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水蜡树果中多糖的提取纯化及其抗氧化性



全 文 : [收稿日期] 2011-07-24;2011-11-01修回
 [作者简介] 于加平(1973-),男,讲师,从事分析化学和天然产物的教学与科研工作。E-mail:yujiaping0607@tom.com
[文章编号]1001-3601(2011)12-0782-0226-03
水蜡树果中多糖的提取纯化及其抗氧化性
于加平
(吉林农业科技学院 生物工程学院,吉林 吉林132101)
  [摘 要]为探索水蜡树果中多糖的提取纯化方法及其体外抗氧化活性,采用水提醇沉法提取水蜡树果
中多糖,并考察了水蜡树果多糖对羟基自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)和DPPH自由基(DPPH·)的
清除效果。结果表明,水蜡树果多糖的含量为0.224mg/g,方法回收率在97.70%~100.51%,RSD 为
0.379%。说明,水蜡树果多糖具有很强的抗氧化活性,是天然的抗氧化剂,对疾病的治疗、食品领域及化妆
品产业均有开发利用价值。
[关键词]水蜡树果;多糖;提取;抗氧化性
[中图分类号]S687 [文献标识码]A
Extraction and Purification of Polysaccharide from Ligustrum
obtusifoilumFruit and Its Oxidation Resistance
YU Jia-ping
(College of Bio-engineering,Jilin University of Agricultural Science and Technology,Jilin,Jilin132101,China)
  Abstract:The methods of water extraction and alcohol precipitation were used to explore the
extraction and purification of polysaccharide fromL.obtusifoilumfruit and its oxidation resistance.And
the elimination effects of polysaccharide on hydroxyl radical(·OH),superoxide radical(O2-· )and
DPPH free radical(DPPH·)were studied.The results showed that the content of polysaccharide in
L.obtusifoilumfruit was 0.224%.The recovery rate was 97.70%~100.51% with RSDof 0.379%.Al
above indicated that the polysaccharide of L.obtusifoilumfruit was a natural antioxidant with strong
activity of oxidation resistance,and it had values for exploitation and utilization in disease treatment,food
industry and cosmetics industries.
Key words:Ligustrum obtusifoilum;polysaccharide;extraction;antioxidant activity
  水蜡树(Ligustrum obtusifolium S.Et Z.)属
木犀科女贞属植物、落叶灌木[1]。我国水蜡树资源
非常丰富,主要分布于山东、江西、安徽、江苏、湖南、
陕西等地,具耐干旱、结果率高、收效大等优点,目前
主要用作城市绿化,其果实大部分被废弃。水蜡树
的枝叶具有清热解毒、消肿止痛的功效[2]。目前,有
关水蜡树活性成分的研究主要是齐墩果酸、氨基酸
和微量元素[3],而有关水蜡树果中多糖的研究却鲜
见报道。据现代药理和临床研究表明,多糖具有很
强的生物活性,是一种免疫调节剂,它能激活免疫细
胞,提高机体的免疫功能[4]。除此之外,多糖还具有
抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒、保护肝
脏等保健作用[5-7]。为进一步研究水蜡树药用价值,
笔者以水蜡树果为原料,对水蜡树果中多糖进行提取
纯化,并对其抗氧化性进行了研究,可为水蜡树的进
一步研究和开发利用提供理论依据和数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 水蜡树果 采自吉林农业科技学院校园
内,经专家鉴定为水蜡树果。阴干、低温烘干处理为
干品。
1.1.2 仪器 JA1203N型电子天平,上海精密科
