全 文 ：收稿日期:2015 － 08 － 21
基金项目:国家级 2015 年大学生创新训练计划项目资助(201510389020)。
作者简介:李敏(1989 －) ，女，硕士研究生。研究方向:花卉生理生化。Email:liminzyl@ sina． com。通讯作者邱栋梁(1970 －) ，教授，博士生
导师。研究方向:园艺植物生理生态。Email:qiudl1970@ fafu． edu． cn。
鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的优化
李 敏，叶丝蕊，邱栋梁
(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)
摘要:为探索适用于鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的方法，采用酚抽提取法对 IPG胶条及蛋白质上样量等关键步骤进
行优化。结果显示，鸳鸯茉莉花瓣蛋白质在 pH值为 4． 0 － 7． 0，24 cm IPG胶条范围分离效果较好，并且当上样量为 1． 5 mg
时，在双向电泳图谱上检测到的蛋白点较多且清晰，分辨率较好。
关键词:鸳鸯茉莉;花瓣;双向电泳;蛋白质组
中图分类号:S682． 31;Q512 文献标识码:A 文章编号:1673-0925(2015)04-0262-05
DOI:10． 13321 / j． cnki． subtrop． agric． res． 2015． 04． 009
Optimization of two-dimensional electrophoresis technology
for Brunfelsia acuminate petals
LI Min，YE Si-rui，QIU Dong-liang
(College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:In order to find the method of two-dimensional electrophoresis technology in Brunfelsia acuminate petals，phenol extrac-
tion method was adopted to optimize the sample volume and IPG strips and protein crucial steps． The results showed that protein iso-
lation of B． acuminate petals was better in the range of pH 4． 0 － 7． 0，24 cm IPG strip in the protein electrophoresis figure． When
the sample volume was 1． 5 mg，large and clear spots were observed，and a higher resolution in the 2-DE patterns was obtained．
Key words:Brunfelsia acuminate;petals;two-dimensional electrophoresis;protein
鸳鸯茉莉(Brunfelsia acuminate)又名双色茉莉，为茄科(Solanaceae)鸳鸯茉莉属常绿灌木，原产巴西。
花开期间芳香四溢，花的颜色在开后 2 － 3 d内从深紫色逐渐变为白色，由于花开有先后，在同株上能同时
见到紫色和白色的花［1］，具有极高的观赏价值。目前对鸳鸯茉莉的研究报道已有很多［1 － 3］，但对其在蛋白
组方面的研究鲜见报道。
双向电泳技术是蛋白质分离较为常用的方法，在蛋白质组研究中应用广泛［4］。双向电泳体系对不同
材料的要求不同。在双向电泳试验中，关键步骤的优化是影响电泳图谱质量高低的主要因素。欧高政
等［5］对双向电泳技术在‘四季蜜’龙眼花芽上的应用进行优化改进，获得了较好的 2-DE 图谱。朱小姝
