全 文 ：Vol.28 高 等 学 校 化 学 学 报 No.6
2 0 0 7 年 6月 　 　　　　　CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES　　　　　 　 1088 ～ 1091
柘树根多糖的分离纯化及结构表征
石　磊 1, 2 , 陈靠山 1 , 董　群 2 , 方积年2 , 丁　侃 2
(1.山东大学生命科学学院 , 济南 250100;2.中国科学院上海药物研究所 , 上海 201203)
摘要　以柘树 [ Cudraniatricuspidata(Car.)Bur.]的根为材料 , 经热水抽提 、 木瓜蛋白酶-Sevag法除蛋白 、乙
醇沉淀和 DEAE-SephadexA-50凝胶柱层析分离纯化 , 得到一种水溶性的柘树根多糖(CPS-0).采用 HPLC、
糖基组成分析 、甲基化分析 、 GC、 GC-MS、 NMR(1HNMR, 13CNMR及 HMQC)、 元素分析 、 UV和 IR等技术
对 CPS-0的纯度 、 性质 、 组成和结构进行表征.结果表明 , CPS-0仅含葡萄糖 , 分子量为 4.6 ×103 , 主链由
1, 4-连接的 α-D-葡萄糖残基组成 , 其侧链由末端及 1, 4-连接的葡萄糖残基构成 , 取代于主链分支点葡萄糖
的 6位 , 平均每 10个葡萄糖残基组成的重复单元中含有 1个分支.
关键词　柘树根;多糖;分离纯化;结构表征
中图分类号　O629;Q533;Q935;Q949　　文献标识码　A　　文章编号　0251-0790(2007)06-1088-04
收稿日期:2006-07-12.
基金项目:中国科学院 “百人计划 ”人才引进启动基金资助.
联系人简介:丁　侃(1966年出生), 男 , 博士 , 研究员 , 博士生导师 , 从事糖化学和糖生物学研究.
E-mail:kding@mail.shcnc.ac.cn
柘树 [ Cudraniatricuspidata(Car.)Bur.]为桑科柘属植物 , 落叶灌木或小乔木 , 又名柘木 、刺桑 、
柘桑 、黄桑 、奴柘 、柞树等 , 分布在我国华东 、中南 、西南至河北南部.柘树的根 、茎 、叶及果实等均可
入药 [ 1] .其中 , 柘树根性味淡凉微苦 , 具有祛风利湿 、活血通经 、止咳化痰之功效 , 可用于治疗风湿关
节疼痛 、黄疸 、淋浊 、闭经 、跌打损伤以及疔疮痈肿等症;近年来又用于治疗食管癌 、胃癌等消化道癌
症 , 其疗效显著 [ 2, 3] .因此 , 从柘树根中开发抗肿瘤药物具有重要意义和较好前景.目前从柘木中分离
并鉴定的化合物主要为氧杂蒽酮(Xanthone)类和黄酮类 , 含有生物碱 、木质素及香豆素等成分[ 4 ～ 10] .
而柘木中含有多糖类成分的研究尚未见报道.我们已从柘树根中分离出 3种多糖成分并证实其具有显
著的体外免疫增强作用[ 11] .本文报道了从枯树根中分离出的又一种多糖成分的理化性质和化学结构.
1　实验部分
1.1　材料 、试剂与仪器
柘树根购自安徽省亳州市中药大市场 , 经山东大学生命科学学院徐誉泰教授鉴定为 Cudraniatri-
cuspidata(Car.)Bur.将其自然晾干后 , 机械粉碎 , 备用.T系列 Dextran标准品 、 DEAE-SephadexA-50
葡聚糖凝胶(Pharmacia产品);D3520型树脂(南开大学化工厂生产);高效硅胶 60GF254薄层板(青岛
海洋化工厂产品);标准单糖(Sigma产品);DMSO(Fluka产品);牛血清白蛋白(BSA)为中国医药集团
上海化学试剂公司进口分装;其余试剂均为国产分析纯.Cintra5紫外-可见分光光度计(澳大利亚
GBC科学设备公司);ModulyoD-230真空冷冻干燥仪(美国 ThermoSavant公司);SORVALL高速冷冻
离心机(美国 Kendro公司);NEXUS470 FTIR傅里叶变换红外光谱仪(美国 Nicolet公司);AVANCE-
600超导核磁共振波谱仪(瑞士 Bruker公司);Waters515高效凝胶渗透色谱仪(美国 Waters公司 , 配
有 Waters2410示差折光检测器);VarioELⅢ元素分析仪(德国 Elementar公司);岛津 GC-14B气相色
谱仪 , 3%OV-225/AW-DMCS-Chromosorb(80 ～ 100目)玻璃填充柱;GCT型气相色谱-质谱联用仪(美国
Waters公司 , 配有 AgilentHP6890型气相色谱仪);Bǜchi461型旋转蒸发器(瑞士 Bǜchi公司).
