全 文 ：第 39卷第 1期第 73页
2010年 2月 　　　　
华中科技大学学报(医学版)
A cta Med Univ Sci Technol H uazhong
　　　　 Vol.39　No.1　P.73
Feb.　2010
＊湖北省卫生厅科研基金资助项目(No.9325)
冯新民 ,男 , 1966年生 , 主治医师 , 医学博士 , E-mai l:fx m116@ya-
h oo.cn
聚花过路黄对原代大鼠脑微血管内皮细胞糖-氧
剥夺诱导下 NF-κB p65 蛋白及下游
靶基因 ICAM-1表达的影响＊
冯新民1 　　何世银1 　　樊　红2 　　谢纪文1 　　沈　霖1
华中科技大学同济医学院附属协和医院　1 中西医结合科 , 2 急诊内科 ,武汉　430022
摘要　目的　通过测定聚花过路黄(Lysimachia conge stifloa hemsl , LCH)对原代大鼠脑微血管内皮细胞(brain mi-
crovascular endo thelial cells , BMECs)糖-氧剥夺诱导下 NF-κB p65 蛋白及下游靶基因 ICAM-1 表达的变化 , 探讨其可能
的细胞保护机制。方法　选用初生的 Wista r大鼠 , 建立脑微血管内皮细胞培养模型 ,以糖-氧剥夺方法(oxygen-gluco se
depriva tion , OGD)复制体外模拟的脑缺血再灌注模型 , 观察试验各组(即正常组 、模型组 、LCH 低剂量组及 LCH 高剂量
组)缺氧缺糖 6 h、复氧复糖 18 h 后 BM ECs 的活性(CCK-8比色法)变化 ,相差显微镜下BMECs的细胞形态学改变 ,免疫
组化测定 NF-κB p65 蛋白表达的变化以及荧光定量 RT-PC R测定 NF-κB p65 mRNA 、ICAM-1 mRNA 表达的变化。结
果　BMECs 活性 , LCH 高 、低剂量组明显高于模型组(均 P<0.01);BMECs 的细胞损伤变化 , LCH 高剂量组明显轻于
模型组;NF-κB p65 阳性表达 , LCH 高 、低剂量组分别明显低于模型组(均 P<0.01);NF-κB p65 m RNA 、ICAM-1 m RNA
表达 , LCH 高 、低剂量组明显低于模型组(均 P<0.01), LCH 低剂量组高于 LCH 高剂量组(P<0.01)。结论　LCH 对
糖-氧剥夺诱导下的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用 , 其机制可能与其抑制 NF-κB p65 的活化及其下游靶基因
ICAM-1 的异常表达有关。其抑制效应可能存在一定的量-效关系。
关键词　聚花过路黄;　脑微血管内皮细胞;　核因子κB p65;　细胞间黏附分子 1;　神经保护
中图法分类号　R845.2　　DOI:10.3870/ j.issn.1672-0741.2010.01.018
Impact of Lysimachia Congestifloa Hemsl on Expressions of NF-κB p65 Protein and Its
Downstream Target Gene ICAM-1 mRNA Induced byOxygen-Glucose
Deprivation in Rat Primary Brain Microvascular Endothelial Cells
Feng Xinmin
1 , He Shiyin1 ,Fan Hong2 et al
1Department o f Integrated TCM and Western Medicine , 2Department o f Emer gency Medicine ,
Union Hosp ital , Tongji Medical College , H uaz hong University o f Science and Technology , Wuhan 430022 , China
Abstract　Objective　To investig ate the effects of Ly simachia congestif loa hem sl(LCH)on the expression of NF-κB p65
protein and its dow nstream tar get g ene ICAM-1 m RNA after ox ygen-g lucose deprivation(OGD)in primary brain mic rova scular
endothelial cells(BMECs)o f ra ts.Methods　P rima ry BMECs in ra ts were subjected to OGD in the absence o r presence o f
LCH.The viability of BM ECs w as assessed by CCK-8 , the mo rpho lo gical changes of BMECs w ere examined unde r a phase-con-
trast micro scope , the expre ssion lev el of NF-κB p65 pro tein in BM ECs w as detected by using immunohisto chemical staining , and
the expression lev el of ICAM-1 mRNA in BMECs was a ssayed by fluo rescent quantitation RT-PCR.Results　The viability o f
BMECs in high-dose LCH group o r low-do se LCH group w as significantly higher than that in model g roup(bo th P<0.01).The
damage of BM ECs in high-dose LC H group w as significantly milder than that in model g roup.The po sitive e xpression rate o f
NF-κB p65 in BM ECs of high-do se LCH group o r low-do se LCH group w as significantly lowe r than that of model gr oup(bo th
P<0.01).The positive expression ra te of ICAM-1 mRNA in BM ECs o f high-do se LCH group w as significantly low er than that
in model g roup(P<0.01), and low-dose LCH group(P<0.01).Conclusion　LCH may play a cytoprotectiv e r ole in OGD-in-
duced cell damage by inhibiting the abno rmal expression o f NF-κB p65 and its downstream tar get gene ICAM-1 , and the inhibi-
to ry effects may be dose-dependent.