等［6］对蝴蝶兰叶片进行了双向电泳关键步骤的优化，也获得了最佳应用体系。本研究以鸳鸯茉莉花瓣为
材料，利用酚抽提法优化其蛋白质双向电泳体系，以期为进一步研究鸳鸯茉莉蛋白质组以及差异蛋白质的
质谱鉴定提供支持。
1 材料与方法
1． 1 材料
鸳鸯茉莉花瓣采自福建农林大学校园。花瓣采摘后立即用液氮速冻，并保存于 － 80 ℃冰箱中备用。
亚热带农业研究
Subtropical Agriculture Ｒesearch
第 11 卷 第 4 期
2015 年 11 月
(1)蛋白提取液:100 mmol·L －1 Tris-HCl(pH 8． 0)+ 50 mmol·L －1抗坏血酸 + 100 mmol·L －1 KCl +
50 mmol·L －1硼砂 + 1% Triton-100 + 2% β-琉基乙醇 + 0． 7 mol·L －1蔗糖;(2)裂解液:7 mol·L －1尿素 +
2 mol·L －1硫脲 + 2% 两性电解质载体 + 40 mmol·L －1 DTT(现加)+ 4% CHAPS; (3)上样水化液:7
mol·L －1尿素 + 2 mol·L －1硫脲 + 2% CHAPS + 0． 5% IPG Buffer + 0． 001%溴酚蓝 + 40 mmol·L －1 DTT;
(4)平衡液Ⅰ:50 mmol·L －1 Tris-HCl(pH 8． 8)+ 6 mol·L －1尿素 + 30%甘油 + 2% SDS + 1% DTT +
0． 002%溴酚蓝;(5)平衡液Ⅱ:50 mmol·L －1 Tris-HCl(pH 8． 8)+ 30%甘油 + 6 mol·L －1尿素 + 2% SDS
+2． 5%碘乙酰胺 + 0． 002%溴酚蓝; (6)考马斯亮蓝染色液:0． 05% Ｒ250 + 10%乙酸 + 50%甲醇 + 40%
ddH2O;(7)脱色液:30%甲醇 + 10%乙酸 + 60% ddH2O。
1． 2 仪器与设备
Ettan IPG phorⅠ等点聚焦系统、EttanTM DALT SIX垂直板电泳系统、ImagescannerⅡ图像扫描仪，均购
自 GE Healthcare公司;高速冷冻离心机，购自大连科瑞科技有限公司;水平摇床，购自北京六一仪器厂;恒
温水浴锅，购自上海一恒科学仪器有限公司;旋涡混合器，购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。
1． 3 样品制备
采用酚抽法，参照文献［7］的方法进行样品制备。将 6 g鸳鸯茉莉花瓣样品在研钵中用液氮充分研磨
成粉末，待液氮挥发完后，向研钵中加入 18 mL蛋白提取液。待研钵中的提取液溶化后，继续研磨，使花瓣
粉末充分溶解在提取液中。将研钵中的提取液转移到 50 mL 离心管中，加入等体积 Tris －饱和酚(pH
8． 0) ，使用旋涡混合器充分涡旋，使 Tris －饱和酚与提取液混合均匀，4 ℃、5 500 g，离心 10 min，取酚层至
新的 50 mL离心管中，再加入等体积酚提取液，涡旋混匀。4 ℃、5 500 g，离心 10 min，取酚层至 50 mL 离
心管中，加入 6 倍体积在 － 20 ℃下预冷的含 0． 1 mol·L －1乙酸铵的甲醇溶液，将离心管置于 － 20 ℃冰箱
中过夜。次日将离心管取出，4 ℃、20 000 g离心 20 min，倒掉上清液，用预冷的甲醇溶液冲洗离心管壁上
的蛋白，使蛋白完全悬浮在甲醇溶液中，－ 20 ℃静置 1 h。4 ℃、20 000 g 离心 20 min，弃去离心管中的甲
醇溶液，用含 0． 07% β-巯基乙醇的丙酮溶液冲洗沉淀，使沉淀悬浮在溶液中并放置在 － 20 ℃条件下静置
1 h。此步骤重复 1 次。4 ℃、20 000 g离心 20 min，弃去上清液，然后用少量预冷的丙酮冲洗蛋白并分装
至 1． 5 mL离心管中，4 ℃、17 000 g离心 15 min，弃去上清液，所得的蛋白沉淀在 － 20 ℃下真空干燥，干燥
好的蛋白干粉迅速置于 － 80 ℃保存，备用。
1． 4 蛋白的裂解与定量
取出约 15 mg蛋白粉末，在离心管中加入 300 μL蛋白裂解液，用超声波震荡 20 min，待蛋白粉末完全
