全 文 ：2种方法制备硫酸化小刺猴头菌多糖
王新宇1 , 2 , 迟　祥3 , 石　亮3 , 沈思捷2 , 王　雪4 , 宋　慧2
1.白求恩医科大学制药厂 , 长春 130012;2.吉林农业大学生命科学学院 , 长春 130118;
3.长春生物制品研究所 , 长春 130062;4.大连珍奥药业有限公司 , 大连 116620
摘　要:采用氯磺酸—吡啶法和浓硫酸法制备硫酸化小刺猴头菌多糖 , 傅立叶变换红外光谱鉴定硫酸化多
糖。结果表明:修饰后的多糖在 1 259.17 cm-1和 807.73 cm-1或 1 226.44 cm-1处出现硫酸酯键吸收峰 , 表明硫
酸基团已经与多糖结合成酯。采用氯化钡—明胶法测定硫酸根含量 , 制备取代度为 0.94或 0.82 的硫酸化多
糖。
关键词:小刺猴头菌;多糖;氯磺酸—吡啶法;浓硫酸法;氯化钡—明胶法
中图分类号:R282.71　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2013)06-0704-04
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/ detail/ 22.1100.S.20131008.1450.007.html
引文格式:王新宇 , 迟祥 ,石亮 , 等.2 种方法制备硫酸化小刺猴头菌多糖[ J] .吉林农业大学学报 , 2013 , 35(6):
704-707.
Two Methods to Prepare Sulfated Polysaccharides from Hericium caput-
medusae
WANG Xin-yu1, 2 , CHI Xiang3 , SHI Liang3 , SHEN Si-jie2 , WANG Xue4 , SONG Hui2
1.Pharmaceutical Factory of Norman Bethune Medical University , Changchun 130012 , China;2.Col-
lege of LifeScience , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;3.Changchun Institute of
Biological Products , Changchun 130062 , China;4.Dalian Zhen-Ao Pharmaceutical Co., Ltd.,
Dalian 116620 , China
Abstract:Sulfated Hericium caput-medusae polysaccharides were prepared through wolfrom and sulfuric
acid methods and the obtained polysaccharides were characterized by Fourier-transform infrared spectra.
The results showed the polysaccharide emerged absorption peak corresponded to sulfate ester at
1 259.17 cm-1and 807.73 cm-1 or 1 226.44 cm-1after modification , indicating the group of sulphuric
acid had conjugated ester with polysaccharide.The content of sulphate was determined through barium-
chloride gelatin procedures.Sulfated polysaccharides with substitution degrees of 0.94 and 0.82 were
prepared.
Key words:Hericium caput-medusae;polysaccharide;wolfrom method;sulfuric acid method;barium-
chloride gelatin
　　小刺猴头菌(Hericium caput-medusae)是一种
珍贵的药食兼用菌 。目前 ,对于猴头菌的研究主
要集中在猴头菌中的多糖类物质 ,特别是在猴头
菌多糖改性方面 , 如对猴头菌多糖进行硫酸
化[ 1-5] 。硫酸化多糖是一类糖羟基上带有硫酸根
的多糖 ,又称硫酸酯多糖 。研究发现硫酸化多糖 ,

通讯作者
基金项目:国家科技支撑计划项目(2007BAI38B06-03)
作者简介:王新宇 ,女 ,硕士 ,研究方向:菌物生物化学。
