全 文 ：·制剂与质量·
木蹄层孔菌免疫活性多糖超声提取工艺研究
何概易南，雷林生* ，陈 洁，余传林，任 婧，陈娜娜
(南方医科大学药学院，广东 广州 510515)
摘要 目的:研究超声处理在提取木蹄层孔菌多糖(简称:木蹄多糖)中的应用，并筛选出最佳提取工艺。方
法:选用 L9(3
4)正交表，对超声时间、水提温度及水提时间三因素各选三个水平进行组合，以多糖提取率、多糖含量
及免疫刺激活性(刺激小鼠脾细胞代谢 MTT活力)作为评价指标，找出最适提取条件。结果:超声处理对木蹄多糖
免疫刺激活性的影响最为明显。以免疫刺激活性为指标，最佳提取工艺为:超声 30 min，水提温度 80 ℃，水提时间
2 h。结论:超声处理可以作为木蹄免疫活性多糖提取的一种有效工艺。
关键词 木蹄层孔菌;多糖;超声提取;免疫活性;正交试验
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001 － 4454(2011)08-1277-04
Process Optimization for Extraction of Immune Active Polysaccharides
from Fomes fomentarius by Introduction of Ultrasonication
HE Gai-yi-nan，LEI Lin-sheng，CHEN Jie，YU Chuan-lin，REN Jing，CHEN Na-na
(School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)
Abstract Objective:To study the optimal extraction process of immune active polysaccharides from Fomes fomentarius by intro-
duction of ultrasonication . Methods:An orthogonal experimental design of L9(3
4)was used to investigate the effects of ultrasonication
time，extraction temperature and extraction time on the extraction ratio，sugar content and immune stimulating activity (mouse spleno-
cyte metabolic activity measured with MTT colorimetry) of the polysaccharides and the optimal extraction process was
evaluated. Results:Ultrasonication treatment had the most remarkable effect on the immune stimulating activity of the polysaccha-
rides. The optimal extraction process for extraction of immune active polysaccharides was as follows:ultrasonication for 30min，extraction
temperature at 80℃ and water extraction time for 2h. Conclusion:Ultrasonication can be used as a useful technique for extraction of im-
mune active polysaccharides from Fomes fomentarius.
Key words Fomes fomentarius L. ex Fr.;Polysaccharide;Ultrasonication;Immune activity;Orthogonal experimentation
收稿日期:2011-05-04
基金项目:广东省自然科学基金(07005189)
作者简介:何概易南(1987-) ，男，硕士研究生，主要从事抗炎免疫药理学研究;Tel:020-61648167，E-mail:hegaishan@ sina. com. cn。
* 通讯作者:雷林生，Tel:020-61648167，E-mail:lls@ fimmu. com。
木蹄层孔菌(Fomes fomentarius L. ex Fr. ，简称:
木蹄)为多孔菌目真菌，多寄生在阔叶树杆或木桩
上，我国多数省份均有分布〔1〕。文献〔2〕报道木蹄多
糖可促进小鼠免疫细胞分泌细胞因子 TNF-α、IFN-
γ、IL-2 和增强小鼠的体液免疫及巨噬细胞的吞噬
功能。木蹄多糖一般从木蹄子实体中提取，得率受
子实体粉末颗粒大小、料水比、提取温度和提取时间
等因素的影响〔3〕。借鉴以往多糖提取的经验，本研
究引入超声因素，采用正交试验法考察了超声时间、
水提温度、水提时间对木蹄多糖的提取率、多糖含量
及免疫活性的影响，为超声法用于木蹄层孔菌多糖
的提取工艺优化提供依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 KQ2200E型超声波清洗器(昆山市超
声仪器有限公司) ，CO2 培养箱(美国 Forma Scientif-
ic 公司) ，RE-201E旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有
限责任公司) ，HHSII-4 型电热恒温水浴锅(上海医
疗器械五厂) ，连续波长酶标仪(Benchmark PlusTM，
Bio-RAD 公司) ，YJ-1450 型净化工作台(苏州净化
设备厂) ，SORVALL RC 5C 台式低温高速离心机
(美国杜邦公司)。
1. 2 材料 木蹄层孔菌子实体(产地:云南)购于
润康灵芝科技有限公司，MTT(Sigma 公司) ，RPMI-
1640 培养基(GIBCO公司产品) ，新生牛血清(杭州
四季青生物工程材料有限公司产品) ，HEPES(MD-
Bio，Inc分装) ，其余化学试剂均为分析纯。实验动
物 SPF级近交系 BALB /c 小鼠，雄性，10 周龄，体
质量(20 ± 2)g，由南方医科大学实验动物中心提
供，许可证号:SCXK(粤)2006-0015。
2 方法
·7721·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.08.001
2. 1 正交试验设计 正交设计选用 L9(3
4)正交
表，三因素分别为超声时间、水提温度及水提时间，
每个因素设三个水平进行考察，见表 1。以提取率、
多糖含量及脾细胞代谢 MTT 活力作为评价指标。
根据正交试验的综合评分选择最佳方案。
表 1 因素水平表
水平
A超声时间
/min
B水提温度
/℃
C水提时间
/ h
1 15 80 1
2 30 90 2
3 45 100 3
2. 2 木蹄多糖提取方法 精密称取木蹄层孔菌粉
30 g置圆底烧瓶中，加入 10 倍量乙醇，70 ℃水浴回
流 30 min作预处理，过滤，滤渣置圆底烧瓶中，加入
15 倍量水后按照正交水平表进行。先进行超声(因
素 A)处理，超声完成后，放入恒温水浴器内，按照水
提温度(因素 B)和时间(因素 C)条件的三水平平
行操作，水提完成后过滤，滤液于冷处放置过夜，抽
滤，滤液减压浓缩至约 100 mL，加入 3 倍量乙醇，冷
处放置过夜，抽滤，沉淀用 100 mL热水溶解，水浴蒸
至稍干后 60 ℃恒温干燥，得水溶性粗多糖。
2. 3 木蹄多糖提取率的计算
多糖提取率(%)= m /M ×W ×100
m:木蹄粗多糖，M:木蹄层孔菌粉，W:多糖含量
2. 4 木蹄多糖含量的测定
2. 4. 1 葡萄糖标准曲线制作:配制 1 mg /mL葡萄
糖溶液，然后适当的稀释成 0 ～ 0. 8 mg /mL。取 9 个
1. 5 mL EP 管，分别加入不同浓度的葡萄糖标准液
200 μL，然后加入 100 μL 5%苯酚溶液，混匀，再加
入 500 μL 98% 浓硫酸，混匀。在室温下放置 30
min，取 100 μL 到 96 孔板的小孔中，在 490 nm 波
长下测定吸光度。以 1 ～ 9 管葡萄糖含量(C)为横
坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并拟
合成回归方程。
2. 4. 2 样品中多糖含量的测定:在制作标准曲线
的同时，取 9 个 1. 5 mL EP管，分别加入木蹄多糖样
品溶液 200 μL，余下操作同标准曲线制作程序，最
后由标准曲线的回归方程计算出糖含量。
表 2 木蹄层孔菌多糖提取正交试验结果
试验号
A超声时间
/min
B 一次水提
温度 /℃
C一次水提
时间 /h
提取率
/%
多糖含量
/%
脾细胞代谢 MTT
活力 /珋x ± s
1 15 80 1 0. 479 61. 4 0. 2958 ± 0. 037
2 30 90 2 0. 681 63. 7 0. 2991 ± 0. 041
3 45 100 3 0. 995 94. 5 0. 2316 ± 0. 016