Key words　Lysimachia conge stifloa hemsl;　brain micr ova scular endothelial cells;　NF-κB p65;　ICAM-1;　neuropro-
tection
　　聚花过路黄(Lysimachia congest iflo a hemsl ,
LCH)为报春花科珍珠菜属植物 ,主产我国中南 、西
南地区 ,具有活血化瘀 ,祛风散寒 ,消肿止痛 ,清热解
毒之功效 , 用于治疗跌打损伤 、风湿痹痛 、痢疾腹
泻[ 1] 。在湖北民间 ,它俗称为“中风草” ,单味全草入
药 ,用于治疗中风。上世纪 80年代邓来送等[ 2] 进行
过植物学鉴定 ,并制成注射剂用于脑卒中治疗 ,取得
较好疗效 。本研究通过观察 LCH 药物血清对脑微
血管内皮细胞(brain microvascular endo thelial
cells , BMECs)核因子 κB(NF-κB)p65表达及其下
游炎症反应相关靶基因细胞间黏附分子-1(ICAM-
1)表达的影响 ,探讨其作用机制。
1　材料和方法
1.1　实验动物 、主要试剂及仪器
新生的3 ～ 5 d Wistar大鼠(华中科技大学同济
医学院实验动物学部提供)。DMEM 细胞培养液
(Invi tro gen公司),胎牛血清(四季青生物公司),胰
蛋白酶 、Ⅱ型胶原酶(Sigma 公司),兔抗大鼠Ⅷ因子
相关抗原多克隆抗体(Sigma 公司),兔抗大鼠 NF-
κB p65多克隆抗体 、ICAM-1多克隆抗体(武汉博士
德生物技术有限公司),抗 β-actin 单克隆抗体(Sig-
ma 公司), Trizo l 溶液(购自美国 Gibco 公司),
SYBR G reenⅠ荧光染料(购自美国 Biotium 公司),
NF-κB p65 , ICAM-1引物购自上海 Invit rog en生物
技术有限公司 。CK ×41 相差显微镜(日本 Olym-
pus公司),F TC-2000荧光定量 PCR 仪(上海枫岭
生物技术有限公司)。
1.2　实验药物血清及主要试剂配制
LCH 药物血清的制备:取健康清洁级 250 ～
300 g Wistar 大鼠 20 只 ,用 LCH 液(用量 8 g/kg
体重),2次/d ,连续灌胃 1 周 ,于第 7 天用药后 1 h
腹主动脉采血 , 收集分离的血清 ,离心 3 次 , 0.22
μm微孔滤膜过滤除菌 ,56℃, 30 min 灭活补体 ,得
到 LCH 含药血清 , -70℃保存备用。
Kreb s 液的配制:NaCl 119 mmol/ L;KCl 4.7
mmo l/L ;KH 2PO 4 1.2 mmo l/L ;NaHCO3 25
mmo l/L ;CaC l2 2.5 mmol/L;MgCl2 1 mmo l/L ,双
蒸水溶解 ,调 pH 为 7.2 , 0.22 μm 滤器过滤除菌 ,临
用前配制 ,作为糖-氧剥夺时细胞的培养液。
1.3　大鼠脑微血管内皮细胞原代和传代培养
参考 Baiguer 等[ 3-4] 的方法并略加改进。取新
生的 3 ～ 5 d Wistar(雌 、雄不拘)大鼠颈动脉放血处
死 ,无菌操作下取出两侧大脑半球 ,剔除软脑膜 、大
血管 ,取大脑皮质 ,剪碎 ,匀浆 ,依次经过 100目 、200
目筛网过滤后 ,收集微血管段 ,经 0.01%的 Ⅱ型胶
原酶 37℃水浴中振荡消化 20 min ,离心弃上清 ,转
入含 20%胎牛血清的 DMEM 完全培养液的 100
