一次 。
1.5　mtDNA和 nDNA纯化
参考《分子克隆实验指南》中用有机溶剂抽提法
从DNA中除去溴化乙锭的方法[ 17] ,去除荧光染料
和 CsCl2 。
1.6　DNA浓度测定
提取得到的 mtDNA 和 nDNA 溶液稀释后用核
酸蛋白含量测定仪(Eppendorf Biophotometer)测定其
浓度及 OD 260nm OD280nm比值 ,计算 mtDNA和 nDNA的
浓度 。
1.7　mtDNA和 nDNA的酶切分析
用限制性内切酶 BstHH(识别 GCGC 序列)、
Bsh1236(识别 CGCG序列)和Msp(识别 CCGG序列)
分别酶切 mtDNA(0.7mg)和 nDNA(1.0mg)。
DNA 经酶切后取全部反应产物 ,未酶切的 DNA
取 1μL于琼脂糖凝胶中电泳(Amersham Bioscienced
EPS301)检测 。电泳缓冲液为 1×TAE ,琼脂糖凝胶
的浓度为 1.0%,电压为 60V ,电泳时间为 4h。利用
凝胶成像系统(Syngene G-box)进行分析。
1.8　mtDNA全序列的测定和 ATP6基因的系统发
育分析
采用 Shotgun的方法构建 DNA 文库并测序(国
家人类基因组南方研究中心 Chinese National Human
Genome Center at Shanghai)。利用 Blast查询所测序
列的相似性 ,利用 DNAStar软件包中的 EdiSeq 软件
对 DNA序列进行同源性比较 ,利用 PAUP4.0软件构
建ATP6基因的系统发育树 。
2　结果和分析
2.1　总 DNA和mtDNA提取
从40g 菌丝粉中提取得到 6.4mg 总 DNA , 其
818 ZHOU Ye-qin et al. Acta Microbiologica Sinica(2007)47(5)
OD260 OD 280为 1.80 ,浓度为 926.4ng μL;进行两次氯
化铯密度梯度离心 ,得到 69.6μg mtDNA ,mtDNA约
为总 DNA含量的 1%。
2.2　超离次数对提取mtDNA纯度的影响
从菌丝提取的总 DNA 用氯化铯密度梯度离心
法进行mtDNA和 nDNA的分离纯化 ,超离后 DNA在
氯化铯密度梯度中形成的 3条 DNA 条带 ,其中最上
面一条很细的条带是 mtDNA;中间的条带是核糖体
DNA(rDNA),和最下面的条带靠近 ,连成一个宽的
条带;最下面的一条带很亮 ,是核 DNA(nDNA)(图1-
A),分别取出 mtDNA和 nDNA ,分别进行第二次氯化
铯密度梯度离心 , mtDNA 经第二次超离 ,mtDNA条
带比较亮 , nDNA 和 rDNA的条带比较弱 ,和第一次
离心效果相比 , nDNA 和 rDNA的条带明显减弱(图
1-B);同时 nDNA经第二次超离 , nDNA条带比较亮 ,
mtDNA和 rDNA 的条带比较弱 ,和第一次离心效果
相比 ,mtDNA和 rDNA的条带明显减弱(图 1-C)。离
心试验结果表明一次离心得到的 mtDNA 中有 nDNA
和 rDNA 混杂 ,nDNA中有 mtDNA 和 rDNA 混杂 ,两
次离心可以得到高纯度的 mtDNA和 nDNA 。
图 1　CsCl密度梯度离心形成的 DNA条带
Fig.1 　 DNA bands after the CsCl bisbenzimide density gradients
ultracentrifugation.A:The first CsCl bisbenzimide density gradients
ultracentrifugation of total DNA;B:The second CsCl bisbenzimide density
gradients ultracentrifugation of mtDNA;C:The second CsCl bisbenzimide
density gradients ultracentrifugat ion of nDNA.