4 15 100 2 1. 002 92. 7 0. 2716 ± 0. 032
5 30 80 3 0. 638 88. 1 0. 2997 ± 0. 041
6 45 90 1 0. 667 62. 3 0. 2486 ± 0. 022
7 15 90 3 0. 754 60. 9 0. 2680 ± 0. 034
8 30 100 1 0. 797 53. 5 0. 2723 ± 0. 017
9 45 80 2 0. 685 56. 3 0. 2792 ± 0. 026
提取率
K1 2. 235 1. 802 1. 943 1. 943
K2 2. 116 2. 102 2. 368 2. 368
K3 2. 347 2. 794 2. 387 2. 387
R 0. 231 0. 993 0. 444 0. 444
多糖含量
K1 215. 0 205. 8 177. 2 177. 2
K2 205. 3 186. 9 212. 7 212. 7
K3 213. 1 240. 7 243. 5 243. 5
R 9. 6 53. 7 66. 3 66. 3
脾细胞代谢 MTT活力
K1 0. 8354 0. 8747 0. 8167 0. 8167
K2 0. 8712 0. 8157 0. 8499 0. 8499
K3 0. 7594 0. 7755 0. 7993 0. 7993
R 0. 1117 0. 0992 0. 0506 0. 0506
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2. 5 木蹄多糖体外促进小鼠脾细胞代谢 MTT 实
验 参照文献〔4〕方法进行，取健康 BALB /c 小鼠两
只，脱颈椎处死，无菌取出脾脏，常规制备脾细胞悬
液，用含 10%新生牛血清 RPMll640 培养液(以下简
称全培)调整细胞浓度为 6 × 106 个 /mL，在已加好
木蹄粗多糖样品(终浓度 125 mg /L，每个样品做 6
个复孔)或者空白对照(全培)的 96 孔板中每孔加
入上述细胞悬液 100 μL，使总体积为 200 μL，然后
置于培养箱中在饱和湿度、5%CO2、37 ℃条件下，培
养 48 h。在细胞培养结束前 4 h，于 96 孔板每孔中
加入 20 μL MTT溶液(5 mg /mL，生理盐水配制) ，再
继续培养 4 h，吸弃上清，每孔加入 DMSO 100 μL，充
分振荡混匀 10 min 后，用全自动酶标仪检测其 570
nm处的吸光度值(OD 值) ，以 OD 值的大小作为免
疫刺激活性的判断依据。
2. 6 统计学处理 采用 SPSS 11. 5 统计分析软件
(由南方医科大学生物统计系提供)对结果进行分
析。交互作用采用 L9(3
4)正交试验设计，多糖提取
率和含量分别用百分数表示，用其百分数参与统计
分析;细胞代谢活力以均数 ±标准差(Mean ± SD)表
示，用其均数参与统计分析;采用方差分析法对正交
实验结果进行分析，主效应显著性差异采用 LSD 方
法进行检验，显著性水准取 α = 0. 05，以 P ≦ 0. 05
时，判断为具有统计学意义。
3 结果
以提取率、多糖含量及脾细胞代谢 MTT 活力为
衡量指标，采用 L9(3
4)正交试验优化工艺参数 (结
果见表 2)。以提取率为指标，各因素对提取率影响
大小依次为 B ＞ C ＞ A，方差分析结果表明(见表 3-
1) ，除 B因素的改变对提取率有显著性影响外(P =
0. 022) ，其他因素的改变对提取率均无显著性影响
(P ＞ 0. 05)。根据 K 值大小可确定 A3B3C3 为最佳
组合，即最佳工艺为超声处理时间 45 min，水提温度
100 ℃，水提时间 3 h。以多糖含量为指标，各因素
对多糖含量影响大小依次为 C ＞ B ＞ A，方差分析结
果表明(见表 3-2) ，因素 A、B、C 的改变对多糖含量
均无显著性影响(P ＞ 0. 05) ，根据 K 值大小确定最
佳工艺为 A1B3C3，即最佳工艺为超声处理时间 15
min，水提温度 100 ℃，水提时间 3 h。以脾细胞代谢
MTT活力(免疫刺激活性)为指标，各因素的变化对
脾细胞代谢活力影响大小依次为 A ＞ B ＞ C，方差分
析结果表明(见表 3-3) ，三种因素的改变对活性均
有显著性影响(P = 0. 005，0. 006，0. 023) ，最佳工艺
为 A2B1C2，即最佳工艺为超声处理时间 30 min，水
提温度 80 ℃，水提时间 2 h。
表 3-1 方差分析(依据提取率)
变异来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P
