全 文 ：第 41 卷　第 5 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.41　No.5
　2002 年 9 月 Journal of Xiamen University (Natural Science) Sep.2002　
文章编号:0438-0479(2002)05-0531-05
甜菊(S tevia rebaudiana)糖基转移酶基因
的克 隆 及 序 列 分 析
收稿日期:2002-05-20
作者简介:马凌波(1972-), 男 ,博士研究生.
＊通讯联系人 , Tel:0592-2186050 , E-mail:chenl304@
263.net
马凌波1 ,张大兵2 ,沈明山1 ,陈　亮1＊ ,陈睦传1
(1.厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005;
2.上海市农业科学院生物技术中心 上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海 201106)
摘要:利用与植物次生代谢产物糖基化相关的 UDPG 糖基转移酶的特征性保守区域 , 设计了同源简并引物 , 以甜菊
基因组 DNA 为模板 , PCR扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段.根据获得的基因片段设计引物 GSTr和 GST f , 分别与
cDNA文库的 T3 和 T7 通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因 , 定名为 sudpt-2 , 该基因全长 1
662 bp ,包括 poly(A)和一个 1 362 bp的开放阅读框 ,编码 454 个氨基酸.与常见的糖基转移酶基因的相似性达 44%
～ 77%, 且具有 UDPG 糖基转移酶的特征性保守序列.分子发育进化分析表明 , 此基因为类黄酮糖基转移酶基因家
族成员.
关键词:甜菊;糖基转移酶;基因克隆
中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A　　　　　　　　　　　　　　　
　　甜菊(Stevia rebaudiana)叶片中富集了约占干
重 10%～ 30%的甜菊糖苷.这些带葡萄糖基的二萜
衍生物比蔗糖甜 30 ～ 320倍[ 1] ,而且具有低热量 、无
毒性 、耐高温和酸碱以及水溶性高的特点 ,是一种很
有前途的食物甜味添加剂.甜菊糖苷的合成途径前
半部分与赤霉素相同 ,只是在内贝壳杉烯酸(ent-
Kaurenoic acid)开始 ,二者的合成途径才分开.在碳-
13位羟化形成甜菊醇(Steviol),作为 UDPG:steviol
糖基转移酶的糖基配体 ,形成各种甜菊糖苷.Shibata
等(1995)从甜菊中分离得到 3种糖基转移酶 ,可以
催化形成甜菊糖苷 ,但是对类黄酮类物质具有更高
的催化活性[ 2] .随后发现菠菜叶和芹菜叶中的类黄
酮 UDPG糖基转移酶也具有催化甜菊醇形成甜菊
糖苷的能力[ 2] .研究甜菊糖苷合成途径上游的内贝
壳杉烯酸羟化酶[ 3] 、β羟-β-甲基戊二酸还原酶(HM-
GR)[ 4] 、黄脂二磷酸合成酶(CPS)、内贝壳杉烯酸合
成酶(KS)[ 5]都发现这些酶的表达量比其他植物高
的多.因此可以认为甜菊成熟叶片中大量合成了赤
霉素和甜菊糖苷的前提物质 ,甜菊很可能利用了体
内已有的类黄酮类 UDPG 糖基转移酶合成了大量
的糖苷 ,消耗了赤霉素和糖苷的共同前体物质 ,保证
了赤霉素的代谢正常进行[ 2 ～ 5] .由于甜菊糖苷糖基
转移酶的蛋白纯化目前还难以达到测序的目的 ,很
难对其功能进一步研究.因此 ,利用基因克隆及蛋白
的异源表达 ,可以达到这一目的.
UDPG 糖基转移酶是一大类与植物次生代谢产
物糖基化相关的蛋白.这类酶不同成员及在不同植
物种类中的蛋白质一级结构序列的相似性很低.所
以至今尚未见利用糖基转移酶基因保守区合成简并
引物获得糖基转移酶基因的报道.为了研究甜菊合
成糖苷的机制及意义 ,分析了现已获得的约 200多
种与植物次生代谢产物糖基化相关的糖基转移酶基
因的保守区域 ,合成了 2条同源简并引物 ,首次基于
基因序列的同源性获得 UDPG糖基转移酶.