2.3　酶切分析
提取的 mtDNA和 nDNA分别用识别 4个GC对
的限制性内切酶酶切 1h ,经琼脂糖凝胶电泳 4h ,得
到 DNA 的酶切电泳图 。用 BstHH、Bsh1236和 Msp
完全酶切 nDNA 和 mtDNA后 ,绝大部分 nDNA 被切
成1.5kb以下的小片段 ,而mtDNA形成 10个左右较
大的片段(图 2)。BstHH 、Bsh1236 和 Msp酶切后的
片段大小之和分别为 56.9kb 、66.6kb 和 62.1kb 。根
据酶切电泳图中 mtDNA被酶切的片段数目和大小 ,
估算出小麦印度腥黑粉病菌 mtDNA序列的总长度
为50 ～ 70kb 。
图 2　mtDNA和 nDNA的酶切电泳图
Fig.2　Agarose gel electrophoresis of mtDNA and nDNA digested with
BstHH 、Bsh1236 and Msp.M1:DL2000;M2:λ-Hind digest;M3:
DL15000;Lane1～ 3:mtDNA digested with BstHH 、Bsh1236 and Msp;
Lane 5 ～ 7:nDNA digested with BstHH 、Bsh1236 and Msp;Lane 4:
undigest mtDNA;Lane 8:undigest nDNA.
2.4　mtDNA全序列测定结果
采用 Shotgun 的方法构建了 DNA 文库 , 测出
mtDNA 的 全 序 列。 在 GenBank 中 登 录 , 获 得
Accession Number DQ993184(未公布)。经序列分析 ,
选取 ATP6基因进行系统发育分析。
2.5　ATP6基因的系统发育分析
对 Tilletia indica 的线粒体基因 ATP6 以及
GenBank中的19种共 20种高等担子菌ATP6基因的
DNA序列进行同源性比较。结果表明 ,种间同源性
高 , 为 87.7% ～ 97.6%。 Tilletia indica 与同属的
Tilletia hyalospora及同科的Conidiosporomyces ayresii 同
源性分别为 88.6%和 82.4%。根据ATP6基因 DNA
序列的同源性 ,构建了 20个相关种 ATP6基因 DNA
序列的系统发育树(图 3),结果显示 , Ustilago 属的
不同菌种avenae 、striiformis 、cynodontis 、davisii 根据同
源性的不同而相互区分开;同样 ,Ustilaginaceae 科的
不同菌种Moesziomyces eriocauli 、Moesziomyces bullatus 、
Melanopsichium pennsylvanicum 也可以相互区分开 ,而
Tilletia indica 先与同属的Tilletia hyalospora聚集在一
起 ,再与同科的 Conidiosporomyces ayresii 聚为一支 ,
然后分别与黑粉菌亚纲及担子菌门的聚集在一起。
从 Ustilago 属以及 Ustilaginaceae 科的分析可知 ,
mtDNA的ATP6基因可用于科属水平的分类研究。
819周业琴等:小麦印度腥黑粉菌线粒体 DNA提取及其 ATP6 基因……. 微生物学报(2007)47(5)
图 3　线粒体 ATP6基因 DNA序列的系统发育树状图
Fig.3 　 Phylogenetic tree derived from the DNA sequences of
mitochondrial gene ATP6.Numbers behind the latin names represent the
sequences accession number in GenBank.The number at each branch
points is the percentage supported by bootstrap.