收稿日期:2012-07-05　　网络出版时间:2013-10-08 14:50
吉林农业大学学报　2013 ,35(6):704 ～ 707 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
即硫酸酯多糖具有很强的生物活性 ,如抗艾滋病 、
抗病毒 、抗凝血活性等[ 6-8] ,但天然的硫酸酯多糖
较少 ,为提高多糖的生物活性或增强多糖原有的
生物功能 ,多糖的硫酸酯修饰引起人们越来越多
的关注。人工合成硫酸酯多糖的方法有氯磺酸—
吡啶法(Wolfrom 法)、浓硫酸法 、三氧化硫 —吡啶
法 、氯磺酸 —甲酰胺法 、三氧化硫—二甲基甲酰胺
法等[ 9-17] 。本试验采用Wolfrom 法和浓硫酸法制
备小刺猴头菌硫酸化多糖 ,旨在为制备硫酸化小
刺猴头菌多糖提供参考 ,为更好地开发利用小刺
猴头菌资源 ,特别是小刺猴头菌多糖在生物制药
方面的开发应用提供理论依据 。
1　试验材料 、仪器与试剂
1.1　材料
小刺猴头液体深层发酵浸膏多糖(由白求恩
医科大学制药厂提供),为经醇沉分级 ,除蛋白及
透析处理后的多糖(HLSF)。
1.2　仪器
台式冷冻离心机(3K18 SIGMA), 2 FD-B1冷
冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司),可见
分光光度计TU-1810(上海光谱仪器有限公司),
-80 ℃冰箱(SANYO),Haier冰箱(青岛海尔股份
有限公司),FT-IR傅立叶变换红外光谱仪(Nico-
let Avatar)。
1.3　试剂
明胶(购自上海生工生物工程有限公司),氯
化钡(购自天津市凯通化学试剂厂),硫酸铵(购自
沈阳市试剂一厂),无水硫酸钠(购自广东汕头市
陇化工厂),吡啶(购自天津市光复科技发展有限
公司),甲酰胺(购自天津市富宇精细化工有限公
司),三氯乙酸(购自天津市光复精细化工研究
所),溴化钾(购自天津市北方化玻采购销售中
心),氯磺酸(购自西亚-长春贝塔生物试剂有限
公司),浓硫酸 、正丁醇 、浓盐酸 、氢氧化钠 、无水乙
醇(购自北京化工厂),以上试剂均为分析纯。
2　试验方法
2.1　Wolfrom法制备硫酸化多糖
制备酯化试剂:向三颈烧瓶中加入 6 mL 吡
啶 ,缓慢滴入 6 mL氯磺酸 ,盐水 —冰浴上操作 ,滴
入时会产生大量白烟 ,反应结束后为淡黄色固体。
称取 200 mg 小刺猴头液体深层发酵浸膏多
糖 ,加 12 mL 甲酰胺制成悬浮液 ,与酯化试剂反
应 ,用 2 mol/L 氢氧化钠调 pH 至中性 ,透析 ,浓
缩 ,加入 3倍无水乙醇 ,将沉淀冷冻干燥得棕色小
刺猴头液体深层发酵浸膏多糖硫酸化衍生物 ,命
名为 HLSFL ,保存备用。
2.2　浓硫酸法制备硫酸化多糖
称取 1 g 硫酸铵 ,与 3 mL 正丁醇混和 ,再加
7 mL浓硫酸反应 。取 200 mg 小刺猴头液体深层
发酵浸膏多糖加 5 mL甲酰胺制成悬浮液 ,将悬浮
液与上述溶液混匀 ,用 2 mol/L 氢氧化钠调 pH至
中性 ,透析 ,浓缩 ,加入 3倍无水乙醇 ,将沉淀冷冻
干燥得棕色小刺猴头液体深层发酵浸膏多糖硫酸
化衍生物 ,命名为HLSFN ,保存备用。
2.3　红外光谱仪检测样品
对小刺猴头液体深层发酵浸膏多糖 、氯磺酸
吡啶法硫酸化多糖 、浓硫酸法硫酸化多糖分别进
行压片处理 ,在 4 000 ～ 400 cm-1区间扫描红外吸
收 ,用傅立叶变换红外光谱记录仪记录红外光谱。
2.4　检测硫酸根含量
采用氯化钡 —明胶法测定样品的硫酸根含
量[ 18] ,具体步骤如下:
标准曲线的测定:精确量取 0.00 ,0.04 ,0.08 ,
0.12 ,0.16 ,0.20 mL 标准硫酸基溶液于具塞试管
中 ,补加 1mol/L HCl至体积为0.20 mL ,分别加入
3.80 mL 配制好的三氯乙酸溶液和 1.00 mL 氯化
钡—明胶试剂 ,混匀后于室温下静置 20 min ,空白
管是不含标准液的 0号管 ,于 360 nm 下测定吸光
度。以测得的吸光度值为纵坐标 ,以硫酸根含量
为横坐标 ,绘制标准曲线 。
样品的硫酸根含量测定:首先进行样品的酸
水解 , 分别称取 HLSF 、HLSFL 、HLSFN 3 mg , 加
1 mol/L的 HCL 3.0 mL ,密封 ,沸水浴 5 h ,冷却至
室温 , 1万 r/min 离心 10 min ,取 0.20 mL 进行测
定 ,加入 3.80 mL 三氯乙酸溶液和 1.00 mL 氯化
钡—明胶试剂 ,混匀后于室温下静置 20 min ,于
360 nm下测定吸光度。
取代度计算公式:DS =1.62 ×S%/(32 -
1.02×S%),其中 S%为 SO42-含量。取代度表示