超声(A) 0. 009 2 0. 004 2. 307 0. 302
温度(B) 0. 173 2 0. 086 44. 745 0. 022
时间(C) 0. 042 2 0. 021 10. 895 0. 084
误差 0. 004 2 0. 002
总和 5. 212 9
注:F0. 05(2，2)= 19. 00
表 3-2 方差分析(依据糖含量)
变异来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P
超声(A) 17. 616 2 8. 808 0. 019 0. 981
温度(B) 496. 629 2 248. 314 0. 546 0. 647
时间(C) 733. 842 2 366. 921 0. 807 0. 553
误差 909. 469 2 454. 734
总和 46734. 840 9 0. 028
注:F0. 05(2，2)= 19. 00
表 3-3 方差分析(依据脾细胞代谢MTT活力)
变异来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P
超声(A) 0. 002 2 0. 001 210. 606 0. 005
温度(B) 0. 002 2 0. 001 161. 105 0. 006
时间(C) 0. 000 2 0. 000 42. 767 0. 023
误差 0. 000 2 0. 000
总和 0. 004 9
注:F0. 05(2，2)= 19. 00
4 讨论
本研究引入超声因素，同时考察木蹄多糖的提
取率(得率)、多糖含量和免疫刺激活性三项指标，
通过正交试验，探讨木蹄多糖的提取工艺。结果表
明，超声时间、水提温度、水提时间三个因素对木蹄
层孔菌多糖的免疫刺激活性均有影响(P ＜ 0. 05) ，
其中超声因素影响最大(R = 0. 1117) ，其次是水提
温度(R = 0. 0992)和水提时间(R = 0. 0506)。超声
波辐射产生的强烈的空化效应、机械振动、扰动效
应，乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，可加速多
糖类物质进入水溶液，从而缩短提取时间和降低提
取温度〔5〕，但另一方面，长时间的超声作用可能会
使多糖结构破坏，导致多糖活性下降〔6〕。因此，引
入超声因素提取活性多糖应选择合适的超声时间，
以免疫刺激活性为评价指标，本研究所得的木蹄免
疫活性多糖最适超声时间为 30 min。同样，提高温
度和延长提取时间可提高多糖的得率，但多糖的活
性会有所下降，本研究所得的木蹄免疫活性多糖最
适水提温度为 80 ℃，水提时间为 2 h。
多糖提取工艺研究往往选择提取率(得率)作
为评价指标，本研究选择了三项评价指标，即多糖提
取率、多糖含量和免疫刺激活性。从正交试验的结
·9721·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
果看，三项评价指标所对应的最佳组合并不一致。
以提取率为评价指标，最佳工艺为超声处理时间 45
min，水提温度 100 ℃，水提时间 3 h，三个因素水平
均为最大值;而采用以免疫刺激活性为评价指标，三
个因素水平的最佳组合为中间值(见上)。这是因
为多糖的结构十分复杂，只有其中的一部分多糖具
有生物活性，单纯追求总多糖的提取率并不完全代
表活性多糖的提取率，因此，选择某种生物活性作为
评价指标更具有实用价值。MTT 法常用于检测细
胞的增殖程度或代谢活力，小鼠脾细胞中含有各种
免疫细胞，能促进小鼠脾细胞增殖或代谢活力的化
合物一般具有免疫促进作用，因此，选择小鼠脾细胞
增殖或代谢活力作为免疫刺激活性指标可作为宏观
的免疫刺激活性参考指标，其优点是简单易行，缺点
是不能判断具体的作用环节。
本研究以多糖提取率作为评价指标所得到的最
佳工艺条件与文献等〔3〕报道的木蹄多糖提取的最
佳工艺条件在提取温度和提取时间上有所出入，该
研究以多糖得率为评价指标，确定木蹄子实体多糖
的最佳提取工艺条件为:子实体粉末颗粒 60 目，料
水比 1∶ 42. 92，提取温度 88. 92 ℃，提取时间 3. 92
h。导致这种出入的原因可能是不同因素的组合会
导致各因素最佳条件的变化，因此，为了获得多因素
的木蹄多糖含量及活性的最适提取工艺，有待进一
步同时引入所有的影响因素，最终获得综合而全面
的最适提取工艺。
参 考 文 献
［1］陆勇芹，周文明，王琦，等 . 木蹄层孔菌化学成分及不
同提取物体外抗肿瘤活性研究［J］. 西北林学院学报，
2007，22(4) :131-134.