3　讨论
有报道认为 mtDNA只占总 DNA 的 2%～ 15%,
本试验从总DNA中分离得到了小麦印度腥黑粉病
菌mtDNA约为总 DNA的 1%。试验过程中进行了
两次氯化铯密度梯度离心 ,而且离心后吸取 DNA带
时未能完全转移 mtDNA带 ,在去除荧光染料和 CsCl
过程中也有部分 mtDNA丢失 ,最后得到的mtDNA量
应该比实际含量偏小 ,因此小麦印度腥黑粉病菌
mtDNA在总 DNA中的比例应大于 1%。
到2006年 10月为止 ,GenBank数据库中有 42
个真菌线粒体基因组全序列 ,其大小变化很大 ,从
wine yeast Hanseniaspora uvarum 的 18.9 kb 到
Crinipellis perniciosa 的 109kb 。通常真菌线粒体基因
组比较大 ,容易与 nDNA缠绕在一起而难以分开 ,这
就给提取高纯度的 mtDNA 带来一定的困难 。试验
中进行氯化铯密度梯度离心时发现 ,离心次数对所
提 mtDNA的纯度有一定的影响 ,两次离心要比一次
离心的效果更好 ,可以得到高纯度的 mtDNA ,mtDNA
经第二次超离后仍可看见淡淡的 rDNA 和 nDNA 条
带 ,说明了一次离心后 mtDNA 中还有一定量的
rDNA和 nDNA(图 1-B)。第一次超离形成的 3 条
DNA条带彼此靠近 ,其中最上面的条带是 mtDNA ,
中间的 rDNA与最下面的 nDNA条带靠的很近 ,形成
一条宽带 ,几乎分不开 ,所抽取的 mtDNA 条带很容
易被 rDNA及 nDNA污染(图 1-A)。Robert等人报道
增加超速离心的次数可以更好地分离 mtDNA 和
nDNA
[ 12] ,因此 ,本试验参考 Robert等人提取丝状真
菌 mtDNA的方法[ 16] ,并结合《分子克隆实验指南》中
氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环 DNA 的
方法[ 17] ,加以改进后 ,采用两次氯化铯密度梯度离
心 ,得到了高纯度的小麦印度腥黑粉菌mtDNA ,提取
出的 mtDNA可适用于电泳 、克隆 、酶切分析和 PCR
扩增等研究。这种氯化铯密度梯度超速离心的方法
可以作为真菌线粒体分离纯化方法。
曾凡亚等用识别 4 个 GC 对的限制性内切酶
Hae﹑ Cfo和Msp 酶切担子菌总 DNA[ 18 , 19] ,认为总
DNA经酶切后所形成的分子量较大的 DNA条带来
源于mtDNA。高等担子菌的 nDNA与mtDNA的碱基
组成有明显差异 , nDNA 的 GC 含量一般在 50%～
80%,存在大量识别 4个 GC 对的限制酶酶切位点;
mtDNA的GC含量小于 50%,识别 4个GC对的限制
酶在 mtDNA中的酶切位点相对较少 。试验中用识
别 4个 GC对的限制性内切酶 BstHH 、Bsh1236 、Msp
酶切 mtDNA ,成功得到了 mtDNA 的酶切图谱 ,并根
据电泳图片中的可见条带预测小麦印度腥黑粉菌
mtDNA的总长度为 50 ～ 70kb 。用识别 4个 GC对的
限制性内切酶 BstHH、Bsh1236 、Msp 酶切 nDNA 时 ,
绝大部分 nDNA被切成 1.5kb以下的小片段;但酶
切总 DNA 时 ,未能得到 mtDNA 的条带 ,这可能与
mtDNA占总 DNA 的比例太小有关 。本实验所得结
果与前人的报道基本一致。
1996年Ferreira等利用氯化铯密度梯度超速离
心方法从小麦印度腥黑粉菌总 DNA 中分离到了线
粒体 DNA[ 20] , 然后通过酶切 mtDNA 得到了一段
2.3kb的片段并进行了部分片段的测序。Frederick
等对 3株 Tilletia indica 和3株 Tilletia walkeri 的线粒
体 DNA 的 2.3kb 片段进行克隆和测序[ 4] , 发现
Tilletia indica 和 Tilletia walkeri 有 99%以上的同源
性 ,两个种之间的差异不到 3%。但是我们分析后
发现 ,当时报道并在 GenBank中公布的序列和已经
820 ZHOU Ye-qin et al. Acta Microbiologica Sinica(2007)47(5)
报道的其它生物种类的线粒体序列存在两个难以解
释的现象:一是 AT 含量和线粒体 AT 含量不符 ,线
粒体中 AT 含量大于 50%,而 Frederick 等报道的
Tilletia indica 线粒体片段的 AT 含量仅为 43.4%
(AF218060)[ 4] ;二是 BLAST 在线分析的结果表明 ,
此序列与线粒体基因序列并没有比较高的相似性 ,
