全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2011, 23:351-355
文章编号:1001-6880(2011)02-0351-05
　
　
　收稿日期:2009-09-25　　　接受日期:2010-04-21
　基金项目:国家科技部自然科学基金项目(2006BAD06B08)
＊通讯作者 E-mail:zhangjs8888@yahoo.com.cn
金耳子实体体外抗肿瘤和免疫活性部位的筛选研究
杜秀菊 1, 2 ,张劲松 1＊ ,贾　薇 1
1上海市农业科学院天然药用资源研究开发中心 ,上海市农业科学院食用菌研究所 ,上海 201106;
2聊城大学生命科学学院 , 聊城 252059
摘　要:为系统地筛选金耳子实体的活性部位 , 本论文首次采用系统溶剂法分别用氯仿 、乙酸乙酯和乙醇等极
性不同的有机溶剂依次提取 ,残渣风干后再分别用冷水(80℃)、热水(100 ℃)、 3%草酸铵和 5%氢氧化钠依次
提取 , 并对各提取物进行了体外抗肿瘤和免疫活性的测试。体外抑制肿瘤细胞增殖模型试验结果表明 , 氯仿提
取物对肿瘤细胞株 L1210和 SW620的抑制作用效果最好(P<0.05);小鼠脾淋巴细胞的体外免疫增殖试验结
果表明 , 冷水提取物和热水提提取物的刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖活性相当 , 仅次于氢氧化钠提取物的活性 ,
草酸铵提取物的活性最差(P<0.05)。
关键词:金耳;抗肿瘤;免疫活性;粗提物;多糖
中图分类号:R284.2 文献标识码:A
AntitumorandImmunostimulatingActivitiesoftheExtracts
fromTremelaaurantialbaFrutingBodiesinvitro
DUXiu-ju1, 2 , ZHANGJing-song1＊ , JIAWei1
1ResearchCenterofNaturalMedicinalResourceofShanghaiAcademyofAgriculturalSciences, EdibleFungiInstitute, ShanghaiAcademy
ofAgriculturalSciences, Shanghai201106 , China;2ColegeofLifeScience, LiaochengUniversity, Liaocheng252059 , China
Abstract:InordertoscreenbiologicalactivityextractsfromTremellaaurantialba, thesystematicsolventextractionwas
usedtoextractthefruitingbodies.Firstly, thefruitingbodiespowderofT.aurantialbawereextractedbychloroform
(Chl), ethylacetate(EA), ethanol(Eth), respectively, thenthreeextractswithdiferentpolaritywereprepared.Sec-
ondly, theair-driedresiduaafterethanolwereextractedbywaterat80 ℃, waterat100 ℃, 3% ammoniumoxalateand
5% sodiumhydroxide, respectively, andaccordinglyfourextractsTAFWl, TAFWr, TAFWnandTAFWjwereprepared.
Furthermore, theinhibitioneffectsofextractsinorganicprotiononcelsL1210andSW620 weredetermined.Theresults
showedthattheinhibitionefectsofChl-portiononcelsL1210 andSW620 wasthebestamongthethreeextracts.The
immunostimulatingactivityassayoffourextractsshowedthatTAFWrhadalmostthesameproliferationrateasthatof
TAFWlandtheyshowedabitlowerimmunostimulatingactivitycomparedwiththeTAFWj(P<0.05).
