全 文 ：红毛丹果皮多酚氧化酶的酶促动力学研究
刘伦沛，张文华 (凯里学院环境与生命科学学院，贵州凯里 556011)
摘要 ［目的］通过对红毛丹果皮多酚氧化酶的酶促动力学研究，寻找影响其催化活性的环境因素。［方法］以红毛丹果皮为试验材料，
以邻苯二酚为底物，研究不同温度、不同 pH、以及 EDTA、Vc、亚硫酸氢钠、柠檬酸 4 种抑制剂和底物浓度对其多酚氧化酶活性的影响。
［结果］红毛丹果皮多酚氧化酶的最适温度为 40 ℃，最适 pH值 6． 8;EDTA、Vc、NaHSO3、柠檬酸对多酚氧化酶活性表现出较好的抑制效
果，其中 EDTA的抑制效果较其他 3种抑制剂强。［结论］利用低温、一定浓度的 EDTA、Vc、NaHSO3、柠檬酸等试剂可抑制红毛丹果皮多
酚氧化酶的催化活性，延长红毛丹果实的贮藏和运输时间，抑制其褐变;该研究结果为开发利用红毛丹果皮多酚氧化酶提供了理论
依据。
关键词 红毛丹;多酚氧化酶;酶促动力学
中图分类号 S667． 9 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)25 －12662 －04
Studies on Enzymatic Reaction Kinetics of Nephelium lappaceum Polyphenol Oxidase
LIU Lun-pei et al (College of Environment and Life Science，Kaili University，Kaili，Guizhou 556011)
Abstract ［Objective］This study aimed to investigate the enzymatic reaction kinetics of polyphenol oxidase in peel of Nephelium lappaceum to
explore the environmental factors affecting its catalytic activity． ［Method］With Nephelium lappaceum peel as the experimental material and
catechol as substrate，effects of temperature，pH，four inhibitors (EDTA，Vc，sodium bisulfite and citric acid)and substrate concentration on
the activity of polyphenol oxidase were investigated． ［Result］ The optimal temperature for polyphenol oxidase in Nephelium lappaceum peel
was 40 ℃，and the optimal pH was 6． 8． EDTA，Vc，sodium bisulfite and citric acid all showed ideal inhibitory effects on the activity of poly-
phenol oxidase;specifically，EDTA had the strongest inhibitory effect． ［Conclusion］At low temperature，EDTA，Vc，sodium bisulfite and
citric acid with certain concentrations can inhibit the catalytic activity of polyphenol oxidase in peel of Nephelium lappaceum，extend the storage
and transportation time of Nephelium lappaceum fruit，and inhibit the browning． This study provides theoretical basis for the development and