学仪器有限公司;DYF-500型摇摆式高速万能粉碎
机,江阴市万达药化机械有限公司;UV-1600型紫
外可见分光光度计,北京普析;SHB-IIIA型循环水
真空泵,郑州长城科工贸易有限公司;DHG-9240A
型电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;
HH-S型水浴锅,江苏省金坛市正基仪器有限公司。
1.1.3 试剂 乙醚、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、水杨
酸、葡萄糖、Tris、盐酸、邻苯三酚、H2O2、硫酸亚铁、
氯仿、正丁醇、DPPH、氢氧化钠,以上试剂均购于沈
阳市新宇化工试剂厂,均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 水蜡树果多糖的提取与纯化 取200g水
蜡树果粉末,用乙醚进行脱脂脱色,然后于1L蒸馏
水中煮沸4h,间歇搅拌,过滤,滤渣用同样方法水
提4次,合并提取液,将提取液减压浓缩至300mL。
将浓缩液pH 调为8.0,然后滴加 H2O2脱色,直至
色素完全除去,再用sevage法[8]去除蛋白,再经离
 贵州农业科学 2011,39(12):226~228
 Guizhou Agricultural Sciences
心机离心分离,得上清液。将上清液于流动水中透
析48h,透析液减压浓缩,透析液中加95%的乙醇
(使含醇量达85%以上),于冰箱中静置过夜。离心
分离,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗2次,真
空干燥至恒重,即得精制水蜡树果多糖。
1.2.2 水蜡树果多糖含量的测定
1)标准曲线的绘制。采用苯酚-硫酸法[9],以
葡萄糖为标准样品,精密称取105℃干燥至恒重的
无水葡萄糖标准品25mg,置于250mL容量瓶中,
加蒸馏水至刻度,配成0.1mg/mL的标准溶液。分
别移取上述标准溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、
0.4mL、0.5mL、0.6mL和0.7mL,依次加水,使最
终体积均为1mL。另取 H2O 1mL做空白试验,每
支试管加10%苯酚溶液1mL,摇匀。然后每支试管
中迅速加入浓 H2SO45mL,并放入冷水中冷却(摇
5min后放置35min),摇匀。在490nm处测定吸光
度,绘制标准曲线,得回归方程:C=0.624 A-
0.021,r=0.967(n=5)。
2)换算因子f的计算。称取1.2.1中所得纯
化多糖1mg,定容至50mL,使浓度Cs=0.02mg/
mL。精确量取1mL按标准曲线绘制方法测定吸光
度,得A=0.057,代入回归方程得Cf=0.015,校正
因子f=Cs/Cf=1.33。
3)水蜡树果多糖含量的测定。准确称取5.00g
水蜡树果粉末,按照1.2.1的提取方法提取多糖,再
按标准曲线绘制方法测定吸光度A,将A代入回归
方程得C。根据下列公式计算得多糖的含量m。
m/(mg/g) =V
·C·F

式中,V 为提取液的体积,C为样品液中所含多
糖量(mg),f为校正因子,W 为水蜡树果样品质量
(g)。
4)回收率和精密度检验。为了考察方法的可
靠性,精密称取水蜡树果样品5份(每份1.000g),
分别加入一定量纯化的水蜡树果多糖,按3)方法进
行测定。
1.2.3 水蜡树果中多糖的抗氧化性研究
1)对 DPPH·自由基的清除率。准确称取
1.81mg的DPPH,用无水乙醇定容至25mL(避光
保存),取10mL用无水乙醇稀释2倍得到浓度为
0.1μmol/L的DPPH溶液。吸取0.1mL浓度分别
为 0、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、
0.80mg/mL的多糖溶液,置于干燥试管中,并向各
试管中分别加入2mL DPPH溶液,轻轻摇匀,在黑
暗中放置20min,以85%乙醇为空白,在517nm处
测定吸光度值。每个试样作3次平行试验,取平均
值。按下式计算清除率。
P/%=(1-Ai-AjA0
)×100
式中,A0为0.1mL 85%乙醇溶液加 2mL
DPPH溶液的吸光度值,Ai为0.1mL多糖溶液加
2mL DPPH溶液的吸光度值,Aj为0.1mL样液加
2mL 85%乙醇溶液吸光度值,P为清除率。
2)对超氧阴离子自由基的清除率。分别取4.5
mL 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)于5
支试管中,置于25℃水浴中预热20min,取出后立
即分别加入1mL浓度为0、0.20mg/mL、0.40mg/
mL、0.60mg/mL 和0.80mg/mL 的多糖溶液和
0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液,混匀后于25℃水
浴中反应5min,立即加入8mmol/L HCl 1mL终止