Keywords:Tremelaaurantialba;antitumoractivity;immunostimulationactivity;crudeextract;polysaccharide
　　金耳(Tremelaaurantialba),又名脑耳 ,隶属于
担子菌亚门 (Basidiomycotina), 银耳目 (Tremel-
lales)、银耳科(Tremelaceae)、银耳属(Tremela),主
要分布于我国云贵高原 。金耳是 “三耳”(金耳 、银
耳 、黑木耳)中的佼佼者 ,其滋补和营养价值 ,均优
于银耳 、黑木耳等其他胶质菌 ,含有丰富的蛋白质和
氨基酸 ,特别是人体必需 8种氨基酸的含量较高 ,维
生素 、矿物质含量也比较丰富 ,并含有对人体很重要
的硒和锗 [ 1] 。 《本草纲目 》记载:“其金黄色者可致
癖饮积聚 ,腹痛金疮” ,历来与人参 、鹿茸并列 ,曾被
视为 “补益身心”、“转弱为强” 、“延年益寿 ”的著名
珍品 。有人提出金耳是 “中国最新发现最有价值之
大补品” [ 2] 。由于它食药兼用 ,疗效特殊 ,在国际市
场上 ,金耳享有很高的声誉 ,非常畅销。据悉每吨出
口价高达 2万多美元 [ 3] 。是一种很有开发和利用价
值的珍稀菌类之一 。
国内外已有多项研究表明 ,金耳具有增强免疫
功能 、降血糖 、降血脂 、抗氧化 、抗肿瘤 、抗炎症等多
种药理功效[ 4-9] ,但目前研究大多停留在初步试验阶
段 ,而且主要集中于多糖的研究 ,采用系统溶剂法系
DOI :10.16333/j.1001-6880.2011.02.036
统地对其活性部位进行筛选的研究还未见有文献报
道 ,因而影响了金耳资源的开发利用。金耳作为一
种著名的食 、药兼用菌 ,有必要对金耳的活性部位进
行确定 ,这将对加强金耳活性成分的分离纯化 、结构
分析和构效关系的探讨 ,对尽快开发出金耳的功能
食品和新药有重要的意义 。
本论文以金耳子实体为研究材料 ,首次采用系
统溶剂法 ,先分别用氯仿 、乙酸乙酯和乙醇等极性不
同的有机溶剂依次提取 ,并将所制备的样品采用肿
瘤细胞株 L1210和 SW620的抑制作用试验模型测
试了极性不同的各有机溶剂提取物对肿瘤细胞的抑
制活性 ,然后再分别以冷水(80 ℃)、热水(100 ℃)、
3%草酸铵溶液和 5%氢氧化钠溶液依次提取 ,采用
小鼠巨噬细胞刺激试验模型测试了不同水溶液提取
物的免疫增殖活性 ,本试验结果将对科学开发和利
用金耳资源提供一定的科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料来源
金耳子实体是由昆明食用菌所赠送。
1.2　试剂
5-Fu为 Simga-Aldrich公司产品;二甲基亚砜
(DMSO)为 AMERSCO产品;RPMI-1640,胎牛血清
(FBS)为 GIBCO公司产品;青霉素和链霉素购自
AMRESCO公司;显色剂 AlamarBlue为 Biosource公
司;其他试剂均为国产分析纯。
RPMI1640完全培养基的配置:RPMI1640 +
10% FBS(10%加热灭活的胎牛血清)+100 IU/mL
青霉素 +100μg/mL链霉素。
Balb/c小鼠 , SPF级 , 8 ～ 10周龄(体重 28 ±2
g),购自中国科学院实验动物研究中心 。
小鼠白血病细胞株 L1210和人肠腺癌细胞株
SW620均购自中科院细胞所。
1.3　金耳子实体各提取物的制备
分别称取金耳 YK子实体 100 g,粉碎 ,氯仿加
热回流 2 h,上清浓缩干燥 ,制备得样品 TAFCl;沉淀
挥干氯仿后 ,加乙酸乙酯加热回流 2 h,上清浓缩干
燥 ,制备得样品 TAFEtOAc;沉淀挥干乙酸乙酯后 ,
加 95%的食用酒精加热回流 2 h,滤出酒精后 ,滤过
液浓缩回收酒精 ,浓缩液干燥 ,制备得样品 TAFE-
tOH。残渣挥尽酒精 ,加 30倍水 80℃提取 2h,尼龙
布过滤 ,滤过液真空浓缩 , 80%酒精沉淀 ,沉淀挥干
酒精 ,干燥称重 ,制备得样品 TAFWl;然后再用 100
℃提取 2h,尼龙布过滤 ,滤过液真空浓缩 , 80%酒精
沉淀 ,沉淀挥干酒精 ,干燥称重 ,制备得样品 TAF-
Wr;残渣加 10 ～ 20倍 3%的草酸铵溶液 100 ℃提取
2h,尼龙布过滤 ,滤过液透析后真空浓缩 ,冻干称
重 ,制备得样品 TAFWn;残渣水洗离心后加 5 ～ 10
倍 5%的氢氧化钠溶液室温提取 4 h,半小时搅拌一
次 ,尼龙布过滤 ,滤过液加稀盐酸低温中和 ,上清液
