全 文 ：菌 物 系 统 20 2 233~237 2001
Mycosystema
双孢蘑菇杂交菌株As2796家系的分子遗传研究*

王泽生 1 廖剑华 1 陈美元 1 曾伟 1 2 宋思扬 2
(1福建省轻工业研究所 福州 350005; 2厦门大学生物系 厦门 361005)

摘 要:应用 PCR和凝胶电泳等技术 对双孢蘑菇杂交菌株 As2796及其亲本和子代作分子遗传标
记跟踪分析 结果如下: 1) 总DNA的RAPD分析表明 随着遗传代数的增加 杂种子代和出发异
核体亲本间的遗传差异逐渐增大; 2) mtDNA的酶切图谱表明 亲本 8213及其杂交子代具有相同的
基因型 表明双孢蘑菇的mtDNA呈单亲遗传; 3) Est同工酶的PAGE图谱表明 结合了亲本 02高
产特征和 8213 优质特征的杂交子代具有两个亲本的标记带型 证明 Est同工酶标记是双孢蘑菇新
菌株特性预测或鉴定的有效指标
关键词:双孢蘑菇 家系 分子遗传 RAPD 线粒体DNA 酯酶同工酶
中图分类号 Q939.96 文献标识码 A 文章编号 1007-3515 2001 02-0233-0237

双孢蘑菇 Agaricus bisporus Lange Sing.是世界性研究 生产和消费的食用真菌 自从荷兰
育种家 G.Fritsche首先于 1981年育成商业杂交菌株 U1和 U3并由 Darmycel菌种公司投放市场以
来 杂交菌株已经基本取代了传统的孢子分离菌株 在中国 福建省轻工业研究所于 1983年开始
双孢蘑菇的杂交育种研究 1986年以来建立起同工酶预测 鉴定新菌株等杂交育种技术(Wang &
Wang 1989 1990; Wang & Liao 1990; Wang et al.1991) 先后选育出 As376 As1671和 As2796
等系列杂交菌株 其中 As2796明显结合了双亲本高产与优质的特征 成为中国最广泛使用的商业
菌株 年产鲜菇超过 30万吨(Wang et al. 1995) 杂交菌株的育成和应用无疑使双孢蘑菇的生产水
平和经济效益都得到显著的提高 但是对双孢蘑菇杂种优势的分子机理研究甚少 在使用多年以
后 某些杂交菌株表现出对温度敏感或对轮枝霉病侵染敏感 子实体丛生等现象 导致产 质量
下降等退化表现 那么这些退化现象的分子机理又如何呢?鉴于此 我们认为有必要对杂交菌株的
家系进行遗传跟踪分析 以便进一步探讨双孢蘑菇杂交优势形成与退化的遗传基础 用于指导进
一步的杂交育种和菌种保藏 预测新菌株可能形成的优良性状 监测新菌株在长期保藏后与生产
使用中的性状表现 直接服务于生产
此前 Fritsche于 1987 年发现 U1 菌株发生凹顶 空腹 硬开伞和单产下降等退化现象 为
了复壮U1菌株 她采用原生质体克隆 多孢分离培养 单孢分离培养 并用原先的2个同核体重
复杂交 发现U1的F2代单孢分离株表现出较大的变异性(Fritsche 1991) Khush等(1992)用RAPD
技术作了双孢蘑菇遗传亲子的分析 Kerrigan等(1993)通过系统家系的构建 以 DNA分子标记为
辅助 分析标记在亲本及其子代中的分离情况 建立了双孢蘑菇遗传连锁图 本研究应用随机扩

*福建省自然科学基金重点资助项目 C9820005
E-mail:mushroom@public.fz.fj.cn
收原稿日期 2000-08-8 收修改稿日期 2000-09-22
DOI:10.13346/j.mycosystema.2001.02.016
234 菌 物 系 统 20卷
增多态性 DNA(RAPD) 线粒体 DNA(mtDNA)酶切电泳和酯酶(Est)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)技术分析杂交菌株 As2796的遗传家系
1 材料与方法
1.1菌株
双孢蘑菇菌株 02 8213 361-2 As165 W95-2 As2796和 As4607由福建省轻工业研究所
福建省蘑菇菌种研究推广站提供 它们的遗传关系如图 1所示