1.2　实验方法
1.2.1　提取与分离纯化　取粉碎的柘树根 1 kg, 加 8倍体积的水 , 于 70 ℃提取 3次 , 每次 2 h;合并
提取液 , 离心 , 上清液经 D3520型柱除去黄酮类等物质 , 通过柱的流出液浓缩至原体积的 1 /3;将浓缩
液离心 , 收集上清液 , 用 4倍体积的体积分数为 95%乙醇进行沉淀 , 静置过夜后离心 , 将沉淀物依次
用无水乙醇 、丙酮 、乙醚洗涤 , 红外线干燥.用水溶解沉淀 , 使之复溶 , 采用木瓜蛋白酶 -Sevag法脱蛋
白 [ 12] , 重复 5次直至液面交界处无胶状物 , 除去残留有机溶剂 , 透析 , 冷冻干燥后得淡黄色柘树根粗
多糖(CPS).取适量 CPS溶于水 , 于室温进行 DEAE-SephadexA-50凝胶柱层析 , 用水洗脱 , 苯酚 -硫酸
法跟踪检测.合并洗脱单一高峰部分 , 透析后减压浓缩 , 冷冻干燥 , 得柘树根多糖纯品(CPS-0).
1.2.2　纯度及分子量测定　采用 HPLC法测定多糖的纯度及分子量 [ 13] .用标准分子量的 DextranT-
2000, T-110, T-70, T-40, T-20和葡萄糖作标准曲线 , 洗脱液为 2.5×10-3 mol/L, pH为 6.0的磷酸缓
冲液 , 标准品及样品的进样浓度均为 1mg/mL, 进样量 20μL, 流速 0.7mL/min.根据样品的峰形判断
其纯度 , 样品分子量由标准曲线求得.
1.2.3　单糖组成分析　参照文献 [ 14]方法 , 取 4mgCPS-0, 溶于 2mol/L三氟乙酸中 , 于 110 ℃封管
水解 2h.加甲醇反复减压浓缩至干(<40℃), 以完全除去 TFA.残余物以水溶解 , 取 20μL点样于纤
维素板上 , 展开溶剂体系为 V(乙酸乙酯)∶V(吡啶)∶V(冰乙酸)∶V(水)=5∶5∶1∶3, 苯胺 -二苯胺显色.
在剩余溶液中加入 25 mg硼氢化钠 , 于室温还原 3 h, 间歇振荡 , 用乙酸中和至无气泡出现.加甲醇反
复减压蒸发至完全干燥.于 100 ℃干燥 15min, 加乙酸酐 2mL, 100 ℃反应 1h.反应液反复加甲苯减
压蒸发除去乙酸酐 , 产物用氯仿萃取 , 水洗 4次.氯仿层用无水硫酸钠干燥 , 浓缩后 , 进行 GC分析.
1.2.4　甲基化分析　按 York改进的 Ciucanu法 [ 15] , 取经 P2O5充分干燥的 5mgCPS-0 , 溶于 1.5mL无
水 DMSO中 , 通 N2气 , 加入 20mgNaOH, 室温下搅拌 , 冰浴冷却 , 慢速滴加 0.3mLCH3I;再搅拌反
应 20min后 , 反应液经减压蒸发除去未反应的 CH3I后 , 对水透析 , 将透析袋内液减压浓缩后冷冻干
燥.重复操作 4次 , 取少量甲基化产物用石蜡膜法测定 IR谱 , 确定甲基化是否完全.完全甲基化的多
糖的 IR谱中 3400 cm-1(O—H)峰消失.将全甲基化产物水解 、还原 、乙酰化后进行 GC-MS分析.
1.2.5　表征　取 2.0mg样品 CPS-0(KBr压片), 在 4000 ～ 400cm-1范围内进行红外扫描.取 50mg样
品 CPS-0溶于 0.5 mLD2O(预先用 D2O交换 1次)中 , 于室温下测定 1HNMR、 13CNMR及 HMQC谱.