utilization of polyphenol oxidase in peel of Nephelium lappaceum．
Key words Nephelium lappaceum;Polyphenol oxidase;Enzymatic reaction kinetics
基金项目 贵州省植物学重点支持学科建设项目(黔教高发［2011］275
号) ;凯里学院院级规划课题(Z0804) ;凯里学院植物学重点
学科建设项目(KZD2008002) ;凯里学院生物科学专业基础
课教学团队建设项目(JXTD201003)资助。
作者简介 刘伦沛(1967 －) ，男，贵州岑巩人，副教授，硕士，从事生物
化学、植物生理学的教学及生物资源开发与利用研究，E-
mail:gzliulp1103@ 126． com。
收稿日期 2012-05-14
红毛丹(Nephelium lappaceum Linn．)又称毛荔枝，属无患
子科科韶子属，多年生常绿果树，其果实为著名的热带珍稀
水果，呈椭圆形或倒卵形，侧面近圆或扁圆，果壳呈红色、黄
色和橙色;果肉白色透明，由假种皮发育而成，果皮易剥落，
种子一枚，为长卵形。原产于马来西亚群岛与东南亚各国，
如斯里兰卡、马来西亚、泰国、印度尼西亚、新加坡、菲律宾
等，是东南亚著名水果之一，泰国红毛丹有“果王”之称。美
国夏威夷和澳大利亚也有栽培。我国的台湾、海南有种植，
云南西双版纳有试种［1 －2］。最适宜红毛丹栽培的气候是在
赤道纬度 12°以内、海拔 600 ～ 700 m之间、温度范围 22 ～ 30
℃、降雨充足、年降雨量 2 000 ～5 000 mm的地区［3］。
红毛丹果实水份占 80． 7%，可溶性固形物占 15% ～
19%，营养较丰富，含总糖 12%左右，可溶性糖 7． 9%，维生素
0． 068%，蛋白质 0． 8%，脂肪 0． 3%，粗纤维 2． 4%［1］，另含有
磷、硫、钙、镁、锌等元素，是一种极具经济价值的热带水果，
在市场上享有较高的声誉，售价高。由于其营养丰富，且果
皮中含有多酚氧化酶，使得红毛丹果实耐贮性较差，在加工
和食用过程中易发生酶促褐变，从而导致产品质量下降，严
重影响其经济效益［4］。
多酚氧化酶(poLyphenoL oxidase，PPO)是一种含铜的氧
化酶，广泛存在于植物组织。它能催化内源性酚类物质氧化
成醌，再聚合成黑色素，是引起果蔬酶促褐变的主要原因之
一［5］。这种酶促反应常发生在苹果、香蕉、梨、薯类等果蔬
中，除了影响加工产品的色泽外，还会产生不良风味［4］。为
了防止果蔬类褐变的发生，有必要研究其 PPO 活性。目前，
对红毛丹的成分、经济价值、栽培和繁殖研究较多，但对红毛
丹果实中引起酶促褐变的 PPO活性研究较少。故该研究以
红毛丹果实为试验材料，以磷酸氢二钠 －柠檬酸、巴比妥 －
盐酸为缓冲试剂，邻苯二酚为底物，用分光光度法研究温度、
pH、抑制剂和底物浓度对红毛丹果中 PPO活性的影响，以期
为红毛丹果实的贮藏、运输、控制酶促褐变等提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料。供试用红毛丹果购于凯里市佳惠超市，
洗净晾干备用。
1． 1． 2 试剂。磷酸氢二钠、柠檬酸、巴比妥、盐酸、邻苯二
酚、还原型抗坏血酸(Vc)以及亚硫酸钠等均为市售分析纯。
1． 1． 3 主要仪器与设备。试验所用仪器主要有:TU － 1901
紫外可见分光光度计(北京普析通用设备有限公司)、TDL40
型低速台式大容量离心机(上海安亭)、恒温水浴锅、电子分
析天平以及冰箱等。
1． 2 方法
1． 2． 1 PPO的提取。称取冼净晾干的新鲜红毛丹果皮 40
g，加入处理好的不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)4 g和 pH 6． 8
的磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲液 100 ml，于研钵中研碎成浆，
用 3层纱布过滤，滤液中加入 30%饱和度的硫酸铵，在 4 000
