全 文 ：2009年
第 3期 　　　　　　
青海师范大学学报(自然科学版)
Journal o f Qinghai No rmal Unive rsity(Natural Science)　　　　　　
2009
No.3
唐古特大黄细胞悬浮培养中的生理生化特性
舒孝和 ,陈　志
(青海师范大学生命与地理科学学院 ,青海西宁　810008)
摘　要:目的 初步研究液体培养条件下唐古特大黄(R heum tangu ticum M axim .ex Bal f.)细胞的生理生化特性.方法　以唐
古特大黄子叶为材料 ,诱导和筛选愈伤组织 ,进行细胞悬浮培养.测定了细胞悬浮培养过程中的细胞生长 、pH 值和总蒽醌累
积的动态变化 ,并研究了水杨酸(SA)对细胞生长和总蒽醌累积的影响.结果 培养细胞生长周期 36d;细胞的增殖曲线呈“ S”
形;其培养液 pH 值先下降后回升;细胞中总蒽醌累积规律也呈“ S”形曲线 ,在培养的第 30天 ,细胞中总蒽醌可达到最大值.
SA 对细胞的生长和总蒽醌累积有影响 , 0.1mg/ L和 1.0mg/ L SA 促进细胞的生长和总蒽醌的积累.结论　细胞悬浮培养过
程中的总蒽醌累积和细胞生长呈正相关性.
关键词:唐古特大黄;细胞悬浮培养;细胞生长
中图分类号:O157.5　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-7542(2009)03-0084-05
唐古特大黄(Rheum tang ut icum Maxim.ex Balf.)为多年生草本植物 ,主要分布在青藏高原海拔
1700-4200m 的高山地区 ,为重要的中藏医药用植物.近年来 ,由于过度采挖 ,唐古特大黄野生资源急
剧减少.开展旨在提高药用有效成分的细胞培养及次生代谢调控工作是一项很有应用前景的探索性研
究工作 ,甚至可以认为这是解决各种濒于灭绝的珍稀名贵药用植物药材资源的主要途径.植物细胞悬浮
培养是进行植物细胞大规模培养以实现次级代谢产物的工业化生产一个重要环节 ,是顺利过度到工业
化生产的关键.本文通过对唐古特大黄的组织细胞培养 ,筛选出了适合细胞悬浮培养的最佳条件 ,建立
了悬浮细胞系 ,在此基础上对其细胞悬浮培养中的生理生化特性进行了进一步研究 ,以期为唐古特大黄
细胞大规模培养而实现有效成分的工业化生产提供一定的实验依据.
1　材料和方法
1.1　供试材料　用唐古特大黄子叶为外植体 ,接种在 MS +2 , 4-D2.0 mg/ L +6-BA1.0 mg/L +
NAA 2.0 mg/L+30g/L 蔗糖培养基上诱导出愈伤组织 ,然后在 MS +2 , 4-D1.0 mg/L +6-BA1.5
mg/L +NAA 2.5 mg/ L+30g/L 蔗糖培养基上继代培养 ,经 6-7次继代后 ,选择生长均一 、质地疏松 、
分散性好的愈伤组织作为悬浮培养的种子材料.
1.2　唐古特大黄细胞悬浮培养及生理生化指标的测定
选择经多次继代培养获得的生长均一 、质地疏松 、分散性好的愈伤组织转入液体培养基中培养 ,每
100m1三角瓶中分装 40m1液体培养基.液体培养基为:MS+2 , 4-D1.0 mg/L +6-BA 1.5 mg/L +
NAA 2.5 mg/ L+40g/L 蔗糖 ,灭菌前调 pH 为 5.8 ,接种量约为 1g/40ml鲜重 ,悬浮培养采用旋转式摇
床 ,转速为 120r/min ,置于自然弱光照条件下培养 ,培养温度为 25士 1℃.
悬浮培养过程中生长曲线的测定:在上述的培养条件下 ,连续培养 36d ,每 3d取一次样 ,测定鲜重
及干重 ,3 次重复 ,实验结果取平均值.悬浮培养过程中 pH 的变化:在上述的培养条件下 ,连续培养
36d ,每 3天取样一次 ,测定培养基的 pH.实验每处理三次重复 ,实验结果取平均值.
悬浮培养过程中总蒽醌含量的变化:在上述的培养条件下 ,连续培养 36d ,每 3天取样一次 ,测定总
蒽醌含量.实验每处理三次重复 ,实验结果取平均值.
收稿日期:2009-03-20
作者简介:舒孝和(1974-),男(瑶族),湖南怀化人,植物学专业 ,生物化学方向 ,从事药用植物组织与细胞培养的研究工作.
DOI :10.16229/j.cnki.issn1001-7542.2009.03.013
第 3期 舒孝和 ,陈　志:唐古特大黄细胞悬浮培养中的生理生化特性
诱导子水杨酸(SA)对悬浮细胞生长及总蒽醌累积的影响:取生长初始期的悬浮细胞 1g 鲜重 ,接种到新
鲜的液体培养基中 , SA 经过滤灭菌后 ,添加到细胞悬浮培养液中 ,使其最终浓度分别为 0.1 , 1.0和
5.0mg/ L ,不加的为对照组 ,培养条件同上.培养 10d后收获并取样分析 ,分别测定鲜重 、干重 、培养细胞
中总蒽醌含量.