透析后真空浓缩冷冻干燥称重 ,制备得样品 TAF-
Wj。
1.4　金耳多糖的测定
采用苯酚 -浓硫酸法测定 。精密称取金耳不同
水溶液提取物样品各 1.0g,分别置 100 mL烧杯中 ,
加蒸馏水约 80 mL,煮沸提取 1h后冷却至室温 ,加
入 100 mL容量瓶中 。用蒸馏水稀释至刻度 ,摇匀 ,
用干燥滤纸过滤 ,弃去初滤液 。吸取滤液 1.0 mL,
置 15 mL试管中 ,加入苯酚-硫酸试剂 ,在 490 nm处
测定吸光度。以葡聚糖为标准计算总糖的含量 ,并
用水杨酸法(DNS法)测定还原糖含量 。多糖含量
=总糖-还原糖。
1.5　体外对抗肿瘤细胞抑制活性的测定[ 10]
供试肿瘤细胞株 L1210和 SW620,采用 RPMI
完全培养基于 37℃、含 5% CO2的条件下培养。分
别取对数生长期的肿瘤细胞株以 400 ×g离心 3
min,去除上清液 ,用 RPMI1640完全培养基稀释到 1
×104 cels/mL。取 199 μL细胞液接于 96孔板中 ,
然后加 1 μL各待测样品 ,阴性对照以 1 μLDMSO
替代 ,阳性对照以 5-Fu替代 。细胞在 37 ℃、含 5%
CO2的条件下培养 72 h后 , 用酶联免疫检测仪
(ELISA)自动读板仪分别于 570 nm和 600 nm测定
吸光值 ,加 20μL的显色剂 alamarBlue到每孔 ,培养
6 ～ 8 h后 ,再分别于 570nm和 600nm测定吸光值。
细胞抑制率按照 alamarBlueAssay所给的公式计算:
细胞抑制率(%)={1– [ 80856 ×A570(sam-
ple)– 117216 ×A600 (sample)] / [ 80856 ×A570
(control)– 117216×A600(control)] }×100%
1.6　小鼠脾淋巴细胞的体外免疫增殖试验 [ 11]
将 8 ～ 10周龄小鼠颈椎脱臼处死后取脾脏 ,用
PBS冲洗 3 ～ 4次。脾脏用 100目筛在培养皿中磨
碎后以 400 ×g离心 6 min,吸去上清 ,加入浓度为
0.83%氯化氨溶液裂解红细胞 ,静置 10 min后 400
×g离心 6 min,收集的细胞用 PBS缓冲液冲洗数遍
后 ,台朌蓝检查活力在 95%以上 。用 RPMI1640培
养基 ,将细胞稀释成 2×106 cel/mL的悬浮液 ,取
352 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.23
180μL的悬浮液加至 96孔板中 ,同时加入 20 μL
样品(样品包含空白对照 PBS、阳性对照 PHA和多
糖样品),于 37 ℃、含 5%的 CO2条件下培养 3 d,用
酶标仪测定其 570 nm和 600 nm处的吸光度 ,然后
加入 20 μLalamarBlue试剂 ,再培养 ,变色后再测定
570nm和 600 nm处的吸光度 ,然后根据 alamarBlue
试剂的公式计算各种样品对小鼠淋巴细胞增殖的影
响 ,计算公式如下:增殖率(%)=〔80856 ×Aλ570
(sample)– 117216 ×Aλ600 (sample)/ 80856 ×
Aλ570 (control)– 117216 × Aλ600 (control)〕 ×
100%。
1.7　统计学分析
结果以 x±s表示。统计学检验采用组间 t检验
进行处理 , n=3。使用 STST统计软件包进行方差
统计分析 , P<0.05为显著性差异 。
2　结果与分析
2.1　金耳子实体各提取物得率和含量
由表 1看出 ,采用系统溶剂法 ,依次用氯仿 、乙
酸乙酯 、乙醇提取金耳子实体得率分别为:0.91%、
0.64%和 2.74%,各提取物的得率由高到低排列顺
序为:乙醇提取相 >氯仿提取相 >乙酸乙酯提取相;
有机溶剂提取后的金耳子实体残渣风干后 ,分别用
冷水(80℃)、热水(100℃)、3%的草酸铵和 5%的
氢氧化钠依次提取 , 得率分别为 1.31%、4.97%、
9.79%和 8.11%,提取得率按由高到低顺序排列
为:草酸氨提取物 >NaOH提取物 >热水提取物 >
冷水提取物;各水溶液提取物多糖含量分别为
57.4%(冷水提取物 )、 61.9%(热水提取物)、
44.1%(草酸氨提取物)和 33.7%(NaOH提取物)。
热水提取物和冷水提取物的多糖含量明显高于其他
两种提取部位的多糖含量 。
表 1　金耳子实体各提取物得率和含量
Table1　yieldandpolysaccharidecontentofextractsfromT.
