全 文 ：南烛叶多酚氧化酶最适提取条件的研究
冯佳丽，何新叶，笪荣辉，金 奎，何志勇，陈 洁* (江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)
摘要 ［目的］深入探讨南烛叶多酚氧化酶(PPO)的酶学性质，对南烛叶 PPO的最适提取条件进行研究。［方法］以南烛叶为原料，分别
研究了交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)添加含量、料液比、浸提时间和 pH各因素对其提取的 PPO酶活的影响。［结果］试验表明，适量南
烛叶粉末，以料液比 1∶ 15 g /mL，加入含 9%PVPP(W/V)pH 7． 6的柠檬酸 －磷酸氢二钠缓冲液(0． 1 mol /L)，匀浆并于 4 ℃下浸提 9 h，过
滤，滤液经冷冻离心(4 ℃，12 000 r /min，20 min)后得到酶活最高的 PPO酶液(11 335 U/mL)。［结论］研究结果可为促进南烛叶的工业
化应用提供参考。
关键词 南烛叶;多酚氧化酶;酶活;提取
中图分类号 S789． 4 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)05 －128 －03
Study on Optimum Extraction Conditions of Polyphenol Oxidase from Vaccinium bracteatum Thunb Leaf
FENG Jia-li，HE Xin-ye，DA Ｒong-hui，CHEN Jie* et al (State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，
Wuxi，Jiangsu 214122)
Abstract ［Objective］The aim was to explore the enzymatic properties of PPO from Vaccinium bracteatum Thunb leaf and research the opti-
mum extraction conditions of PPO． ［Method］Effects of PVPP content，solid-liquid ratio，extraction time，pH on PPO enzyme activity were
studied respectively． ［Ｒesult］The results showed that appropriate amount of V． bracteatum power was added into citric acid-phosphate buffer
(0． 1 mol /L pH 7． 6)containing 9% PVPP(W/V)with solid-liquid ratio 1∶ 15 g /mL，extracted at 4 ℃ for 9 h，through filtering，centrifuging
at 4 ℃，12 000 r /min for 20 minutes，PPO with the highest enzyme activity (11 335 U /mL)was obtained． ［Conclusion］The study can pro-
vide reference for promoting industrialized application of V． bracteatum leaf．
Key words Vaccinium bracteatum Thunb leaf;Polyphenol oxidase(PPO);Enzyme activity;Extraction
基金项目 大学生创新创业训练计划项目(2015157Y)。
作者简介 冯佳丽(1995 － ) ，女，江苏南通人，本科生，专业:食品科学
与工程。* 通讯作者，教授，博士生导师，从事食品蛋白质功
能的研究。
收稿日期 2016-01-26
南烛(Vaccinium bracteatum Thunb) ，又名乌饭树，属杜鹃
花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium) ，由于江浙、福建、湖广一
带以其茎叶浸渍染米，加工乌饭，故而得名。研究南烛叶多
酚氧化酶(PPO)的最适提取条件，可为南烛叶 PPO的分离纯
化以及南烛叶染色机制的相关研究奠定基础。目前，植物活
体内直接提取 PPO的方法有丙酮法、匀浆法等，PPO 可分为
游离态和束缚态 2种，通常用丙酮法提取所得的是 PPO总酶
活，而用匀浆法提取所得则为可溶性酶活性［1］。很多试验表
明，匀浆法有助于游离态可溶性酶活性提高。李立祥等以安
徽农业大学茶园福鼎大白茶品种一芽二叶以及一芽三叶初
展为原料时，利用匀浆法和匀浆浸提法进行酶活测定的试验
数据显示，匀浆浸提对 PPO活性确有提高，其原因为:一方面
缓冲液匀浆法增大了料液的接触面积，酶蛋白易于溶出，同
时也可使束缚态的 PPO 部分转化为可溶性的酶溶出，使得
PPO酶得率提高;另一方面，缓冲液与茶鲜叶细胞液生理特
性比较接近，酶溶出后活性损失小［2］。笔者采用缓冲液匀浆
浸提的方法，并通过对各单因素的研究，对反应条件进行优
化，希望为南烛叶的工业化应用提供参考指导。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 原料。南烛叶采自江苏省宜兴市，洗净，冷冻干燥后
存于冰箱中备用。
1． 1． 2 主要仪器。Sigma-3K15 高速冷冻离心机，美国西格