责任编辑 王春艳 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(25):12662 － 12665
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.25.123
r /min下离心 5 min;上清液再加入 60%饱和度的硫酸铵，在
4 000 r /min下离心 5 min;去上清液，向沉淀中加入少量 pH
6． 8的磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲液溶解，并转入 100 ml 容量
瓶，用缓冲液定容至刻度，即得粗酶液，储存于 2 ℃的冰箱中
备用。
1． 2． 2 PPO酶促反应产物的光谱特性。取 pH 6． 8 磷酸氢
二钠 －柠檬酸缓冲液 3． 5 ml、0． 1 mol /L的邻苯二酚溶液 1． 0
ml和粗酶液 0． 5 ml，摇匀，35 ℃保温 6 min，在 350 ～ 600 nm
下进行波谱扫描，得其产物的吸收光谱曲线。
1． 2． 3 PPO活性测定。以保温 35 ℃的 pH 6． 8 磷酸氢二钠
－柠檬酸缓冲液 3． 5 ml、0． 1 mol /L的邻苯二酚溶液 1． 0 ml
和粗酶液 0． 5 ml(以煮沸失活的酶液为对照)为反应体系，摇
匀，从加入酶液后开始计时，每隔 1 min测定一次最大吸收波
长处的光吸收值，共测定 6 次，以其光吸收值变化 0． 01 为 1
个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力。
酶活力 =光吸收的变化值 ×粗酶液的稀释倍数0． 01 ×反应时间(min)
1． 2． 4 温度对 PPO 活性的影响。取反应体系溶液 11 份，
分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 ℃的温度条件
下，保温 6 min，加 5滴苯硫脲终止液，然后测定酶活性，分析
温度对 PPO活性的影响。
1． 2． 5 pH对 PPO活性的影响。用 0． 2 mol /L磷酸氢二钠
和 0． 1 mol /L的柠檬酸配制 pH 3． 0、4． 0、5． 0、6． 0、6． 2、6． 4、
6． 6、6． 8、7． 0、7． 2、7． 4、7． 6、7． 8 和 8． 0 的缓冲液，用 0． 04
mol / L的巴比妥和0． 2 mol /L的盐酸配制 pH 8． 4、8． 8、9． 2和
9． 6的 pH 梯度缓冲溶液［6］。用不同的 pH 缓冲溶液，按照
“1． 2． 1”PPO 的提取方法分别提取红毛丹果皮的多酶氧化
酶，将粗酶液定容至 100 ml，然后分别取定容粗酶液 0． 5 ml、
加入对应的缓冲溶液 3． 9 ml、0． 1 mol /L 的邻苯二酚溶液1． 0
ml，摇匀，35 ℃保温 6 min，加 5滴苯硫脲终止液，然后测定酶
活性，分析 pH对 PPO活性的影响。
1． 2． 6 抑制剂对 PPO活性的影响。取 pH 6． 8 的磷酸氢二
钠 －柠檬酸缓冲液 6． 0 ml、0． 1 mol /L的邻苯二酚溶液 2． 0
ml和粗酶液 1． 0 ml 组成反应体系，分别加入不同浓度
(0． 01、0． 02、0． 03、0． 04 和 0． 05 mmol /L)的 NaSO3、Vc、柠檬
酸和 EDTA 1 ml，摇匀，35 ℃保温 6 min，加 5 滴苯硫脲终止
液，测定其酶活性。
1． 2． 7 底物浓度对酶活性的影响。将7． 0 ml pH 6． 8的磷酸
氢二钠 －柠檬酸缓冲液和 1． 0 ml粗酶液混合，向混合液中分
别加入不同浓度(0． 1、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 和 1． 2 mol /L)
邻苯二酚溶液 2． 0 ml，摇匀，在 35 ℃条件下保温 6 min，加 5
滴苯硫脲终止液，测定酶活性。
2 结果与分析
2． 1 PPO的酶促反应产物的光谱特性 PPO酶促反应产
物的光谱曲线如图 1所示。
由图 1可知，红毛丹果皮多酚氧化酶催化邻苯二酚的酶