溶解后，放入 37 ℃水浴锅中水浴 2． 5 h，其间每隔 30 min涡旋 1 次。室温、20 000 g离心 15 min，将上清液
转移到新的离心管中，立即用于蛋白质含量的测定和双向电泳分析。
采用 Bradford法［8］进行蛋白质含量测定。用紫外分光光度计测定各样品溶液的 D595 nm，并绘制标准
曲线。依照标准曲线得出样品的蛋白质浓度，并用于后续试验。
1． 5 第一向等点聚焦
1． 5． 1 固相 pH梯度胶条的水化 根据蛋白质定量结果计算出所需的蛋白溶液体积，加入上样水化液补
足到 450 μL后涡旋混匀，最终上样总体积为 450 μL。将蛋白样品溶液均匀加入到胶条槽中，并把去掉保
护膜的 IPG干胶条放入胶条槽中。吸取 800 μL矿物油将胶条表面均匀覆盖，进行第一向电泳。运行条件
为 20 ℃，等电聚焦程序:200 V(1 h)－ 500 V(1 h)－ 1 000 V(1 h)－ Gradient-8 000 V(0． 5 h)－ 8 000 V(6
h)－ 1 000 V(2 h) ，最大电流为 50 mA。
1． 5． 2 胶条平衡 提前配制 10 mL平衡液Ⅰ和 10 mL平衡液Ⅱ。电聚焦完成后取出 IPG胶条，将胶条置
于干净的滤纸上吸取胶条表面的矿物油，用电极缓冲液轻轻冲洗胶面，将胶条放入平衡液Ⅰ中平衡 15 min
·362·第 4 期 李敏等:鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的优化
之后转入平衡液Ⅱ中平衡 15 min，胶条要完全被平衡液覆盖。2 次平衡结束后，用镊子将胶条取出，用电
泳缓冲液冲洗胶条表面后转移到 SDS-PAGE凝胶上准备第二向电泳。
1． 6 SDS － PAGE电泳
表 1 12% SDS － PAGE凝胶配制(360 mL)1)
Table 1 Components of 12% SDS-PAGE resolving gel solution (360 mL)
试剂 用量 /mL
30% Acr-bis 144． 00
1． 5 mol·L －1 Tris-HCl 90． 00
10% SDS 3． 60
ddH2O 120． 42
10% AP 1． 80
TEMED 0． 18
总计 360． 00
1)Tris-HCl的 pH值为 8． 8。
用 12% SDS － PAGE凝胶配方提前配制好分离
胶(表 1)。将平衡后的 IPG 胶条转移到 SDS 分离
胶，用低溶点琼脂糖封胶，再加入高熔点琼脂糖将胶
条封好。琼脂糖凝固后进行 SDS － PAGE 电泳。室
内温度控制在 20 ℃左右，等到溴酚蓝指示条带将要
到达凝胶底部边缘时终止电泳。
1． 6． 1 染色和脱色 电泳结束后，用考马斯亮兰染
色法参照文献［9］进行染色。将胶条取出放入已过
滤好的染色液中，放在水平摇床上轻摇 2 h;染色结
束后，将染色液倒掉或过滤回收，用蒸馏水将胶条清洗后再加入适量的脱色液脱色，期间多次更换脱色液
直至背景清晰为止。
1． 6． 2 凝胶图像扫描 脱色完成后，用 ddH2O将凝胶上残留的脱色液冲洗干净，然后使用 Images canner
Ⅱ图像扫描仪进行凝胶图像扫描。扫描结束后取出凝胶，用保鲜膜密封，4 ℃下保存，备用。
2 结果与分析
2． 1 蛋白质含量
利用 Bradford法进行蛋白质含量测定，以牛血清蛋白的蛋白质浓度为横坐标，每组 D595 nm的平均值为
纵坐标绘制标准曲线(图 1)。标准曲线的方程式以 y = ax + b 的形式表示，其中 x 为蛋白质含量，y 为
D595 nm值。根据标准曲线的方程式计算出鸳鸯茉莉花瓣蛋白质浓度，优化 IPG胶条选择及上样量所用的浓
度分别为 9． 91 和 10． 72 μg·mL －1。
图 1 Bradford法测定鸳鸯茉莉花瓣蛋白质含量标准曲线
Fig． 1 Standard curve of protein content determined in B． acuminate petals by Bradford method
2． 2 第一向 IPG胶条的选择