玛奥德里奇集团;HWS24 电热恒温水浴锅，上海一恒科技公
司;AL204电子天平，梅特勒 －托利多上海有限公司;Alph-
1102可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司;BCD-191CＲ
冰箱，合肥荣事达电器有限公司;FE-20 pH计，瑞士梅特勒 －
托利多仪器公司。
1． 1． 3 主要试剂。交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、磷酸氢二
钠、柠檬酸、邻苯二酚，均为分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 不同添加量 PVPP对提取南烛叶 PPO的影响。参照
文献方法［3］，称取南烛叶粉末 5 份，每份 0． 5 g，料液比1∶ 12
g /mL，分别加入内含 0%、5%、7%、9%、11% PVPP(W/V)经
遇冷的 pH 6． 8的柠檬酸 －磷酸盐缓冲液(0． 1 mol /L) ，将匀
浆于 4 ℃下浸提 6 h，6 层纱布过滤，滤液在 4 ℃、12 000
r /min下离心 20 min，上清液即为粗制酶液，测定 PPO 酶活
性，分析不同 PVPP添加量提取南烛叶 PPO的效果。
1． 2． 2 不同料液比对提取南烛叶 PPO的影响。参照文献方
法［3］，称取南烛叶粉末 6 份，每份 0． 5 g，料液比 1∶ 9、1∶ 12、
1∶ 15、1∶ 18、1∶ 21、1∶ 24 g /mL，加入内含 5% PVPP(W/V)经遇
冷的 pH 6． 8的柠檬酸 －磷酸盐缓冲液(0． 1 mol /L)，后续提取
过程同“1．2．1”，分析不同料液比提取南烛叶 PPO的效果。
1． 2． 3 不同浸提时间对提取南烛叶 PPO的影响。参照文献
方法［3］，称取南烛叶粉末 4 份，每份 0． 5 g，料液比 1 ∶ 12
g /mL，加入内含 5% PVPP(W/V)经遇冷的 pH 6． 8的柠檬酸
－磷酸盐缓冲液(0． 1 mol /L) ，分别将匀浆于 4 ℃下浸提 3、
6、9、12 h，后续提取同“1． 2． 1”，分析不同浸提时间提取南烛
叶 PPO的效果。
1． 2． 4 不同 pH 的磷酸盐缓冲液对提取南烛叶 PPO 影响。
参照文献方法［3］，称取南烛叶粉末 8 份，每份 0． 5 g，料液比
1∶ 12 g /mL，分别加入内含 5% PVPP(W/V)经遇冷的 pH 为
5. 2、5． 6、6． 0、6． 4、6． 8、7． 2、7． 6、8． 0 的柠檬酸 －磷酸盐缓冲
责任编辑 李菲菲 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(5):128 － 129，132
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.05.047
液(0． 1 mol /L) ，后续提取同“1． 2． 1”，分析不同 pH的缓冲液
提取南烛叶 PPO的效果。
1． 2． 5 PPO酶活性的测定。参照文献方法［4 －5］，在试管中加
入 2 mL pH 6． 8的柠檬酸 －磷酸盐缓冲液(0． 1 mol /L) ，0． 9
mL的 0． 1 mol /L 的邻苯二酚，在 30 ℃恒温水浴中保温 5
min，然后加入 0． 1 mL 粗酶液，迅速摇匀，测定反应体系在
420 nm波长下的吸光度，以最初直线段的斜率计算酶活力。
双空白:一份以缓冲溶液及邻苯二酚作为空白，另一份
以缓冲溶液和粗酶液作为空白，并保证体积与反应试剂
相同。
酶活性的定义:以 1 min 内 420 nm 处吸光值(A)变化
0. 001 定义为 1 个酶活力单位(1 U) ，酶活性表示为:
酶活力(
U
mL)=
A
0． 001 ×反应时间(min)×测定时酶液用量(mL)
2 结果与分析
2． 1 PVPP不同添加量对南烛叶 PPO 提取的影响 PVPP
不同添加量提取南烛叶 PPO的效果如图 1所示。结果表明，
加入 PVPP的效果比不加 PVPP要好，且提取过程中加入 9%
的 PVPP的酶活最高。PVPP是一种酚类吸附剂，通过疏水作
用、氢键和范德华力与多酚形成复合物［6］。在缓冲液中加入
PVPP可以除去 PPO的酚类底物，同时也可以阻止提取过程
中酶的聚合与失活［7］。随着 PVPP 含量的提高，PVPP 吸附
酚类物质效果变好，可以有效防止 PPO的活性受损，但添加
较多时，又会对酶活产生抑制作用。
注:图中不同字母代表存在显著性差异(P ＜0． 05)。
Note:Different letters stand for significant differences(P ＜0． 05)．
图 1 不同 PVPP含量对提取南烛叶 PPO的影响
Fig． 1 Effects of PVPP content on PPO extraction from V．
bracteatum leaf
2． 2 不同料液比对南烛叶 PPO提取的影响 不同料液比
对提取南烛叶 PPO的效果图如图 2所示。结果表明，料液比
1∶ 15 g /mL时，提取所得的酶液的活性最高。料液比中溶剂
用量过低导致原料中的 PPO不能完全从组织中萃取出来，提
取不彻底造成其酶活较低;随着料液比中溶剂用量的增加，
可溶性蛋白全部溶出，酶活达到峰值［8］，再增加缓冲液的用
量时，稀释了 PPO的浓度，酶活性降低。由总酶活可知，在液
料比 1∶ 15 g /mL时缓冲液体积差不多达到饱和水平，其不再
是酶活的限制因素，故而再增加缓冲液体积时总酶活基本保
持不变。