促反应产物在蓝紫光区有一个吸收峰，其中最大吸收波长为
420 nm，这表明研究红毛丹果皮多酚氧化酶的酶促动力学，
可选择在 420 nm处测定其酶促产物的光吸收值。
图 1 红毛丹果皮多酚氧化酶催化邻苯二酚的酶促反应产物光谱
曲线
2． 2 PPO的活性测定 由图 2 可知，红毛丹果皮中的多酚
氧化酶的催化活性在反应开始 3 min内，酶活性增加较快，到
4 min后，酶活性趋于最大，表明该酶促反应在开始阶段，酶
的活性较强，但随着时间的进行，酶的活性趋于稳定。
图 2 酶促反应时间与酶活性
2． 3 温度对 PPO 活性的影响 由图 3 可知，红毛丹果皮
PPO在 30 ～50 ℃范围内的活性较强，其发挥活性的最适温
度为 40 ℃;在 10 ～ 40 ℃范围内，酶的活性随温度的增加而
加大，当温度高于 40 ℃以后，随温度的增加酶的催化活性减
弱，且较迅速。这一特性符合蛋白酶的基本特征，即温度过
低不利于酶分子活性中心的形成或暴露，同时底物分子的热
能较低，有效分子相对较少，反应速率较慢;温度升高会增加
底物分子的热能，增加反应有效分子数，从而增加反应速率，
然而温度过高时，会破坏维系酶分子之间的多重非共价弱相
互作用力，改变酶活性部位的结构，导致酶的催化活性降低
或丧失。
2． 4 pH对 PPO活性的影响 由图 4 可知，在该试验反应
体系中，PPO的活性在 pH为 6 ～8之间较高，在 pH 6． 8时酶
的活性最大，即其最适 pH为 6． 8。在过酸或过碱性条件下，
酶活性都变小。主要原因可能是 pH的大小不同，影响 PPO
分子中必需基团的解离，改变酶分子活性中心的酸碱环境，
进而影响酶的活性中心，使酶活性逐渐降低。
2． 5 抑制剂对 PPO 活性的影响 由图 5 可知，NaHSO3、
Vc、柠檬酸和 EDTA 4种试剂对红毛丹果皮的 PPO均有抑制
作用，当抑制剂浓度在 0 ～ 0． 03 mmol /L范围内，随着抑制剂
浓度的增加，酶的活性降低较快，抑制剂浓度超过 0． 03
3662140 卷 25 期 刘伦沛等 红毛丹果皮多酚氧化酶的酶促动力学研究
图 3 温度对 PPO活性的影响
图 4 pH对 PPO活性的影响
图 5 抑制剂对酶活性的影响
mmol /L以后，酶的活性降低较缓慢;几种抑制剂以 EDTA的
抑制作用较强，其他 3种抑制剂的抑制作用相对较弱，且这 3
种抑制剂在 0 ～0． 03 mmol /L范围内，Vc的抑制作用较 NaH-
SO3 和柠檬酸强，当抑制剂浓度大于 0． 03 mmol /L以后，柠檬
酸的抑制作强于 Vc和 NaHSO3。
2． 6 底物浓度对酶活性的影响 鉴于 PPO酶促反应以测定
产物的光吸收值(即产物的量)为指标，来计算其酶活性，故
利用底物浓度对酶活性作图，即可得到底物浓度与酶促反应
速率的关系，如图 6所示。
由曲线的斜率可以看出，当底物邻苯二酚浓度在 0 ～0． 4
mol /L范围内，曲线的斜率增加较快，即酶的活性随底物浓度
的增加而快速增加，亦说明在该底物浓度范围内，酶促反应
的速率快速增加;当底物浓度达 0． 4 mol /L以后，曲线斜率增
加缓慢，到 1． 0 mol /L以后曲线较平缓，亦即在该浓度之后，
酶促反应速率几乎接近反应的最大速率(图 6)。
若以底物浓度的倒数对酶活力的倒数作图，即双倒数
作图，即可得图 7 所示的双倒数曲线。将曲线延伸，可得横
图 6 底物浓度对酶活性的影响
图 7 双倒数作图曲线
轴上的截距 1 /Km 为 7． 35，纵轴上的截距 1 /Vmax为 0． 696 ×
10 －3，从而可知红毛丹果皮 PPO的酶促反应米氏常数 Km 为
0． 136 mol /L，最大反应速率 Vmax为 1 437活力单位，其酶促动
力学方程为:
V = 1 437 ×［S］0． 136 +［S］
3 结论与讨论
该研究以邻苯二酚作底物，分别在不同温度、不同 pH
值、不同抑制剂的条件下，研究红毛丹果皮中多酚氧化酶的
酶促动力学效应，结果显示，该酶的最适温度为 40 ℃、最适
pH为 6． 8，即在该条件下酶的活性较高。反应体系的温度和
pH值过高或过低，该酶的催化活性均降低，这一特性与绝大