图 1 双孢蘑菇杂交菌株As2796的遗传家系
Fig.1 The genetic pedigree of hybrid As2796 of Agaricus bisporus

1.2 总DNA的RAPD分析
菌丝培养 总 DNA提取 RAPD分析方法及所用试剂基本同前(曾伟等 1999) 所用随机引
物购自 Sangon公司 编号为OPU01 OPU03 OPU06 OPU12 OPU15 OPU16 OPU17 OPU18
OPU19
1.3 mtDNA的酶切分析
1.3.1 试剂: RNaseA购自美国 Sigma公司 限制性内切酶HaeIII CfoI MspI TaqI购自德国宝
灵曼公司
1.3.2 mtDNA提取: 用两层纱布过滤液体 PDA培养的菌丝体 加蒸馏水洗一遍 尽量挤干水分
称重后 按 12ml缓冲液/10g菌丝体的比例加入预冷的BufferA(1.0mol/L蔗糖 0.01mol/L KH2PO4
0.1%BSA 2mmol/L半胱氨酸 1mmol/LEDTA pH7.2 ) 在高速组织捣碎机中充分破碎 1700g
4 离心 20min 上清用两层纱布过滤后 15000g 4 离心 20min 用 20ml BufferB(0.6M蔗糖
10mmol/L Tris-Cl pH7.5 2mmol/L EDTA)洗涤一遍 15000g 4 离心 20min 沉淀加 2ml
BufferC(10mmol/LTris-Cl pH8.0 10mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl 2%N-十二烷基肌氨酸钠) 混
匀 加RNase至 0.5mg/ml 30 水浴 30min 酚 氯仿/异戊醇各抽提一遍 加 0.1Vol 3Mol/L NaAc
2Vol无水乙醇-20 沉淀 2h 台式离心机收集沉淀 70%乙醇洗后吹干 溶于适量纯水中 -20
保存备用
1.3.3 酶切: 用厂家提供的缓冲液 50µl 体系 适量 DNA 和内切酶 适宜温度下酶解 2.5h 加
EDTA至 10mMol/L终止反应 1.0%琼脂糖电泳检测
1.4 Est同工酶的PAGE分析
菌丝培养 Est同工酶样品提取 PAGE方法及所用试剂均同前 (王贤樵和王泽生 1989 Wang
& Wang 1989)

2 期 王泽生等 双孢蘑菇杂交菌株 As2796家系的分子遗传研究 235
2 结果与分析
2.1 RAPD分析
本实验用 9种随机引物对双孢蘑菇 As2796家系的 7个菌株的基因组DNA进行扩增 均得到
阳性结果 将得到的所有电泳图谱进行统计 根据公式:相似值 S=2Nab/Na+Nb对统计的数据进行
聚类分析 换算出各菌株间的遗传相似值 并列于家系遗传构成图中 (图 2)

图 2 以 02和 8213为出发亲本的遗传家系构成及各菌株间的遗传相似值
Fig 2 The constitution of the genetic pedigree derived from parental strains 02 and 8213
and the values of genetic similarity between different individual strain