注:图中不同字母代表存在显著性差异(P ＜0． 05)。
Note:Different letters stand for significant differences(P ＜0． 05)．
图 2 料液比对南烛叶 PPO提取的影响
Fig． 2 Effects of solid-liquid ratio on PPO extraction from V．
bracteatum leaf
2． 3 不同浸提时间对南烛叶 PPO提取的影响 浸提时间
对南烛叶 PPO提取效果的影响如图 3 所示。结果表明，9 h
的浸提时间下酶活性最高。数据表明，在一定时间范围内，
浸提时间越长，酶活呈现增长的趋势，但时间过长同时也会
对酶活有所抑制。浸提时间过短，酶不能完全从细胞中萃取
出来;随着时间的增加，由于酶蛋白在溶液状态下的构象不
稳定，以及南烛酚类等其他物质溶出，均容易导致酶活性的
降低［9 －10］。
注:图中不同字母代表存在显著性差异(P ＜0． 05)。
Note:Different letters stand for significant differences(P ＜0． 05)．
图 3 浸提时间对南烛叶 PPO提取的影响
Fig． 3 Effects of extraction time on PPO from V． bracteatum leaf
2． 4 pH不同的缓冲液对南烛叶 PPO 提取的影响 不同
pH缓冲液对南烛叶 PPO提取效果的影响如图 4所示。结果
表明，pH 7． 6 的缓冲液浸提南烛叶效果最佳，酶活性最高。
缓冲液在提取中的主要作用是中和细胞破碎时从空泡中放
出的大量的酸，保持 pH接近 7． 5以及离子强度在 0． 1 ～0． 5，
高离子强度有助于将酶从结合的膜上解析下来［11］。pH 在
5． 6 ～6． 4 的范围内，对维持 pH 和离子强度的作用相差不
大，当缓冲液的 pH达到 7． 6 时，酶活急剧增加，该环境下酶
蛋白易于被全部溶解。
(下转第 132页)
92144 卷 5 期 冯佳丽等 南烛叶多酚氧化酶最适提取条件的研究
低于我国限量标准，精密度、准确度均符合微量成分定量检
测的方法要求。该方法应用于大量川芎样品镉含量的测定，
适应性良好，分析结果稳定、高效、成本可控，是川芎中镉含
量测定的良好方法，可推广于其他中药材中镉含量的测定。
表 1 基体改进剂对定量准确度的影响
Table 1 Effects of matrix modifier on quantitative precision
基体改进剂
Matrix modifier
镉本底平均浓度
Average concentration of
cadmium background∥μg /L
加入镉理论浓度
Theoretical concentration
of added cadmium∥μg /L
测定镉平均浓度
Average concentration
of detected cadmium∥μg /L
回收率
Ｒecovery
rate∥%
无 No 0． 21 0． 40 0． 46 63． 3
磷酸二氢铵 Ammonium dihydrogen phosphate 0． 33 0． 40 0． 69 89． 6
磷酸 Phosphoric acid 0． 36 0． 40 0． 74 94． 3
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138 －141．
(上接第 129 页)
注:图中不同字母代表存在显著性差异(P ＜0． 05)。
Note:Different letters stand for significant differences(P ＜0． 05)．
图 4 pH对南烛叶 PPO提取的影响
Fig． 4 Effects of pH on PPO extraction from V． bracteatum leaf
3 结论与讨论
通过不同单因素的提取试验，确定南烛叶 PPO 的最适
提取条件为:适量南烛叶粉末，料液比 1∶ 15 g /mL，加入内含
9%的 PVPP(W/V)经遇冷的 pH 7． 6 的柠檬酸 －磷酸氢二钠
缓冲液(0． 1 mol /L) ，将匀浆于 4 ℃下浸提 9 h，6 层纱布过
滤，滤液在 4 ℃、12 000 r /min 下离心 20 min，上清液即为粗
制酶液，其酶活为 11 335 U /mL。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于果蔬
细胞的质体中［12］，而果蔬中又含有大量的酚类物质，在 PPO
的催化作用下进一步氧化、聚合生成黑色素，对 PPO的有效
提取造成一定困难，故需要对提取条件进行研究。研究表
明，不同来源的多酚氧化酶其提取条件有一定的差异，缓冲
液的最适 pH浮动较大。该研究以乌饭树叶为原料时，最适
提取条件为:pH 7． 6、PVPP含量9%、料液比为1∶ 15 g /mL;在
刘琨等以苏州碧螺春为原料的试验中，采用 pH 5． 6 的缓冲
液，料液比为 1∶ 4． 5 g /mL［13］;而卢丽娜等以奉化水蜜桃为原
料的试验中，采用 pH 8． 0的缓冲液，料液比为1∶ 12 g /mL［14］。
同时也有研究指出，提取过程中加入一定的 NaCl、PMSF、Tri-
tion-100等物质对 PPO的提取有一定的帮助，所得酶液的活
性较高。选用最适的提取条件可带来良好的生产效益，该研
究对未来南烛叶工业化的生产加工有指导意义。
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