而与一个蛋白序列具有一定的同源性 。此外 ,我们
在试验中测定的 Tilletia indica线粒体基因组全序列
中没有找到与此序列相似性高的序列片段。因此可
以推测Frederick等人报道的 Tilletia indica 线粒体片
段以及后来其他学者据此序列设计引物测定的一系
列的线粒体序列都不是真正的线粒体序列。从
Ferreira和Frederick等人采用的试验方法分析[ 4 , 16] ,
可能是试验中测定序列的 DNA 片段是 nDNA而并
非mtDNA ,我们在试验中也证实了这种分析 ,利用
Ferreira和Frederick等人的线粒体引物可以从我们
试验分离到的 nDNA 中扩增预期的产物 ,而不能从
mtDNA中得到扩增产物。其根本原因是分离纯化
得到的 mtDNA中还有一定浓度的 nDNA 污染 ,酶切
以后得到的是 nDNA 酶切后的条带 ,最后测序得到
的也是 nDNA 序列 。试验中我们从 mtDNA 第二次
超速离心的结果发现 ,总 DNA第一次超速离心形成
的mtDNA条带中混有相当数量的 nDNA(图 1-B),这
种现象可以解释 Ferreira 和 Frederick 等人的试验误
差。真菌mtDNA只占总 DNA的 2%～ 15%,线粒体
基因组比较大 ,容易与 nDNA 缠绕在一起而难以分
开 ,此外 ,超速离心形成的三条 DNA条带彼此靠近 ,
即最上面的 mtDNA ,中间的 rDNA与最下面的 nDNA
条带 ,吸取 mtDNA 条带时容易被 rDNA 和 nDNA污
染。鉴于此 ,我们在试验过程中采用两次氯化铯密
度梯度离心的方法分离总 DNA 以得到较为纯净的
mtDNA ,这为随后构建 mtDNA 测序文库提供了有效
保障 。
根据线粒体基因 ATP6的 DNA序列构建的分子
进化关系与传统的系统分类基本一致 。Ustilago 属
的不同菌种 avenae 、striiformis 、cynodontis 、davisii 可以
相互区分开;同样 , Ustilaginaceae 科的不同菌种
Moesziomyces eriocauli 、 Moesziomyces bullatus 、
Melanopsichium pennsylvanicum 也可以相互区分开 ,而
本试验所研究的 Tilletia indica 先与同属的 Tilletia
hyalospora聚集在一起 ,再与同科的 Conidiosporomyces
ayresii聚为一支 ,然后分别与黑粉菌亚纲及担子菌
门的聚集在一起 。构建的系统进化树所反映的系统
进化关系能分析到腥黑粉菌的属 ,其结果与传统的
系统分类非常一致 ,说明线粒体 ATP6基因序列可
用于腥黑粉菌分类的研究。但由于GenBank中担子
菌种类 ATP6 基因序列的数量有限 ,特别是 Tilletia
属的种类少 ,有关种的鉴定依据有待进一步研究 。
目前 ,依据基因序列构建分子系统树进行分子
系统进化研究较多 ,构建分子系统树所依据的基因
不同 ,结果相差比较大。在分子系统学研究中 ,目的
基因的选择非常重要。一般选择进化过程中保守性
的基因序列作为分析对象 , 通常多选取 rDNA 序列
进行分析 ,近年来线粒体 DNA 序列分析在担子菌类
的发育研究中得到了广泛的应用。Sannenberg 等研
究了 29个双孢蘑菇线粒体的基因型 ,发现 29个菌
株中有 3种线粒体 DNA 的基因型遗传差异小 ,并且
大部分菌株是同一种线粒体 DNA 基因型[ 21] 。此
外 ,有人利用 RFLP 技术研究了 51株收集自不同地
理种群的野生香菇菌株 ,发现根据地理区域不同 ,所
收集菌株间的线粒体 DNA 有较多的类型。Forster
等对疫霉属 Phytophthora 真菌的 6 个种的线粒体
DNA 进行了 RFLP 分析 ,发现这项技术不仅可以区
别种 ,甚至可以区别来自不同地理环境和寄主的种
以下的分类单元 —亚群[ 22] 。Taylor 等应用线粒体
DNA 的多态性对粗糙脉孢菌的 19 株自然分离株进
化发育研究时 ,发现存在着明显的线粒体 DNA 群体
的地域性差别[ 23] 。近年来越来越多的真菌线粒体
基因组全序列得到测定 ,这为进一步基于线粒体基
因进行分子系统学研究奠定了基础。
致谢　感谢中国科学院上海植物生理生化研究所提
供超速离心试验场所;感谢中国农业大学生物学院
微生物系李颖和张金祥老师对实验方法的指导;感
谢国家人类基因组南方研究中心构建 DNA 文库和
测序;感谢江苏大学生命科学研究院王文兵副研究
员帮助修改文稿。
参 考 文 献
[ 1 ] Castlebury LA ,Carris LM , Tilletia walkeri , A new species on Lolium