2　结果与讨论
2.1　柘树根多糖 CPS-0的理化性质
CPS-0为白色絮状物 , 无臭 , 易吸湿 , 易溶于水 , 不溶于乙醚 、氯仿 、丙酮 、正丁醇及乙醇等有机
溶剂 , 热稳定性较好.比旋光度 [ α] D为 +179.2°(c0.60, H2O).CPS-0溶液(1mg/mL)的碘-碘化钾反
　Table1　CharacteristicsofcomplexI
2
-CPS-0
Sample Color λmax/nm Absorbance/a.u.
Solublestarch Bluepurple 582.8 1.640
I2 -CPS-0 Lightred 497.8 0.191
应呈淡红色 , 不同于通常淀粉的蓝色反应.CPS-0
与碘形成复合物的颜色及最大吸收波长 λmax列于表
1.在相同条件下 , CPS-0的最大吸收向短波长方向
移动 , 吸光度也大为降低.
2.2　元素分析 、纯度及分子量测定
元素分析结果显示 , CPS-0的 C, H含量分别为 40.54%和 6.597%, 不含 N和 S, 证实该多糖不含
蛋白质.计算 CPS-0的 C, H, O元素的摩尔比为 1∶2∶1, 符合糖类的元素组成及比率.
双缩脲反应呈阴性 , 表明样品中可能不含蛋白质.α-萘酚显色反应呈阳性 , 表明样品是糖组分.
紫外扫描在 280和 260nm处均未见吸收峰 , 表明样品中很可能不含蛋白质 、多肽和核酸.CPS-0是由
水提多糖粗品经 DEAE-SephadexA-50柱层析用水洗脱得到的 , 其在 HPLC中为单一对称峰 , 表明该多
糖为均一组分.根据洗脱时间 , 从标准曲线上求得 CPS-0的数均分子量为 4632, 重均分子量为 5890.
重均分子量与数均分子量的比值为 1.3 , 表明该多糖的分子量分布比较窄.
2.3　结构分析
该多糖经 2mol/L三氟乙酸完全水解后进行纤维素板层析 , 只有一个斑点 , 其 Rf值与葡萄糖一致 ,
无糖醛酸斑点 , 表明它由单一葡萄糖组成.酸水解物经硼氢化钠还原后制成全乙酰化衍生物进行 GC
分析 , 表明只有全乙酰化葡萄糖醇一个峰 , 证实该多糖只含葡萄糖 , 与纤维素板层析结果一致.
1089　No.6 　 石　磊等:柘树根多糖的分离纯化及结构表征
IR谱结果表明 , CPS-0具有多糖的特征吸收峰.3315.53 cm-1处的强吸收峰是 O—H键的伸缩振
动吸收 , 2921.22 cm-1是 C—H键的伸缩振动吸收 , 1400 ～ 1200 cm-1是 C—H键的变角振动吸收.
1636cm-1是结合水的吸收 [ 14] , 1200 ～ 1000 cm-1是 C—O键的变角振动吸收.931.76 cm-1是吡喃糖环
的非对称伸缩振动吸收 , 851.70 cm-1是吡喃糖分子中 α-端基差向异构的 C—H键的变角振动吸收 , 这
是 α-葡聚糖的特征吸收峰 [ 14] .该多糖与碘试剂反应不呈蓝色 , 说明其结构不同于直链淀粉.
完全甲基化的 CPS-0, 用体积分数为 90%的甲酸于 100 ℃水解 4 h.减压蒸干溶剂后 , 再用
2 mol/L三氟乙酸于 100 ℃水解 6 h.经硼氢化钠还原 、乙酰化后转变为部分甲基化的糖醇乙酸酯.
GC-MS分析结果见表 2.该多糖含有非还原末端 、 1, 4-及 1, 4, 6-连接的葡萄糖 3种连接方式 , 其比例为
1∶8∶1.非还原末端及 1, 4, 6-连接葡萄糖的存在说明该多糖具有分支 , 根据甲基化后各残基的摩尔比 ,
可以确定 CPS-0的主链由 1, 4-连接的葡萄糖组成 , 每 10个单糖残基组成的重复单元中含有一个分支 ,
平均单位链长度约为 10.侧链由 1 , 4-连接的葡萄糖残基构成 , 取代于 1, 4-连接的葡萄糖残基的 O6上.