参考文献［9 － 10］，本研究分别使用 pH值为 3． 0 － 5． 6 及 4． 0 － 7． 0 两种胶条对第一向电泳胶条的选
择进一步优化。结果表明，参照文献［9］，设置上样量为 1． 3 mg 的蛋白质含量，不同 pH胶条获得的 2-DE
图谱有明显的区别(图 2)。采用 24 cm、pH值为 3． 0 － 5． 6 得到的电泳图谱分离效果较好，但得到的蛋白
不全面(图 2A) ;采用 24 cm、pH值为 4． 0 － 7． 0 的胶条获得的 2-DE 图谱蛋白质分离效果虽不及前者，但
能清晰地看到更多的蛋白质点(图 2B)。综上所述，鸳鸯茉莉花瓣蛋白在 pH 值为 4． 0 － 7． 0 胶条上得到
·462· 亚 热 带 农 业 研 究 第 11 卷
的 2-DE图谱较为理想，鸳鸯茉莉花瓣大部分的蛋白也分布在此范围内。
A． pH值为 3． 0 － 5． 6，24 cm;B． pH值为 4． 0 － 7． 0，24 cm。
图 2 鸳鸯茉莉花瓣总蛋白不同 IPG胶条的 2-DE图谱
Fig． 2 Images of 2-DE in B． acuminate total proteins from different IPG strips
2． 3 上样量对 2-DE图谱的影响
选择 24 cm、pH值为 4． 0 － 7． 0 IPG胶条，不同上样量的 2-DE图谱见图 3。上样量为 1． 3 mg 时，2-DE
图谱上的蛋白点少且不清晰、分辨率低，会影响后期软件分析(图 3A)。上样量为 1． 5 mg时，2-DE 图谱蛋
白点多且呈圆形或椭圆形，蛋白点分离效果与前者相比较好(图 3B)。因此，对于 24 cm、pH值为 4． 0 － 7．
0 的 IPG胶条，选用鸳鸯茉莉总蛋白上样量为 1． 5 mg较为合适。
A．上样量 1． 3 mg;B．上样量 1． 5 mg
图 3 鸳鸯茉莉花瓣总蛋白不同上样量的 2-DE图谱
Fig． 3 Images of 2-DE in B． acuminate total proteins from different loaded proteins
3 讨论与结论
近年来，双向电泳技术在农业、医学、植物等领域得到广泛应用，对果实、叶片等蛋白质的研究报道越
来越多，不同的材料、组织器官等都有不同的应用体系［11］。双向电泳分离技术试验过程受多种因素影响，
只有进行优化才能获得较好的试验结果。在进行第一向等点聚焦电泳时，首先要选择合适的 IPG胶条，胶
条长度、pH范围均会导致蛋白点分布不均匀、酸碱端不能有效分离，直接影响 2-DE 图谱的质量。Bar-aki-
va et al［10］采用 pH值为 3 － 10、13 cm的 IPG胶条对鸳鸯茉莉花瓣进行双向电泳试验，蛋白点不多，分离效
果不好。本研究采用了 pH值为 3． 0 － 5． 6、24 cm和 pH值为 4． 0 － 7． 0、24 cm两种 IPG胶条进行进一步优
化，其中，pH值为 4． 0 － 7． 0 的 IPG胶条 2-DE 图谱质量相对较好。蛋白质上样量与胶条长度密切相关。
·562·第 4 期 李敏等:鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的优化
上样量较大会使等点聚焦受到影响，电压上升较慢，导致部分蛋白出现共迁移现象，即不同的蛋白质出现
在胶条的相同位置［6］;上样量较少会使蛋白点不清晰并且不利于软件的检测，且蛋白点的数量也随着上
样量的减少而降低［12］。有些蛋白有可能在胶条上无法显示，直接影响试验结果。
本试验表明，鸳鸯茉莉花瓣双向电泳技术优化最佳条件为:鸳鸯茉莉花瓣蛋白质图谱在 24 cm、pH 值
为 4． 0 － 7． 0 的 IPG胶条范围内，上样量为 1． 5 mg，所得出的 2-DE 图谱背景清晰、蛋白点明显且拖尾较
少，有利于后续的试验。
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(责任编辑:张云燕)
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