多糖中每个糖单位上的活性羟基被硫酸根取代的
数量 。
3　结果与分析
HLSF 的红外光谱显示在 1 000 ～ 1 100 cm-1
705王新宇等:2种方法制备硫酸化小刺猴头菌多糖
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
的范围内具有 1 078.71 cm-1的吸收峰 ,是由多糖
C —O 键伸缩振动引起的吸收峰;在 1 400 ～
1 530 cm-1范围内具有 1 437.89 cm-1的吸收峰 ,
是由多糖 C —H 键变角振动引起的吸收峰;在
2 800 ～ 2 900 cm-1范围内具有 2 957.26 cm-1的吸
收峰 ,是由多糖的 C —H 键伸缩振动引起的;在
3 400 ～ 3 500 cm-1范围内具有 3 447.34 cm-1的吸
收峰 ,是由多糖的 —OH 键伸缩振动引起的;以上
显示出多糖的母体特征吸收峰 。
HLSFL 的 红 外 光 谱 显 示 在 1 042.71 ,
1 457.85 ,2 958.45 ,3 447.84 cm-1的位置出现吸收
峰 ,为 HLSF 的母体特征吸收峰;在 1 259.17 cm-1
出现了强吸收峰 ,表明有 S O键的伸缩振动 ,在
807.73 cm-1出现了 C—O —S键的伸缩振动 ,以上
硫酸酯键特征吸收峰表明硫酸基团取代了羟基上
的氢 ,硫酸基团已经与多糖结合成酯。
HLSFN 的 红 外 光 谱 显 示 在 1 039.45 ,
1 419.52 ,2 957.33 ,3 422.21 cm-1的位置出现吸收
峰 ,为 HLSF 的母体特征吸收峰;在 1 226.44 cm-1
出现了强吸收峰 ,表明有 S O键的伸缩振动 ,硫
酸酯键的特征吸收峰表明硫酸基团取代了羟基上
的氢 ,硫酸基团已经与多糖结合成酯。
以上结果表明多糖经硫酸化修饰后在
1 250 cm-1附近具有 S O特征吸收峰 ,表明多糖
中的羟基被硫酸基团取代 ,证明硫酸基团已经与
多糖结合成酯。采用Wolfrom 法与浓硫酸法制备
出了小刺猴头液体深层发酵浸膏多糖硫酸化衍生
物HLSFL和 HLSFN 。
为表征本试验中硫酸化多糖的取代度 ,采用
氯化钡—明胶法测定 HLSF 、HLSFL 、HLSFN 的硫
酸根含量 。硫酸根含量标准曲线见图 1。
图 1　硫酸根含量测定标准曲线
Fig.1.Calibration curve for the determination of sulfate
content
硫酸根含量标准曲线的回归方程为 y =
0.001x +0.007(r =0.999), 线性范围为 0 ～
40 μg/mL ,根据标准曲线及各样品在 360 nm下测
得的吸光度 ,计算出硫的百分含量 ,代入取代度的
计算公式:DS=1.62×S%/(32-1.02×S%)[ 19] ,
结果见表 1。
表 1　硫酸化程度
Table 1.Degree of substitution
样品
Sample
w(硫)/%
Sulfur
取代度
DS
HLSF 1.35 0.07
HLSFL 11.64 0.94
HLSFN 10.68 0.82
以上结果表明 HLSFL 含硫量为 11.64%,取
代度为 0.94;HLSFN含硫量为 10.68%,取代度为
0.82。Wolfrom 法比浓硫酸法取代度高 ,且许多研
究表明一定范围内硫酸根含量与多糖活性呈正相
关[ 20-21] 。Wolfrom 法比浓硫酸法较适合制备小刺
猴头菌多糖硫酸化衍生物 。
4　讨　论
Wolfrom法制备硫酸化小刺猴头菌多糖操作
简便 ,浓硫酸法制备硫酸化小刺猴头菌多糖成本
低。红外光谱图显示 2种硫酸化方法均可以用来
硫酸化小 刺猴 头菌多 糖 , 但 Wolfrom 法在
1 259.17 cm-1和 807.73 cm-1的振动吸收峰比浓
硫酸法强 ,表明Wolfrom 法优于浓硫酸法 ,与 Ueno
等[ 22]的研究结果一致。HLSF 的母体特征峰基本
不变 ,受硫酸根基团的影响 ,其他基团的特征峰相
比原来的位置 , 稍有偏离[ 23] 。颜邦干[ 24] 采用
Wolfrom 法制备了硫酸化香菇多糖 ,修饰后的香菇
多糖硫酸酯键的特征吸收峰与本试验结果稍有不
同 ,可能是由于多糖中的单糖组成不同 ,硫酸根基
团取代羟基的位置不同等因素导致的。取代度结
果显示 Wolfrom 法和浓硫酸法分别为 0.94 与
0.82 ,表明HLSFL 硫酸化程度更大一些 。目前已
报道的硫酸化物种有 40 余种 ,所测得取代度在
0.17 ～ 4.92范围内 ,关于如何提高小刺猴头菌硫
酸化衍生物的取代度 ,对此还需进一步的研究。
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