多数酶的最适反应条件相似，但其最适温度较动物来源的酶
的最适温度稍高，与不同植物来源的多酚氧化酶的最适温度
也有一定差异，如桃 PPO的最适温度为 20 ℃，番石榴的最适
温度为 50 ℃［7］;最适 pH与不同来源的酶的最适 pH也有差
异，有文献报道香蕉 PPO的最适 pH为 5． 6，澳洲青苹 PPO的
最适 pH为 6． 5，菊芋 PPO的最适 pH为 7． 1［5］。
当反应体系中有 NaHSO3、Vc、柠檬酸和 EDTA 存在时，
酶的活性均受到影响，这可能是由于多酶氧化酶是一种含有
铜离子的金属蛋白酶，加入金属离子螯合剂 EDTA 时，可使
铜离子不能参与氧化还原反应，而降低了这种金属蛋白酶的
催化活性;Vc、NaHSO3 作为还原剂，可直接还原氧化剂(如氧
气) ，使氧化剂不易与酶的活性中心结合，从而导致底物邻苯
二酚不能被酶催化氧化为有色的醌类化合物，即表现为酶的
活性低，酶促反应速率减慢;柠檬酸作为一种酸性化合物，在
酶促反应体系中，随着柠檬酸浓度的增加，环境的酸性增强，
46621 安徽农业科学 2012年
可改变酶的必需基团，特别是酶活性中心必需基团的解离，
从而影响酶的酸碱催化效应，影响酶的活性。
以不同的底物浓度对红毛丹果皮 PPO的酶促反应动力
学进行研究，结果显示，在一定底物浓度范围内，酶促反应速
率随底物浓度的增加而增大，符合米氏酶的特征，其米氏常
数 Km 为 0． 136 mol /L，最大反应速率 Vmax为 1 437活力单位。
通过对红毛丹果皮 PPO 的酶促动力学研究，弄清了该
酶的催化活性以及影响其催化活性的外界环境条件，得出其
动力学方程，从而为下一步开发利用该酶或抑制该酶活性提
供了理论依据，对红毛丹果贮藏、运输和加工过程中抑制其
褐变等方面研究有较好的应用价值。
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11 －15．
(上接第 12632页)
为公园增添了一道明快的色彩。公园的大门悬挂着两只大红
色的灯笼，既能昭示唐代元素，又能增添公园色彩。最具特色
的是主景树的枝条上系着的红丝带(图 10)，这些红丝带随意
地系在枝条上，随风摇弋，映衬得格外艳丽，仿佛暗示游赏者即
将进入繁华的唐朝宫苑。灰色的公园城墙略微单一，在墙面上
局部覆盖爬山虎，突出墙体的沧桑感，在城楼上布置两排鲜艳
的战旗，为灰色的城墙注入了生气，也显示出传统文化元素。
3． 6 音效 以上所提到的唐城遗址公园意境的营造都是
利用“有形之物”，不论是人工的，还是天然的，都是通过人
的视觉感官来接受的，那么听觉所能感受到的，同样能够营
造出遗址公园意境。当游赏者登上城墙顶，扶栏远眺时，身
侧的战旗烈烈作响，角楼上传来铜铃铛清脆的声音(图 11
～ 12) ，城墙脚下大片的植被发出的沙沙声，不远处的观音
寺传来的梵音组合在一起，一瞬间将游赏者带回到唐时的
城楼上。
图 10 入口处植物障景 图 11 角楼 图 12 城墙顶端
3． 7 主题活动 公园内定期举办了一些围绕公园主题的活
动，让游赏者参与进来，使游赏者更加了解公园的主题内容。
如上文提到的红丝带，是公园内举办祈福活动时，由游赏者
在参与活动的过程中系在树枝上，以祈求平安。这些红丝带
已成为公园的一处风景，尤其在冬季，开花植物较少，枝干上
的红丝带在肃静的冬日，使整个公园增色不少。公园内还举
办邮票发行活动，管理者将公园内的风景请名家画成水墨
画，印成邮册，吸引集邮爱好者，宣传公园的唐文化主题。
4 结语
意境是设计者、欣赏者和被欣赏客体之间交流的媒介，
一直是中国园林的追求。唐城遗址公园通过公园的周边环
境，公园的空间结构、景观小品、植物配植的恰当处理，再现
唐扬州衙城的景象，并通过音效、园内活动来完成意境的营
造，让物境能打动欣赏者，引发欣赏者的深思，体会公园意
境。意境的营造不止限于设计者，还要通过设计者、游赏者、
管理者的共同推动，才能将公园意境更加全面地营造出来。
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5662140 卷 25 期 刘伦沛等 红毛丹果皮多酚氧化酶的酶促动力学研究