mL 玻璃培养瓶 ,静置培养 , 4 h 换液 1次 ,以后每 3
天换液 1次 ,待细胞生长 7 ～ 9 d ,呈现“铺路卵石”
状 ,用 0.25%的胰蛋白酶(含 0.02%的 EDTA)消
化 ,按 1∶2 比例进行传代培养。用Ⅷ因子相关抗原
抗体作免疫细胞化学鉴定 BMECs , 第 3 代细胞
95%以上为 BMECs ,用于实验 。
1.4　体外脑缺血再灌注模型的复制
取第 3代 BMECs ,消化制成单细胞悬液 ,调整
细胞密度为 1×105/mL ,分批次分别接种于 96孔 、6
孔培养板中(Cosmo 公司), 培养 24 h 后 , 参考
Zhang 等[ 5] 糖-氧剥夺方法 ,模拟体内的脑缺血再灌
注过程 。
缺糖缺氧:用无糖的 K reb s液置换原培养液
后 ,放入自制的密封缺氧罐中 ,通入 95%N 2 和 5%
CO 2的混合气体 , 按 0.5 L/min 流量输气 15 ～ 20
min ,向上排空气法排空密闭罐中的空气后 ,夹闭密
封缺氧罐的进 、出口通气管 ,将内装培养细胞的密封
缺氧罐置于 37℃培养箱 ,密闭缺糖缺氧条件下培养
6 h 。
复糖复氧:从密闭罐中取出培养细胞 ,将无糖的
Kreb s液置换为 DMEM 培养液 , 放入 37℃, 5%
CO 2培养箱中正常条件下孵化 18 h 。
1.5　实验分组及处理
实验随机分为:正常组 、模型组 、LCH 低剂量
组 、LCH 高剂量组。每组设 6 个复孔。正常组:细
胞在 DMEM 完全培养液 ,37℃, 5%CO 2 培养箱中
正常条件下孵化 24 h 。模型组:先用无糖的Kreb液
替代 DMEM 培养液 ,37℃密闭罐中孵化 6 h ,随后
在 37℃,5%CO 2 培养箱 、DMEM 培养液中正常孵
化 18 h 。LCH 低剂量组:先用无糖的 K reb液加被
稀释 1 倍的 LCH 药物血清替代 DMEM 培养液 ,
37℃密闭罐中孵化 6 h ,随后在 37℃,5%CO 2 培养
箱 、DMEM 培养液加被稀释 1倍的 LCH 药物血清
中孵化 18 h 。LCH 高剂量组:先用无糖的 Kreb液
加未被稀释的 LCH 药物血清替代 DMEM 培养液 ,
37℃密闭罐中孵化 6 h ,随后在 37℃,5%CO 2 培养
箱 、DMEM 培养液加未被稀释的 LCH 药物血清中
孵化 18 h。
1.6　CCK-8 比色法检测 BMECs活性
缺氧 6 h 再灌 18 h 后 ,各组培养细胞弃去培养
液;各培养孔分别加入 DMEM 培养液 100 μL 、10%
CCK-8 10 μL ,置 37℃培养箱 ,孵育 4 h ,设空白对
照 ,振荡器振荡 10 min ,酶标仪 450 nm 波长 ,无细
胞空白对照孔调零 ,测定各孔吸光度(A)值 ,每孔复
测 3次取均值。细胞的活性用 A值表示 。
·74· 华中科技大学学报(医学版)　　2010年 2月第 39卷第 1期
1.7　相差显微镜下细胞形态学观察
分别于缺血 6 h 、复灌 18 h后 ,相差显微镜下观
察各组细胞形态学变化。
1.8　免疫组化检测细胞 NF-κB p65
将第 3 代 BMECs消化制成单细胞悬液 ,接种
于铺有爬片的 6 孔培养板 , 调整细胞密度为 1 ×
105/mL ,实验分上述 4组 ,每组设 6个复孔;常规培
养 3 d后 ,实验组进行缺糖缺氧 6 h ,复糖复氧培养
18 h干预 ,弃去各组培养液 , 4℃ pH7.2的 PBS 缓
冲液漂洗细胞 3次 , 4℃4%多聚甲醛 PBS缓冲液固