实验结果表明: 1) 单孢同核体的泳带数量少于异核体,但也出现了某些异核体中没有的新
带 单孢同核体与其异核亲本及杂种子代间的遗传相似值较低 2) 子一代杂种W95-2与两个异核
亲本 02 8213之间的遗传相似值分别为 0.621和 0.729; 子二代杂种 As2796与异核亲本的相似值
为 0.593和 0.640; 子三代杂种 As4607与异核亲本的相似值为 0.600和 0.626 而W95-2与 As2796
的相似值为 0.778 As2796与 As4607相似值为 0.839 这些数据表明 随着遗传代数的增加 杂
种子代与出发异核亲本间的遗传差距逐渐增大 但杂种子代间的遗传相似值也逐渐增大 证明同
核单孢杂交比传统的单孢 多孢分离筛选更容易产生优势明显的新菌株 杂交菌株的遗传特性可
以通过单孢分离 筛选得以保持
2.2 mtDNA酶切图谱分析
实验使用四种内切酶HaeIII (识别 GGCC) CfoI(识别GCGC) MspI(识别CCGG) TaqI(识别
TCGA)对mtDNA粗提物进行酶切 获得的片段数达 15~20条 接近纯 mtDNA酶切的效果 酶切
图谱显示 异核亲本 8213及其杂种W95-2(F1) As2796(F2)和 As4607(F3)具有相同的线粒体基因
型 而另一异核亲本 02具有另一种基因型 表明双孢蘑菇的mtDNA呈单亲遗传 这和 Sonnenberg
等(1991)的研究结果相一致
2.3 Est同工酶的PAGE图谱分析
图3显示出发异核亲本02和8213分属H2型和G1型 而它们的同核单孢菌株361-2和As165
保留了亲本的标记区带 e2 e4 和 e1 e3 但其它区带数明显减少形成 Hs1 和 Gs2 型酶谱 杂种
236 菌 物 系 统 20卷
W95-2(F1) As2796(F2)和 As4607(F3)具有相同的 Est酶谱 它们同时表达出双亲的标记区带 e1
e2 e3 e4 呈典型的杂合态 被称为 HG4型 上述结果表明 从异核亲本分离出同核单孢株到
杂交形成杂种子一代 Est同工酶标记位点表现出遗传和重组 形成传统菌株(Wang & Wang 1989;
Wang & Wang 1990)所没有的新的基因类型 并能稳定遗传给其单孢子代 As2796(F2)和
As4607(F3) 与此相吻合的是亲本 02 的高产特征和 8213 的优质特征能通过杂交组合于杂交种
W95-2(F1) 其异核单孢分离株 As2796(F2)和 As4607(F3)保持了这种高产兼优质的特征 成为中国
最广泛使用的商品菌株(王泽生等 1995) 证明 Est同工酶标记是双孢蘑菇新菌株特性预测或鉴定
的有效指标

图 3 双孢蘑菇酯酶同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Fig 3 PAGE patterns of esterase isozymes of A.bisporus
8213(G1) As165(Gs2) 02(H2) 361-2(Hs1) W95-2(HG4) As2796(HG4) As4607(HG4)