aurantialbafruitingbodies
样品名称
Nameofsample
得率
Yield(%)
多糖含量
Contentof
polysaccharide(%)
氯仿提取物(TAFCl) 0.91 –
乙酸乙酯提取物(TAFEtOAc) 0.64 –
乙醇提取物(TAFEtOH) 2.74 –
冷水提取物(TAFWl) 1.31 57.4
热水提取物(TAFWr) 4.97 61.9
草酸氨提取物(TAFWn) 9.79 44.1
NaOH提取物(TAFWj) 8.11 33.7
2.2　金耳子实体各有机提取物对肿瘤细胞株
L1210的抑制作用
金耳子实体各有机提取物对肿瘤细胞株 L1210
的抑制作用结果如图 1所示 。由图 1看出 ,当浓度
为 100 μg/mL时 , TAFCl(氯仿提取物)、TAFEtOAc
(乙酸乙酯提取物)和 TAFEtOH(乙醇提取物)对肿
瘤细胞株 L1210的抑制率分别为:(89.9±3.1)%、
(71.1±4.5)%和(43.9±8.4)%,抑制率由高到低
为 TAFCl>TAFEtOAc>TAFEtOH,三者间具有显著
差异(P<0.05),当浓度为 50 μg/mL时三者的抑制
率分别为:(60.8±3.5)%、(46.0±3.1)%和(23.3
±9.6)%,抑制率由高到低为 TAFCl>TAFEtOAc>
TAFEtOH,三者间具有显著差异(P<0.05);当浓度
为 10 μg/mL时 ,三者均几乎不表现出对肿瘤细胞
L1210的抑制活性。三部位相比较 ,从对肿瘤细胞
株 L1210的抑制作用效果看 ,氯仿提取物最好 ,乙酸
乙酯提取物次之 ,乙醇提取物最差 。
图 1　金耳子实体各提取物对肿瘤细胞株 L1210的抑制作用
(P<0.05)
Fig.1　InhibitionefectofextractsfromT.aurantialbafruiting
bodiesoncelL1210 (P<0.05)
2.3　金耳子实体各有机溶剂提取物对肿瘤细胞株
SW620的抑制作用
金耳子实体各有机溶剂提取物对肿瘤细胞株
SW620的抑制作用结果如图 2所示。图 2表明 ,在
200 μg/mL时 , TAFCl(氯仿提取物)和 TAFEtOAc
(乙酸乙酯提取物)的抑制率分别为(80.0±1.2)%
和(88.4 ±4.0)%,对肿瘤细胞株 SW620的抑制没
有显著差异 (P<0.05),二者的抑制活性均高于
TAFEtOH(乙醇提取物)(为(34.1±4.2)%)(P<
0.05);当浓度为 100 μg/mL时 , TAFCl(氯仿提取
物)、TAFEtOAc(乙酸乙酯提取物)和 TAFEtOH(乙
353Vol.23 　　　　　　杜秀菊等:金耳子实体体外抗肿瘤和免疫活性部位的筛选研究 　
醇提取物)对肿瘤细胞株 SW620的抑制率分别为:
(77.5±0.6)%、(63.0±3.6)%和(46.5±2.3)%,
抑制活性由高到低为 TAFCl>TAFEtOAc>TAFE-
tOH。当浓度为 50μg/mL时 ,三者均几乎不表现出
对肿瘤细胞 SW620的抑制活性 。从对肿瘤细胞株
SW620的抑制作用效果看 ,三部位相比较 ,氯仿提
取物和乙酸乙酯提取物较好 ,二者的抑制活性相当 ,
不呈显著差异(P<0.05),而乙醇提取物较差 ,与氯
仿提取物和乙酸乙酯提取物相比 ,呈现显著差异。
图 2　金耳子实体各提取物对肿瘤细胞株 SW620的抑制作
用(P<0.05)
Fig.2　InhibitioneffectofextractsfromT.aurantialbafruiting
bodiesoncellSW620 (P<0.05)
2.4　金耳子实体不同溶剂各提取物刺激小鼠脾淋
巴细胞的增殖作用
金耳子实体不同水溶液作为溶剂的各提取物分
别进行了小鼠脾淋巴细胞的刺激试验 。结果表明
(见图 3):四种提取物在中(200 μg/mL)、高 (500
μg/mL)试验浓度下均有一定的增殖活性 ,且均呈现
明显的浓度依赖性;在浓度为 500μg/mL时 , TAPWl
(冷水提取物)、TAPWr(热水提取物)、TAPWn(草酸
铵提取物)和 TAPWj(氢氧化钠提取物)对小鼠脾淋