Table2　MethylationanalysisofpolysaccharideCPS-0
Methylatedsugar Molarratio MSdataofmainfragments, m/z　　　　 Linkagetype
　 2, 3, 4, 6-Tetra-O-Me-Glc 1.0 43, 45, 71, 87, 101, 117, 129, 145, 161, 205 Glc(1※
　 2, 3, 6-Tri-O-Me-Glc 8.0 43, 45, 87, 99, 101, 117, 161, 233 ※ 4)Glc(1※
　 2, 3-Di-O-Me-Glc 1.0 43, 85, 99, 101, 117, 127, 159, 161, 201, 261 ※ 4, 6)Glc(1※
　　在 CPS-0的 13CNMR谱中 , 异头碳区域显示 2个峰 δ102.09和 δ101.12.δ102.09归属于含量较
高的 1, 4-连接葡萄糖残基的异头碳 , 而 δ101.12源自于 1, 4, 6-连接的葡萄糖.α-D-葡聚糖的异头碳
δ<103[ 16] , β-D-葡聚糖的异头碳 δ>103.由于 CPS-0的异头碳 δ<103, 因此可以确定该多糖中的糖残
　　　 Table3　13CNMRsignalassignmentsfor
polysaccharideCPS-0
Residue C1 C2 C3 C4 C5 C6
1-Glc 102.09 74.23 75.38 71.82 73.68 62.96
1, 4-Glc 102.09 74.23 75.38 79.20 72.87 62.96
1, 4, 6-Glc 101.12 74.04 75.38 79.20 72.87
基均呈 α异头构型.这与 IR谱得出的结论一致.
DEPT谱中 δ62.96处有倒峰 , 为非还原末端和
1, 4-连接糖环中 C6的信号.由于 1, 4, 6-连接的葡萄
糖残基摩尔数在所有糖残基中只有 1/10, 这可能是
未检出其 C6信号 (约在 δ68的倒峰)的原因.
δ78 ～ 79归属于发生取代的 C4, 进一步证明了甲
基化分析结果.参考文献 [ 17]方法对其它信号进行归属(表 3).
在 HMQC谱(图 1)中 , δH 5.46与 δC 102.09有相关 , 而 δH 5.04与 δC 101.12相关 , 这说明 δC
102.09应归属于 1, 4-连接葡萄糖的 C1 , 而 δC 101.12则来自于 1 , 4, 6-连接的葡萄糖.
Fig.1　HMQCspectrumofpolysaccharideCPS-0
在 CPS-0的 1HNMR谱中 , δ5.46和 δ5.04表
明糖残基应是 α异头构型 , 前者较强 , 应是 1, 4-连
接葡萄糖的异头氢 , 而后者应是 1, 4, 6-连接葡萄糖
的异头氢.这进一步支持上述结论.
从植物中获得以 1, 4-连接为主链的葡聚糖 , 主
要是淀粉类以 1, 4-连接为主链的 α-D-葡聚糖.根据
分支情况分为直链和支链淀粉 , 前者与碘反应呈强
蓝色 , 后者呈紫色.CPS-0与碘反应呈淡红色 , 不
同于通常的直链或支链淀粉 , 它类似于高分支的支
链淀粉类 , 其平均链长为 10.通常淀粉的平均链长在 36以上时才呈蓝色碘反应[ 18] , 本文多糖中由于
支链较多 , 影响到与碘结合所需的螺旋结构的形成 , 因此与碘反应不呈蓝色 , 强度也较弱.
综合分析表明 , CPS-0应为 α构型的葡聚糖 , 其主链由 1, 4-连接的葡聚糖组成 , 分支点位于 6位 ,
侧链内部由 1, 4-连接的葡萄糖残基组成 , 通过 1※6糖苷键取代于分支点的 O6上 , 结构式推测为
　　
　　　α-D-Glcp-(1[ 4)-α-D-Glcp-(1] x
6
— {[ ※4)-α-D-Glcp-(1] y※4-α-D-Glcp-(1※}n—
　　x+y=8
1090 高 等 学 校 化 学 学 报 　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.28　
参　考　文　献
[ 1 ] 　XIONGWen-Yu(熊文愈), WANGJi-Zhu(汪计珠), SHITong-Dai(石同岱), etal..WoodyMedicinePlantsofChina(中国木本药用
植物)[ M] , Shanghai:ShanghaiScienceandEducationPress, 1993:85— 88
[ 2 ] 　CHENGJian-Hua(程剑华), LIYi-Bin(李以镔).AnticancerPlantMedicinesandRecipes(抗癌植物药及其验方)[ M] , Nanchang:
JiangxiScienceandTechnologyPres, 1998:62— 64
[ 3 ] 　XUEFang(薛芳), XUZhan-Min(许占民).TheColectedEditionofChineseMedicines(CTMVolume), 2ndEdition[中国药物大全
(中药卷), 第 2版 ] [ M] , Beijing:PeopleHealthPress, 1998:50— 54
[ 4 ] 　LeeI.K., KimC.J., SongK.S., etal..Phytochem.[J] , 1996, 41(1):213— 216
[ 5 ] 　LeeI.K., KimC.J., SongK.S., etal..J.Nat.Prod.[J] , 1995, 58(10):1614— 1617
[ 6 ] 　MIAOChun-Hui(缪春辉), GUZheng-Bing(顾正兵), YANGGen-Jin(杨根金).ChineseTraditionalPatentMedicine(中成药)[ J] ,
2002, 24(3):211— 212