1　材料与方法
1.1　植物材料
取自厦门大学植物试验园.以茎尖的第 2 ～ 4对
叶片为材料提取总 DNA和 RNA.
1.2　甜菊叶片 cDNA 文库的构建
使用 Trizol 试剂(Life Technolog ies)获得总
RNA ,mRNA使用 PolyATtract mRNA isolation sys-
tems(Promega)获得.cDNA 文库的构建使用 ZAP
Express cDNA synthesis 和 predigested vector kits
(Stratagene).
1.3　甜菊糖基转移酶基因片段的获得
甜菊总 DNA的提取参照参考文献[ 8] .根据植
物 UDPG糖基转移酶同源保守区域设计同源简并
引物 2 条:5′-GTNGTNTAYATHAGYTYGG-3′和
5′-TTCCANCCTCATRGNGTNAC-3′.以 甜 菊 总
DNA为模板 , PCR扩增目的片段:1×PCR buffer ,
0.2 mmol/ L dNTPs , 1 μmol/L 正反向引物 , 2
mmol/L MgSO4 , 1 U Taq酶 ,反应体积 20 μL.PCR
循环参数:94 ℃, 5 min;36×(94 ℃ 1 min;45 ℃1
min;72 ℃1 min);72 ℃8 min.PCR获得约 250 bp
片段 ,从琼脂糖凝胶上分离后连接于 pMD-T 载体
(TAKARA公司).转化大肠杆菌感受态细胞 ,在 LB
平板上进行蓝白斑筛选阳性克隆.选取阳性克隆测
序 ,测序工作由上海生工公司完成.测序结果提交到
NCBI并进行 Blast X 比较.
1.4　甜菊糖基转移酶基因全长序列的获得
根据已获得的基因片段设计 2条引物分别与
cDNA 文库中λDNA 上的 T 3和 T 7 通用引物扩增已
知片段的上游和下游部分.引物 GSTr 5′-ACCCCA-
CACTATCGTGCGCC-3′和 T3 5′-AAT TAACCCT-
CACTAAAGGGAA-3′用来扩增上游部分 ,而 GSTf
5′-TTCTGACCGACGATCAGATTAG-3′and T 7 5′-
GTAATACGACTCACTA TAGGGC-3′用来扩增下
游部分.根据得到的基因片段上游和下游部分序列
的信息再设计 2 条引物 GST 3 5′-GGGGATCCTC-
TAGAGAT TATG-3′and GST4 5′-AAAGCTCT-
GACCATTTTCTCA-3′来 PCR扩增获得全长的糖
基转移酶基因的 cDNA序列.PCR反应条件如下:
1 × PFU DNA polymerase buffer , 0.2 mmol/L
dNTPs , 1 μmol/L 正向和反向引物 , 1 单位 PFU
DNA polymerase (Bioseen);总体积为 20 μL , 以 1
μL cDNA 文库的λDNA 为模板.热循环参数为 94
℃, 5 min , 30次循环(94 ℃1 min , 58 ℃1 min , 72
℃3 min), 72 ℃5 min.最终获得约 1 400 bp的扩
增片段连接到 pMD-T 载体(Takara)上并测序.
1.5　基因序列分析
基因序列比较及分子发育进化树分析采用
CLUS TAL W1.8完成.开放阅读框架分析及部分
序列比较由 NCBI 的 BLAST 服务器完成.
2　结　果
2.1　甜菊糖基转移酶基因的克隆与序列分
析
以甜菊总 DNA 为模板 , 利用同源简并引物
PCR扩增目的基因 ,获得两个特异的片段.其中之
一长 242 bp ,包含有 UDPG 糖基转移酶基因的部分
特征性序列.与其他同类 UDPG 糖基转移酶基因的
氨基酸序列比较 ,具有较高的相似性 ,达 53%(与拟
南芥一种 UDPG 糖基转移酶 , Genbank 序列号
AAG52529.1)至 70%(与矮牵牛的 rhamnose-antho-
cyanidin-3-g lucoside rhamnosy ltransferase Genbank
序列号 S33169),约 40%～ 50%氨基酸序列完全一
致.表明获得的基因片段属于 UDPG 糖基转移酶.