［2］高慧灵，雷林生，余传林，等 . 木蹄层孔菌多糖对小鼠
免疫功能影响的实验研究［J］. 南方医科大学学报，
2009，29(3) :458-461.
［3］王志江，刘碧峰，魏红福 . 木蹄多糖提取工艺研究［J］.
广东微量元素科学，2009，16(11) :27-32.
［4］解燕，朱正光，余传林，等 . 开口箭酸性多糖对小鼠免
疫功能的调节作用及抗肿瘤作用的初步研究［J］. 中药
材，2010，33(4) :596-599.
［5］胡斌杰，韩艳霞，姬红 . 正交实验法超声提取灵芝多
糖最佳工艺研究［J］. 中药材，2008，31(1) :142-143.
［6］陈洁，雷林生，刘汉斌 . 灵芝多糖的提取工艺探讨［J］.
广东药学院学报，2009，25(4) :348-351.
收稿日期:2011-03-29
基金项目:安徽省中医药管理局中医药科研课题(2009ZY01) ;安徽中医学院临床科学研究基金项目(2008LC1-008A) ;康缘中医药科技创
新基金项目(KYCX201011)
作者简介:段贤春(1981-) ，男，硕士，药师，主要从事中药活性成分分离与药效学研究;Tel:0551-2838553，E-mail:dxcflying2008@ 163. com。
* 通讯作者:夏伦祝，Tel:0551-2838589，E-mail:xlunzhu@ sohu. com。
超临界 CO2 流体萃取三七脂溶性成分动力学模型
段贤春，汪永忠，章俊如，罗 欢，张 恒，夏伦祝*
(安徽中医学院第一附属医院 /国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031)
摘要 目的:建立超临界 CO2 流体萃取三七脂溶性成分的动力学模型，优化萃取工艺。方法:对超临界 CO2 流
体萃取三七脂溶性成分的过程进行数值模拟，运用质量守恒微分方程建立动力学模型，Mathmatica 6. 0 数学软件为
数值模拟平台，对模型进行计算预测，并与实验结果比较。结果:建立了超临界 CO2 流体萃取三七脂溶性成分的动
力学模型，模型预测结果与实验过程基本吻合，反映的趋势也与实验结果相一致，将前期实验萃取工艺参数中萃取
时间由 2. 0 h优化为 1. 0 h。结论:该模型能较好地阐明三七脂溶性成分在萃取过程中的溶解传质机理，反映实际
萃取过程，同时也为超临界 CO2 流体萃取工艺的优化和工业化放大提供了一定的理论指导。
关键词 超临界 CO2 流体;三七脂溶性成分;动力学模型;传质
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)08-1280-06
Study on the Dynamic Model with Supercritical CO2 Fluid Extracting
the Lipophilic Components in Panax notoginseng
DUAN Xian-chun，WANG Yong-zhong，ZHANG Jun-ru，LUO Huan，ZHANG Heng，XIA Lun-zhu
(First affiliated hospital of Anhui college of TCM，Grade 3 Laboratory of TCM Preparation，State Administration of TCM，Hefei
230031，China)
·0821· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月