multiflorum and L.Perenne.Mycologia , 1999 , 91:121-131.
[ 2 ] Bonde MR ,Peterson GL , Schaad NW , et al.Karnal bunt of wheat.
Plant Dis ,1997 , 81:1370-1377.
[ 3 ] Smith OP , Peterson GL , Beck RJ , et al.Development of a PCR-
based method for identification of Tilletia indica , causal agent of
karnal bunt of wheat.Phytopathology , 1996 , 86(1):115-122.
[ 4 ] Frederick RD , Karen ES , Tooley PW , et al.Ident if ication and
differentiation of Ti lletia indica and T.walkeri using the polymerase
chain reaction.Phytopathology , 2000, 90(9):951-960.
[ 5 ] Pimentel G , Carris LM , Levy L , et al.Genetic variabi lity among
isolates of Tilletia barclayana , T. indica and allied species.
Mycologia , 1998, 90:1017-1027.
821周业琴等:小麦印度腥黑粉菌线粒体 DNA提取及其 ATP6 基因……. 微生物学报(2007)47(5)
[ 6 ] Pascoe IG , Priest MJ , Shivas RG , et al.Ustilospores of Tilletia
ehrhartae , a smut of Ehrharta calycina , are common contaminants
with Ti lletia indica , the cause of Karnal bunt of wheat.Plant
Pathology , 2005, 54:161-168.
[ 7 ] 刘素萍 ,易建平 ,周国梁 ,等.进境小麦中沙地牧草腥黑粉菌
的鉴定.植物检疫 , 2006 ,20(1):7-9.
[ 8 ] Carri s LM , Cast lebury LA , Goates BJ.Nonsystemic bunt fungi———
Tilletia indica and T.horrida:A review of history , systematics , and
biology.Annu Rev Phytopathol , 2006 ,44:113-133.
.[ 9 ] 章桂明 ,戚佩坤 ,章　正 ,等.小麦印度腥黑粉菌与近似种的
形态学比较.菌物系统 , 2002, 21(3):412-418.
[ 10] Mishra A , Singh US ,Goel R , et al.PCR based molecular technique
for identification and discrimination of quarantined and non-
quarantined Ti lletia sps.Indian J Exp Biol , 2002 , 40(10):1137-
1142.
[ 11] 易建平 ,陶庭典 ,印丽萍 ,等.小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草
腥黑穗病菌的单孢检测.南京农业大学学报 , 2003 , 26(2):42
-46.
[ 12] 易建平 ,刘素萍 ,印丽萍 ,等.TaqMan-MGB探针在小麦印度腥
黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌鉴定上的应用.植物检疫 ,
2005, 19(1):15-19.
[ 13] Tan MK , Murray GM.A molecular protocol using quenched FRET
probes for the quarantine surveillance of Ti lletia indica , the causal
agent of Karnal bunt of wheat.Mycol Res , 2006 , 110(Pt 2):203-
210.