反应,于420nm处测定吸光度值Ai,空白对照以相
同体积蒸馏水代替样品,每个试样做3次平行试验,
取平均值。根据所测吸光度值,计算各种不同浓度
的水蜡树果多糖对抗氧化剂的清除率。按下式计算
清除率。
P/%=(A0-AiA0
)×100
式中,A0为邻苯三酚溶液吸光度值,Ai为样液
吸光度值,P为清除率。
3)对羟基自由基的清除率。取6支试管,分别
加入 浓 度 为 6mmol/L Fe2+ -水 杨 酸-乙 醇 溶 液
1mL,再 向 试 管 中 分 别 加 入 1mL 浓 度 为 0、
0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL 和
0.80mg/mL的多糖溶液,加蒸馏水至5mL,再分别
加入6mmol/L H2O21mL,10min后以蒸馏水为参
比,于510nm处测定吸光度值。每个试样做3次平
行试验,取平均值。按下式计算清除率。
P/%=(A0-AiA0
)×100
式中,A0为Fe2+ -水杨酸-乙醇溶液吸光度值,
Ai为样液吸光度值,P为清除率。
2 结果与分析
2.1 水蜡树果中多糖的含量
根据1.2.1方法提取水蜡树果多糖,然后按
1.2.2方法测定水蜡树果中多糖的含量,测得其中多
糖的含量为0.224mg/g。
2.2 水蜡树果中多糖的抗氧化性
2.2.1 水蜡树果中多糖对DPPH·的清除率 水
蜡树果多糖对DPPH·有很强的清除作用,随着水
蜡树果多糖浓度的增加,对DPPH·的清除作用越明
显。多糖对DPPH·的清除活力随多糖浓度的增加
而增强,但随着浓度增加,清除率增加变缓(表1)。
2.2.2 水蜡树果中多糖对O2-·的清除率 水蜡
树果多糖对O2-·也有很强的清除作用,5种浓度
的水蜡树果多糖对O2-·的清除率均随浓度的增加
而增大,即有一定的剂量效应。随着水蜡树果多糖
浓度的增加,对O2-·的清除作用越明显(表1)。
·722· 第12期 于加平 水蜡树果中多糖的提取纯化及其抗氧化性研究
表1 水蜡树果多糖对DPPH·、O2-·和·OH的清除率
   Table 1 The clearance rate of polysaccharide in
L.obtusifoilumfruit to DPPH·,
O2-·and·OH
多糖浓度/(mg/mL)
Polysaccharide concentration
清除率/%Clearance rate
DPPH· O2-· ·OH
0.00 0.00 0.00 0.00
0.20  53.53  61.12  66.32
0.40  61.27  73.03  79.88
0.60  82.10  82.01  88.23
0.80  89.06  90.99  98.88
2.2.3 水蜡树果中多糖对·OH的清除率 水蜡
树果多糖对羟基自由基也有很强的清除作用,随着
水蜡树果多糖浓度的增加,对羟基自由基的清除作
用越明显,即清除率与多糖的用量存在一定的量效
关系(表1)。
2.3 回收率与精密度
由表 2 可 见,加 标 回 收 率 在 97.70% ~
100.56%,相对标准偏差(RSD)为0.379%。说明,
该方法具有很好的精密度和准确度,此方法可行。
表2 水蜡树果多糖含量测定的回收率和精密度(n=5)
Table 2 The recovery and accuracy of the determination of polysaccharide in L.obtusifoilumfruit
编号
No.
取样量/g
Sampling
amount
多糖含量/mg
Polysaccharide
content
加入纯化多糖量/mg
Adding amount of
purified polysaccharide
测定值/mg
Determination
value
回收率/%
Recovery
RSD/%
1  1.000  0.224  0.132  0.358  100.56  0.379
2  1.000  0.224  1.152  1.356  98.73
3  1.000  0.224  0.318  0.544  100.31
4  1.000  0.224  0.718  0.929  98.60
5  1.000  0.224  0.327  0.538  97.70
3 小结
由试验结果可知,水蜡树果中多糖的含量为
0.224mg/g,水 蜡 树 果 多 糖 对 DPPH 自 由 基
(DPPH·)、超氧阴离子(O2- ·)和羟基自由基
(OH·)均有显著的清除效果,因此,水蜡树果多糖
具有较强的抗氧化性,是一种天然的抗氧化剂,对疾
病的治疗及化妆品产业均有开发利用价值。
目前,水蜡树主要用作城市绿化树种,其果大部
分被废弃。本研究可为水蜡树资源在药用价值等方
面的进一步开发和利用奠定理论基础和数据支持。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:刘 海)
·822·                   贵 州 农 业 科 学 2011,39卷