根据获得的基因片段设计引物 GSTr 和 GSTf ,分别
与 cDNA文库的 T3 和 T 7通用引物扩增获得甜菊糖
基转移酶基因全长的核苷酸序列 ,定名为 sudpg-2.
该基因全长 1 662 bp ,包括 poly(A)和一个1 362 bp
的开放阅读框 ,编码 454个氨基酸.与常见的糖基转
移酶基因的大小基本一致.
获得的基因核苷酸序列与其它同类的糖基转移
酶基因进行多重序列比较 ,具有较高的相似性(见图
1),达 44%(与烟草水杨酸糖基转移酶比较 , Gen-
bank序列号 AF61647)至 74%(与矮牵牛的花青素:
UDP-鼠李糖糖基转移酶比较 , Genbank 序列号
S33169).编码区具有 2个保守的区域.其中一个是
编码 44个氨基酸的糖基转移酶所特有的特征性区
域.它被认为是 UDP-glucose 的结合区域.在这个区
域氨基酸序列与其它已知的糖基转移酶基因有
43%～ 78%的相似性.具有这个特征性区域的基因
一般都被认为是糖基转移酶基因家族的成员.另一
个保守的区域位于糖基转移酶基因的上游 N 端 ,它
们的相似性在 30%～ 45%.甜菊糖基转移酶与矮牵
牛的花青素:UDP-鼠李糖糖基转移酶 rhamnose-an-
thocyanidin-3-g lucoside rhamnosyl transferase (Ge-
nbank序列号 S33169)相似性最高 ,达到 74%,而且
有 59%的氨基酸序列完全一致.这表明获得的基因
很可能也是一种花青素类的糖基转移酶.
2.2　sudpg-2 与其它 UDPG 糖基转移酶的
系统发育进化关系
根据获得的 sudpg-2基因序列 ,于 Genbank 公
·532· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　2002 年
图 1　甜菊糖基转移酶基因 sudpg-2 与其它糖基转移酶基因的氨基酸多重序列比较.黑色块表示一致的氨基酸;灰色块表
示相似的氨基酸
Fig.1 　Multiple alignment of deduced amino acids sequences of Stev ia rebaudiana UDPG g lucosyltransferase sudpg-2 with
know n and putative plant secondary metabolite glucosy ltransferase amino acid sequences.Black shade indicates identical
amino acids , and g ray shade indicates similar amino acids.Perilla(GenbankTM accession number BAA19659.1), Vitis
(GenbankTM accession number AAB81683.1), Malus(GenbankTM accession number AAD26203.1), Petunia(Genbank-
TM accession number S33169), Gentiana(GenbankTM accession number BAA12737.1), Solamum (GenbankTM accession
number Q43641 ), Maize (GenbankTM accession number P16167 ), Arabidopsis (GenbankTM accession number NP_
201358.1), tobacco(GenbankTM accession number AAB36653.1)
·533·第 5 期　　　 　　　　　　马凌波等:甜菊(S tevia rebaudiana)糖基转移酶基因的克隆及序列分析
用数据库进行 BLAST 比较后 ,调取与其同源相似
的其它 UDPG 糖基转移酶基因的相应序列.利用
CLUSTA L W软件进行序列分析比较后 ,采用相邻
连接法绘制进化树(图 2).sudpg-2与矮牵牛的花青
素:UDP-鼠李糖糖基转移酶亲缘关系接近 ,推测二
者在功能上具有一定的相似性.