定15 min ,4℃冰箱保存备测 。NF-κB p65免疫组化
检测 ,SABC 法按试剂盒说明书进行 。阴性对照用
PBS 代替一抗 。阳性细胞为细胞胞核着色 ,呈棕黄
色。光镜下观察 ,随机选取 10个不重复的高倍(200
倍)视野 ,输入 HAIPS-1000 彩色病理图像分析系
统 ,测定阳性细胞的积分吸光度平均值 。
1.9　荧光定量 RT-PCR测定 NF-κB p65、ICAM-1 mRNA 的
表达
　　缺糖缺氧 6 h ,复糖复氧 18 h 处理后 ,各实验组
细胞弃去原培养液 , 4℃PBS缓冲液漂洗细胞 3次 ,
吸干液体 ,加入 Trizo l ,提取总 mRNA;在逆转录酶
M-MLV 的作用下 , mRNA 逆转录为 cDNA 分子;
应用 SYBR GreenⅠ荧光染料技术行实时定量 PCR
反应 ,获取各组标本的标准曲线 ,由 PCR仪自带软
件自动分析计算出 Ct值 ,再由计算公式:待测样品
相对值=2-■■Ct ,算出待测样品的相对值[ 6] 。反应
条件:94℃3 m in;94℃30 s 58℃30 s , 72℃30 s , 45
个循环 。反应体系在 F TC2000型荧光定量 PCR仪
上进行 ,荧光实时定量 PCR扩增目的基因及管家基
因 β-actin的引物设计见表 1。
1.10　统计学处理
计量资料以 x ±s表示。采用 SPSS 12.0统计
软件进行分析 ,多组间比较采用 One-Way ANOVA
方差分析 ,两两比较满足方差齐性计量资料采用
LSD-t检验 ,不满足方差齐性计量资料采用 Tam-
bane s T 2检验 ,以 P<0.05为差异具有统计学意义。
表 1　PCR反应中所用引物及其碱基序列
基因 碱基序列(5′-3′)
NF-κB 上游(F)5′-GCCCAGGCGGACA TCT ACAAG-3′
下游(R)5′-GGCCAAATGAAAGGAG TGG TGAG-3′
ICAM-1 上游(F)5′-CTGTCAAACGGGAGATGAATGG-3′
下游(R)5′-CTGGCGGTAA TAGGTGT AAATGG-3′
β-act in 上游(F)5′-GA TGG TGAAGGT CGG TGTG-3′
下游(R)5′-GAGG TCAATGAAGGGG TCG-3′
2　结果
2.1　聚花过路黄对 BMECs糖-氧剥夺处理后细胞活性变化
的影响
　　结果见表 2。
　　　表 2　LCH 对 BMECs糖-氧剥夺处理后
活性变化的影响( x±s)
组别 n A450nm
正常组 6 0.484±0.005
模型组 6 0.193±0.031＊
LCH 低剂量组 6 0.383±0.022＊Δ
LCH 高剂量组 6 0.409±0.024＊Δ
　　与正常组比较 ＊P<0.01;与模型组比较 ΔP<0.01
从表 2可以看出:缺氧复氧处理后各组细胞活
性(A值)较正常组显著降低(均 P<0.01),说明缺
氧复氧处理后 ,细胞生长均受到抑制;用药各组与模
型组比较 ,细胞活性增强 ,差异具有统计学意义(均
P <0.01);LCH 高剂量组与 LCH 低剂量组差异无
统计学意义(P>0.05)。
2.2　聚花过路黄对 BMECs糖-氧剥夺处理后细胞形态学变
化的影响
　　结果见图 1。
BMECs糖-氧剥夺 6 h ,复糖复氧 18 h 处理后 ,
模型组(A)大量细胞漂浮死亡 ,少量存活细胞脱壁
A:模型组;B:LCH 低剂量组;C:LCH 高剂量组
图 1　相差显微镜观察各组细胞形态学变化(×40)