3 讨论
应用 RAPD mtDNA和同工酶等分子标记技术对双孢蘑菇商业杂交菌株 As2796的家系进行
跟踪分析 使我们对同核单孢菌株间杂交产生的杂种优势的内涵及其遗传有了更多的了解 在现
有商品菌株间杂交产生的变异是有限的 虽然可以获得更优良的菌株 但改良程度受到限制 因
此 充分利用野生种质 或近缘种(大肥菇等)进行杂交就显得十分重要
mtDNA是真菌中最主要的染色体外遗传物质 遗传方式独特 该遗传系统虽受控于核系统
但仍存在特殊的 DNA复制机制 RNA 拼接机制以及个别有别于通用密码子的遗传密码子 国
际上对双孢蘑菇mtDNA的初步研究(Sonnenberg et al. 1991; Jin et al. 1994)表明双孢蘑菇mtDNA
存在 3~4 种基因类型 虽然这些多态性明显不如其它物种 但它和双孢蘑菇重要性状的关系仍然
值得探讨 尤其是双孢蘑菇mtDNA呈现单亲遗传的现象在菌株改良中的应用 假如某一亲本的某
一优良性状受控于mtDNA 那么利用单亲遗传特点 让这一亲本的同核体处于生长较快状态与另
一亲本配对杂交 其子代就可能只承袭生长较快状态亲本的基因型(Jin 1994) 达到改良的目的
反之若承袭的是不良性状的基因 那么菌株可能产生不如人意的退化现象
福建省轻工业研究所于八十年代开展双孢蘑菇同工酶 PAGE表型与菌株特性相关研究 并成
功地把同工酶电泳技术应用于双孢蘑菇菌株特性的预测(王贤樵和王泽生 1989;Wang & Wang
1989 Wang & Wang 1990) 根据电泳表型可把双孢蘑菇分为高产或 H型 优质或G型 中间或
HG1-2型 杂交或HG4-5型和同核不育或 S型 近来又应用RAPD技术对三种重要类型菌株进行
2 期 王泽生等 双孢蘑菇杂交菌株 As2796家系的分子遗传研究 237
分析 获得相同结果 从另一角度证明了同工酶分型的可靠性 (陈美元等 1998)
[ 参 考 文 献 ]
王贤樵 王泽生 1989. 双孢蘑菇同工酶标记筛选研究.中国食用菌 8(6): 7~12.
陈美元 廖剑华 王泽生 1998. 双孢蘑菇三种类型菌株的 RAPD扩增研究.食用菌学报 5(4): 6~10.
曾伟, 宋思扬 王泽生 苏文金 1999. 双孢蘑菇及大肥菇的种内及种间多态性 RAPD分析. 菌物系统 18(1): 5~60.
Fritsche G, 1991. Maintenance, Rejuvenation and improvement of HORST-U1. Genetics and Breeding of Agaricus Pudoc Wageningen
Netherlands 145~152.
Jin T et al.. 1994. Uniparental mitochondrial transmission in the cultivated button mushroom. Agaricus bisporus. Appl. Environ. Microbial 12:
4456~4460.
Kerrigan R W et al. 1993. Meiotic Behavior and Linkage Relationships in the Secondarily Homothallic fungus Agaricus bisporus. Genetics
133: 225~236.
Khush R S et al. 1992. DNA Amplification Polymorphisms of the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Appl.Environ. Microbial 5:
2971~2977.
Sonnenberg A S M et al. 1991. Mitochondrial genotypes and their inheritance in the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Genetics and
Breeding of Agaircus Pudoc. Wageningen. The Netherlands. 42~51.
Wang H C, Wang Z S 1989. The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis.
Mushroom Science 12(1): 87~100.
Wang Z S, Liao J H 1990. Study on the crossbreeding techniques of Agaricus bisporus. Micologia Neotropical Aplicada 3:1~12.
Wang Z S, Wang H C 1990. Isozyme pattern and characteristics of hybrid strains of Agaricus bisporus. Micologia Neotropical Aplicada 3:
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Wang Z S et al., 1991. Studies on the genetic basis of esterase isozyme loci EstA B and C in Agaricus bisporus. Mushroom Science 13(1): 3~9.
Wang Z S et al., 1995. Studies on breeding hybrid strain As2796 of Agaricus bisporus for canning in China. Mushroom Science 14(1): 71~79.
MOLECULAR GENETIC STUDY ON THE PEDIGREE OF HYBRID STRAIN
AS2796 OF AGARICUS BISPORUS
WANG Ze-Sheng1 LIAO Jian-Hua1 CHEN Mei-Yuan1 ZENG Wei1,2 SONG Si-Yang2
(1Fujian Research Institute of Light Industry Fuzhou 350005; 2Department of Biology Xiamen University
Xiamen 361005 )
ABSTRACT: The pedigree of the hybrid A.bisporus strain As2796 was analyzed through molecular genetic markers
tracking. The results were as follows: 1)RAPD analysis of total DNA showed that with the addition of the number of
genetic generations the genetic differences between hybrid offspring and their original heterokaryotic parents
increased. 2)The patterns of mtDNA digested by endonucleases showed that the hybrid offspring had the same
mitochondrial genotype as the parent 8213 indicating that the mtDNA of A.bisporus was inherited from one of the
parents. 3)PAGE patterns of esterase isozyme(Est) showed that the hybrid offsprings which combined both the
characteristic of high yield of parent 02 and good quality of 8213 had the same marked bands of their parents. The Est
isozyme marker was found to be an effective index of new strains’ characteristic prediction or determination of
A.bisporus.
KEY WORDS: Agaricus bisporus genetic family molecular heredity RAPD mtDNA esterase isozyme