巴细胞的增殖率分别为(318.6±7.9)%、(302.3±
7.4)%、(198.6±3.9)%和(349.3±9.2)%,四种
提取物的刺激活性相比较 , TAPWj最高 , TAPWl和
TAPWr增殖活性相当 ,没有显著差异(P<0.05),
TAPWn的活性最差 。四种提取物在 50μg/mL时均
没有表现出明显的刺激脾淋巴细胞增殖活性 。
TAPWj的脾淋巴细胞增殖率((349.3±9.2)%)略
低于浓度为 6 μg/mL的阳性对照 PHA(植物凝集
素)的细胞增殖率((383.3±9.8)%)。
3　讨论
本论文在抗肿瘤试验模型和刺激脾淋巴细胞的
图 3　金耳子实体不同水溶剂各提取物刺激小鼠脾淋巴细胞
的增殖作用(P<0.05)
Fig.3　Proliferationrateoflymphocytebycrudepolysaccharides
extractedbydiferentsolvent(P<0.05)
增殖试验模型中均采用了 alamarBlue比色法来检测
细胞存活情况及其增殖率 。alamarBlue比色法的检
测原理是:alamarBlue作为一种染料 ,它具有氧化还
原性质 ,能被 NADPH、NADH、FADH和 FMNH及细
胞色素所还原 ,因此它可替代分子氧作为电子受体 ,
当 alamarBlue从这些化合物接受电子后 ,它从氧化
的 、非荧光的靛蓝状态变为还原的 、荧光的粉红色状
态。当细胞增殖时 , 其内部环境更易被还原 , 用
ELISA在 570 nm和 600 nm两种波长(分别为氧化
态和还原态的最大吸收波长)下测定 alamarBlue的
还原性 ,可间接反映活细胞数量 。在一定细胞数范
围内 , alamarBlue的还原性与 细胞数成正 比。
alamarBlue比色法与目前国内应用较广泛的评价细
胞活力或增殖力的 MTT比色法相比有以下优点:1)
其水溶性好;2)对细胞无损伤;3)在培养液中性质
稳定 ,不易自发地氧化或还原;4)加入培养液后可
被细胞主动摄取;5)对呼吸链无阻断作用;6)可对
细胞进行连续观察。 alamarBlue比色法可广泛应用
于细胞生物学研究 ,如检测细胞增殖 、细胞毒理研
究 、真菌培养与耐药性研究以及细菌培养等研究
中[ 12] 。
抗肿瘤试验结果表明 ,当浓度为 100 μg/mL
时 ,对 L1210的抑制作用 ,氯仿提取物的抑制活性最
高(为(89.9 ±3.1)%), 乙酸乙酯提取物次之(为
(71.1±4.5)%),乙醇提取物的最差(为(43.9 ±
8.4)%), 三者间具有显著差异 (P<0.05)。对
SW620的抑制作用中 ,当浓度为 200 μg/mL时 ,氯
仿提取物和乙酸乙酯提取物较好 ,它们的抑制率分
别为(80.0±1.2)%和(88.4±4.0)%,二者间差异
不显著(P<0.05),而乙醇提取物较差(同浓度下抑
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制率仅为(34.1 ±4.2)%)),与氯仿提取物和乙酸
乙酯提取物的抑制活性相比较 ,呈现显著差异(P<
0.05)。综合对 L1210和 SW620的抑制作用来看 ,
三个部位中 ,氯仿提取物最好 ,值得进一步研究和开
发 ,以期得到抗肿瘤活性更强的较纯组分或单体。
四种水溶液提取物刺激脾淋巴细胞的增殖试验
结果表明 ,氢氧化钠提取物刺激小鼠脾淋巴细胞的
增殖率最高(为(349.3±9.2)%),冷水提取物(为
(318.6 ±7.9)%)和热水提取物 (为 (302.3 ±
7.4)%)次之 ,草酸铵提取物(为(198.6±3.9)%)
最差;四部位提取得率上从高到底顺序为 ,草酸氨提
取物(9.79%)>NaOH提取物(8.11%)>热水提取
物(4.97%)>冷水提取物(1.31%)。综合考虑四
种水溶液提取物的提取得率和刺激脾淋巴细胞的增
殖活性 ,下一步将选择氢氧化钠提取物和热水提取
物做进一步的分离纯化研究 ,以期获得提取得率和
药理活性均较高的较纯组分或者单体 。
本试验结果将对合理开发和利用金耳资源提供
一定的科学依据 。
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