·75·冯新民等.聚花过路黄对原代大鼠脑微血管内皮细胞糖-氧剥夺诱导下NF-κB p65蛋白及下游靶基因 ICAM-1表达的影响
呈球形改变 ,部分皱缩成团;LCH 低剂量组(B)少
量细胞漂浮死亡 , 大量存活细胞脱壁呈球形改变;
LCH 高剂量组(C)漂浮死亡细胞少见 ,大量细胞仍
存活成簇状生长 ,部分细胞脱壁呈球形改变。比较
而言 ,模型组损伤程度最重 , LCH 低剂量组次之 ,
LCH 高剂量组最轻 。
2.3　聚花过路黄对 BMECs糖-氧剥夺处理后 NF-κB p65 免
疫组化检测结果的影响
　　结果见表 3 、图 2。
　表 3　NF-κB p65蛋白免疫组化平均吸光度值
比较( x ±s)
组别 n 平均吸光度
正常组 6 0.025±0.014
模型组 6 0.362±0.033＊
LCH 低剂量组 6 0.215±0.029＊Δ
LCH 高剂量组 6 0.182±0.032＊Δ
　　与正常组比较＊P<0.01;与模型组比较ΔP<0.01
A:正常组;B:模型组;C:LCH 低剂量组;D:LCH 高剂量组
图 2　BMECs糖-氧剥夺处理后各组 NF-κB p65 蛋白免疫组化检测结果(SABC 法 , ×200)
　　如图 2所示 ,阳性细胞为细胞核呈棕黄色 。正
常组(A)未见明显阳性表达;模型组(B)阳性细胞表
达最强;LCH 低剂量组(C)、 LCH 高剂量组(D)均
可见阳性细胞表达 ,但强度不及模型组。从表 3 可
以看出:BMECs 经糖-氧剥夺干预处理后各组 NF-
κB p65蛋白表达较正常组明显增高(均 P <0.01),
而模型组 BMECs 糖-氧剥夺处理后 NF-κB p65 蛋
白表达高于药物干预各组 ,差异有统计学意义(均 P
<0.01),在药物干预各组中 , LCH 高剂量组 NF-κB
p65蛋白的表达量最低 ,但与 LCH 低剂量组比较差
异无统计学意义(P >0.05)。统计学分析表明:糖-
氧剥夺干预处理 BMECs , 可激活 BMEC s NF-κB
p65蛋白的表达 ,这种异常表达可为 LCH 所部分抑
制。
2.4　荧光定量 RT-PCR 测定 NF-κB p65、ICAM-1 mRNA
表达的变化
　　结果见表 4。
　　表 4　荧光定量 RT-PCR测定 NF-κB p65 、
ICAM-1 mRNA 表达( x±s)
组别 n
2-ΔΔC t(相对值)
NF-κB p65 mRNA ICAM-1 mRNA
模型组 6 0.015 22±0.000 42 0.054 60±0.001 41
LCH 低剂量组 6 0.007 39±0.000 27＊ 0.038 67±0.001 42＊
LCH 高剂量组 6 0.004 12±0.000 32＊Δ0.028 21±0.001 13＊Δ
　　与模型组比较＊P<0.01;与 LCH 低剂量组比较 ΔP<0.01
BMECs糖-氧剥夺干预处理后 ,药物干预各组
(LCH 高 、低剂量组)的 NF-κB p65 、ICAM-1 mR-
NA 表达量明显低于模型组(均 P<0.01),在药物
干预各组中 ,LCH 高剂量组二者的表达量最低 ,与
LCH 低剂量组比较 ,差异均有统计学意义(均 P <
0.01)。统计学分析表明:糖-氧剥夺干预处理
BMECs ,可引起 NF-κB p65 、ICAM-1 mRNA 表达
增强 ,而 LCH 高 、低剂量组对其存在不同程度的抑
·76· 华中科技大学学报(医学版)　　2010年 2月第 39卷第 1期
制效应。