[ 7 ] 　HanoY., MatsumotoY., ShimnoharaK., etal..PlantaMedicine[ J] , 1991, 57:173— 175
[ 8 ] 　SeoW.G., PaeH.O., OhG.S., etal..GeneralPharmacology[ J] , 2001, 35(1):21— 28
[ 9 ] 　SeoW.G., PaeH.O., OhG.S., etal..Am.J.ChineseMedicines[ J] , 2001, 29(2):313— 320
[ 10] 　SONGNai-Bao(宋耐宝), YANGXue-Dong(杨学东), WANGYi-Ming(王义明), etal..ChineseTraditionalPatentMedicine(中成
药)[ J] , 2005, 27(3):335— 337
[ 11] 　DONGGuo-Xia(董国霞), CHENKao-Shan(陈靠山), SHILei(石磊), etal..CurentImmunology(现代免疫学)[ J] , 2005,
25(3):247— 248
[ 12] 　HAOLin-Hua(郝林华), CHENLei(陈磊), ZHONGNa(仲娜), etal..Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)[ J] ,
2005, 26(7):1242— 1247
[ 13] 　DONGQun(董群), ZHANGZhi-Yi(张志毅), LINYing(林颖), etal..ActaBiochimicaetBiophysicaSinica(生物化学与生物物理
学报)[ J] , 1995, 27(3):261— 265
[ 14] 　ZHANGWei-Jie(张惟杰).BiochemistryResearchandTechnologyofGlycoconjugates, 2ndEdition(糖复合物生化研究技术 , 第 2版)
[M] , Hangzhou:ZhejiangUniversityPress, 1999:196— 197
[ 15] 　NeedsP.W., SelvendranR.R..Carbohydr.Res.[ J] , 1993, 245:1— 10
[ 16] 　GorinP.A.J..Adv.Carbodydr.Chem.Biochem.[ J] , 1981, 38:13— 39
[ 17] 　WangXue-song, DongQun, ZuoJian-ping, etal..Carbohydr.Res.[ J] , 2003, 338:2393— 2402
[ 18] 　WANGJing-Yan(王镜岩), ZHUSheng-Geng(朱圣庚), XUChang-Fa(徐长法).Biochemistry, 3rdEdition(生物化学 , 第 3版)
[M] , Beijing:HigherEducationPress, 2002:42— 43
Separation, PurificationandStructureCharacterizationofPolysaccharide
fromRootsofCudraniatricuspidata(Carr.)Bur.
SHILei1, 2 , CHENKao-Shan1 , DONGQun2 , FANGJi-Nian2 , DINGKan2＊
(1.SchoolofLifeScience, ShandongUniversity, Jinan250100, China;
2.ShanghaiInstituteofMateriaMedica, ChineseAcademyofSciences, Shanghai201203, China)
Abstract　Awater-solublepolysaccharide(CPS-0)wasobtainedfromtherootofCudraniatricuspidata
(Car.)Bur., byhotwaterextraction(70℃), deproteinationwithenzymolysisandSevagmethod, precipita-
tionwithethanol, andfractionationthroughDEAE-SephadexA-50 chromatography.ThepurityofCPS-0 was
determinedviaHPLCandthestructurewascharacterizedwithmonosaccharidecompositionanalysis, methyla-
tionanalysis, GC, GC-MS, NMRspectra(1HNMR, 13CNMR, HMQC), UV, IR, andelementalanalysis.
TheCPS-0 wasfoundtocontainglucoseresiduesolely, withanaveragerepeatingunitofdecasaccharide, ha-
vingabackboneconsistingof1, 4-linkedα-D-glucopyranosylresidues, towhichthesidechainconsistingof
terminaland1, 4-linkedα-D-glucopyranosylresidueswasatachedatposition6 ofthebranchingresidues.
Keywords　RootofCudraniatricuspidata(Carr.)Bur.;Polysaccharide;Separationandpurification;Struc-
turecharacterization (Ed.:H, J, Z)
1091　No.6 　 石　磊等:柘树根多糖的分离纯化及结构表征