[ 14] Brown WM , George MJr , Wilson AC.Rapid evolution of animal
mitochondrial DNA.Proc Natl Acad Sci USA , 1979 , 76:1967-
　　　
1971.
[ 15] Moller EM , Bahnweg G , Sandermann H , et al.A simple and efficient
protocol for the isolat ion of high molecular weight DNA from
filamentous fungi , f ruit bodies , and infected plant tissue.Nucleic
Acids Res ,1992 , 20:6115-6116.
[ 16] Robert C ,Garber RC , Yoder OC.Isolation of DNA from f ilamentous
fungi and separation into nuclear , mitochondrial , ribosomal and
plasmid components.Analytical Biochemisty , 1983 , 135:415-422.
[ 17] Sambrook J , Russel l DW.分子克隆实验指南.黄培堂 ,等译.
第三版.北京:科学出版社 , 2002 , 53-60.
[ 18] 曾凡亚 ,汤海妹 ,张义正.用识别四个 GC对的限制性内切酶
研究高等担子菌线粒体 DNA.微生物学报 , 1998 , 38(4):283
-288.
[ 19] 曾凡亚 ,张义正.食用真菌线粒体 DNA 的直接分析.微生物
学通报 , 1998, 25(1):5-8.
[ 20] Ferrei ra MA ,Tooley PW , Hatzi loukas E , et al.Isolation of a species-
specific mitochondrial DNA sequence for identification of Tilletia
indica, the Karnal bunt of wheat fungus.Appl Environ Microbiol ,
1996 ,62(1):87-93.
[ 21] Sannenberg ASM.The occurrence of mitochondrial genotype and
inheritance of mitochondrial in the cultivated mushroom agarcus
bisprous.Mushroom Science ,1991 , ⅩⅢ Ⅰ(1-6):85-92.
[ 22] Forster H ,Oudemans P , Cof fy MD.Mitochondrial and nuclear DNA
diveristy within six species of Phytophthora.Experimental Mycology ,
1990 ,14:18-31.
[ 23] Taylor JW , Smolich BD , May G.Evolution and mitochondrial DNA
in Neurospora Crassa.Evolution ,1986 , 40(4):716-739.
Extraction of mitochondrial DNA of Tilletia indica Mitra and application of
the ATP6 gene on fungal phylogenetic analysis
ZHOU Ye-qin1 ,YI Jian-ping2＊ ,ZHOUGuo-liang2 ,DONG Ying1
(1 Department.of Food and Bioengineering , Jiangsu University , Zhenjiang 212013 , China)
(2 Shanghai Entry-Exit Quarantine and Inspection Bureau , Shanghai 200135 , China)
Abstract:Tilletia indica Mitra , an important pest around the world which is the causative agent of Karnal Bunt of wheat ,
was very close to Tilletia walkeri phylogenetically and morphologically.69.6ng mitochondrial DNA(mtDNA)of Tilletia
indica obtained from 6.4mg total DNA by the method of CsCl bisbenzimide density gradient ultracentrifugation can be
used for electrophoresis , cloning , enzyme restriction analysis and PCR amplification.The ATP6 gene sequence was cloned
from the fragment of mtDNA and sequenced for analysis of phylogenetic tree with the other related sequences in GenBank
by the software PAUP to reveal the phylogenetic relationships within the Tilletia species.
Keywords:Tilletia indica;mitochondrial DNA;phylogenetic analysis
Foundat ion item:Shanghai Municipal Committee of Science and Technology(03DZ19315);Shanghai Entry-Exit Quarantine and Inspection Bureau(HK012-
2007)
＊Corresponding author.Tel:86-21-68549999 Exe 15175;Fax:86-21-68546481;E-mail:yijp@shciq.gov.cn
Received:4 January 2007 Accepted:26 February 2007 Revised:5 July 2007
822 ZHOU Ye-qin et al. Acta Microbiologica Sinica(2007)47(5)