3　讨论
脑微血管内皮的损伤是多种疾病病理过程的始
动和关键环节 ,尤其在脑卒中的发生中起主导作
用[ 7] 。因此深入研究脑微血管内皮细胞的功能及其
保护和调节机制 ,对脑血管疾病病理生理的研究 ,以
及临床治疗方法的创新有着重要的意义 。
体外缺血再灌注损伤模型的制备方法是给体外
培养细胞以缺氧缺糖 ,再复氧复糖等干预手段 ,来模
拟体内细胞缺血再灌注的病理过程;但是 ,目前还没
有统一的该模型的制作规范标准 。我们参考 Zhang
等[ 5]的实验方法 ,自制缺氧密闭罐 ,以 Kreb s液加
氮气 、二氧化碳混合气(95%N 2 +5%CO 2)营造的缺
氧缺糖环境模拟体内缺血过程 ,以 DMEM 完全培
养液加正常培养条件来模拟体内再灌注过程 。通过
对缺氧缺糖6 h ,复氧复糖18 h后BMECs形态学变
化和细胞活性变化结果的分析 ,表明该模型的制备
是成功的 。它为研究 LCH 的药效机制提供了可靠
的条件保证。
核因子κB(NF-κB)是一种重要的转录因子 ,广
泛存在于真核细胞中 ,参与许多基因表达的调控 。
近年来研究发现 , NF-κB 还存在于脑血管内皮细
胞 、神经细胞和胶质细胞中 ,与脑缺血及再灌注损伤
的免疫炎症反应密切相关。在急性脑缺血时 , IκB
激酶被激活 ,导致 IκB磷酸化 ,与 NF-κB 解离 , NF-
κB迅速转移到核内与靶基因的κB 位点结合 ,促使
靶基因炎症基因表达 ,参与脑缺血再灌注损伤等病
理过程[ 8] 。Howard等[ 9]用培养的人脑微血管内皮
细胞(HBMEC)缺氧再复氧 ,发现复氧 15 ～ 30 m in
后 NF-κB即被迅速活化 , 4 h 后 ICAM-1 基因表达
上调 。用抗氧化剂 、酶阻滞蛋白等可阻滞 NF-κB 活
性和 ICAM-1基因表达上调 ,这说明激活的 NF-κB
在 ICAM-1上调中起重要作用。
本实验结果显示 ,缺氧缺糖 6 h ,再复糖复氧 18
h可诱导 BMECs 高表达 NF-κB p65 和 ICAM-1
mRNA ,二者的变化是同步的 、平行的 ,表明活化的
NF-κB p65可上调 ICAM-1 mRNA 的表达 ,本实验
结果与 Howard等[ 9] 一致 。此外 ,本实验结果还显
示 ,LCH 可部分抑制这种 NF-κB p65 、ICAM-1 mR-
NA 的高表达效应 ,而且 LCH 高剂量组的这种抑制
效应要强于其低剂量组。本研究表明 ,在脑缺血再
灌注损伤机制中 ,NF-κB 可能是一个关键节点。脑
缺血缺氧时 ,激活 NF-κB ,促进其下游炎症靶基因
ICAM-1的转录 ,从而激发脑缺血再灌注损伤的炎
症反应过程 。中药 LCH 的抗炎症损伤作用可能与
其抑制 N F-κB 的活化有关。是否存在 NF-κB 上游
信号分子的参与有待进一步研究 。
总之 ,本研究通过观察 、分析脑微血管内皮细胞
在糖-氧剥夺诱导下所产生的病理损伤反应和 LCH
对这种损伤反应的干预效果 ,不难发现 LCH 对糖-
氧剥夺诱导的脑微血管内皮细胞的损伤反应具有保
护作用 ,其保护机制可能与其抑制 NF-κB p65的活
化及其下游靶基因 ICAM-1的异常表达有关 。它的
这种效应可能存在一定的量-效关系 。
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(2009-06-02　收稿)
·77·冯新民等.聚花过路黄对原代大鼠脑微血管内皮细胞糖-氧剥夺诱导下NF-κB p65蛋白及下游靶基因 ICAM-1表达的影响