　图 2　植物 UDPG糖基转移酶超家族的分子系统发育
进化树.进化树采用相邻连接法构建;图中缩写
同图 1
　Fig.2　Molecular phy logenic tree of the amino acid se-
quences of the plant UDPG glucosy ltransferase
super family.The tree w as constructed by the
neighbo r joining method
3　讨　论
如同其它植物的次生代谢产物 ,甜菊糖苷很可
能在防御昆虫的侵害中起着重要作用.由于这些糖
苷在甜菊成熟叶片中要占到 10%～ 30%的干重 ,因
此甜菊体内代谢大量的能量都用于合成糖苷这种结
构复杂的大分子物质.因为一般甜菊体内的赤霉素
含量大大低于甜菊糖苷(如 GA20含量为 1.2 μg
kg-1鲜重 ,比甜菊糖苷低 10 000倍),为了保证赤霉
素的代谢正常进行 , 甜菊体内大量合成的赤霉素和
甜菊糖苷的共同前体物质就必须尽快转化成甜菊糖
苷.Shibata 等(1995)的研究认为甜菊很可能利用了
体内已有的类黄酮类 UDPG 糖基转移酶合成了大
量的糖苷 ,消耗了赤霉素和糖苷的共同前体物质.所
获得的甜菊糖基转移酶基因很可能属于花青素类糖
基转移酶 ,而花青素类糖基转移酶也属于类黄酮类
UDPG糖基转移酶这个大家族.因此 ,所获得的糖基
转移酶基因也可能参与了合成甜菊糖苷.对于这个
基因的功能以及对甜菊醇和甜菊糖苷的转糖基作用
的研究正在进行中.
对甜菊糖基转移酶的研究 ,不仅有助于了解甜
菊糖苷这种特殊甜味物质的合成机制 ,而且还很可
能有助于了解甜菊体内的赤霉素代谢途径[ 5] ,因此
这方面的研究引起了许多生物学家的兴趣.对于难
以纯化的蛋白质 ,分离基因进行异源表达是研究其
功能的重要方法.然而几乎所有分离克隆 UDPG糖
基转移酶基因的文献都会提及 UDPG 糖基转移酶
基因序列相互之间的同源性很低 ,即使是被认为结
合 UDPG 的特征性序列的 44个氨基酸区域也只有
大约 43%～ 48%的相似性[ 7] .而其他区域相似性低
于 30%[ 7 , 9～ 13] .因此很难利用这类基因的同源或保
守区域设计同源简并引物克隆基因.将所有已知的
200多种 UDPG 糖基转移酶基因进行序列多重比较
后 ,发现根据序列的相似性可以将 UDPG 糖基转移
酶分为几个亚类.这几类糖基转移酶基因在同类中
序列相似性很高 ,从功能上也基本属于同一类糖基
转移酶.如以花青素等类黄酮为底物的糖基转移酶 、
以植物激素为底物的糖基转移酶 、与植物抗病 、抗逆
相关的糖基转移酶及一些功能未知的糖基转移酶.
随机选取数个不同类别的糖基转移酶 ,与所得基因
序列进行比较后 ,绘制分子进化树 ,也发现同一类别
的糖基转移酶亲缘关系较近.
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Cloning and Sequencing of the cDNA of UDPG-glucosyltransferase
f rom S tevia rebaudiana
MA Ling-bo1 , ZHANG Da-bing2 , SHEN Ming-shan1 , CHEN Liang1＊ , CHEN Mu-zhuan1
(1.Education Ministry Key Lab.fo r Cell Biol.and Tumor Cell Eng.in
Xiamen Univ., Xiamen 361005 , China;
2.Shanghai Academe of Agriculture Science , Shanghai 201106 , China)
Abstract:By using tw o homologous degenerated primers , DNA fragments encoding steviol UDPG glucosyl-
transferase w ere amplif ied from the leaves of Stevia rebaudiana.The DNA fragment wi th st rong homology to
known flavonoid glucosylt ransferases was used to design two primers to amplify upstream and downst ream cDNA
of stevia glucosyltransferase.The cDNA of stevia g lucosy ltransferase sudpg-2 w as 1 662 bp in length , with a
poly(A)tail and a 1 362 bp open reading frame which encoded 454 deduced amino acid residues.The deduced
amimo acids sequence has 40%～ 60% identity to other plant glucosylt ransferase and includes a part of the g luco-
sylt ransferase signature sequence.Molecular phy logenic relations of the deduced amino acids sequences w ith oth-
er plant glucosylt ransferase suggested that the steviol UDPG glucosylt ransferase belongs to family of f lavonoid
g lucosy ltransferases.
Key words:Stev ia rebaudiana;UDPG-glucoslt ransferase;DNA cloning
·535·第 5 期　　　 　　　　　　马凌波等:甜菊(S tevia rebaudiana)糖基转移酶基因的克隆及序列分析