2　分析方法
2.1　悬浮培养中细胞鲜重和干重的测定
培养液经布式漏斗真空抽滤 ,得到的细胞用多倍体积蒸馏水充分洗涤 ,再次抽滤后用电子分析天平
称取细胞鲜重(FCW),然后将所得细胞置于 60℃烘箱中干燥至恒重(约 24 h),用电子分析天平称重得
到细胞干重(DCW).重复三次实验 ,实验结果取平均值.
细胞鲜(干)重增长量=收获细胞鲜(干)重量/瓶-接种细胞鲜(干)重量/瓶
细胞鲜(干)重增长率=细胞鲜(干)重增长量/接种细胞鲜(干)重量×100%
2.2　悬浮培养液中 pH 值的测定　取样使用梅特勒 DELTA -320型 pH 计测定 pH 值.
2.3　唐古特大黄悬浮细胞总蒽醌含量测定[ 1]
对照品溶液制备:准确称取 60℃烘至恒重的 1 , 8-二羟基蒽醌标准品 5.0 mg ,用甲醇溶解后转移
至 50 mL 的容量瓶中 ,定容 ,摇匀 ,即得浓度为 100ug/mL 的对照品溶液.
样品溶液制备:将烘干的细胞研磨成粉末 ,精确称取 200mg 细胞样品于具塞三角瓶中 ,加入 40 mL
甲醇 ,浸泡 24 h 后 ,再超声 30 min ,过滤 ,滤液转移至 50 mL 容量瓶中 ,用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即为
供试品溶液.
测定波长的选择:精确吸取 1.0 mL 标准溶液 ,置于 50 mL 容量瓶中 ,水浴挥去甲醇 ,加 1%醋酸镁
甲醇溶液定容 ,以溶剂为空白调零 ,在 400-600 nm 波长范围内扫描 ,结果在 510 nm 处有最大吸收峰 ,
故选定 510 nm为测定波长.
线性关系考察:精确吸取对照品溶液 0 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 ,5.0mL 于 25 mL 容量瓶中 ,水浴挥干甲
醇后 ,加 1%醋酸镁甲醇溶液显色并定容 ,避光放置 30 min后 ,于 510nm 波长处测定吸光度 ,上述数据
经回归处理 ,得回归方程:Y =0.0412X+0.0016 , r=0.9998 , X为吸光度 , Y为总蒽醌浓度.
总蒽醌含量测定:取供试品溶液 2.0 mL 各 3份于 20 mL 左右的具塞试管中 ,水浴挥去甲醇 ,加 2
mL 蒸馏水超声混匀后 ,加 40% FeCI3溶液 1.0 mL ,置沸水浴 30 min ,再加 HCl 1.0 mL ,沸水浴 30
min ,转移至分液漏斗中 ,另加 4 mL 蒸馏水洗涤试管 ,洗涤液合并至分液漏斗中.加 25 mL 乙醚一次萃
取 ,另用 30 mL 蒸馏水分三次洗乙醚萃取液 ,收集乙醚萃取液 ,水浴挥去乙醚 ,残渣加入 1%醋酸镁甲醇
溶液 ,并定容于 25mL 容量瓶中 ,摇匀 ,避光放置 30 min后 ,于 510 nm 波长处测定吸光度.测定结果代
入回归方程并计算平均百分含量.
3　结果与分析
3.1　唐古特大黄悬浮培养细胞的生长周期
在唐古特大黄细胞悬浮培养的过程中 ,置于自然弱光照条件下培养 ,以细胞干重(g)和细胞鲜重
(g)为生长指标 ,可以看到两种不同生长指标的生长曲线基本一致 ,都呈“S”型 ,并明显的分为四个时
期:延迟期 、对数生长期 、稳定期和衰亡期.如图 1.
从图 1还可以看出 , 0 ～ 6d 为延迟期 ,在延迟期培养物增重缓慢 ,这可能是由于细胞对环境的适应
需要一个过程 ,不能很好的吸收营养物质.6d后进入对数生长期 ,在对数生长期(6 ～ 24d)细胞分裂活
跃 ,培养物增重迅速 ,而到稳定期(24 ～ 30d )鲜重的增加几乎停止 ,在 30d 时细胞生物量达到最大值.
30d后进入衰亡期 ,生物量有下降趋势.这是由于培养基中养分耗尽 ,或者是有害物质的积累所造成的.
根据唐古特大黄细胞生长曲线及细胞培养过程中的培养反应情况 ,确定唐古特大黄细胞最佳的继代周
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图 1　唐古特大黄细胞生长曲线
期为 30d左右.
3.2　唐古特大黄细胞悬浮培养过程中 pH 的变化
培养基的 pH 对植物细胞的生长有重要的作用 ,其表现是多方面的 ,如影响植物细胞的分裂和分
化;影响植物细胞的呼吸和代谢 ,DNA合成和核心组蛋白复合体的合成;影响细胞膜的质膜电位和质膜
透性;影响植物细激素进出细胞作用等[ 2] .
通常配制培养基时 ,灭菌前将 pH 调为 5.8左右 ,但经过高压灭菌后 pH 下降 0.1-0.2 ,有的下降
0.3-0.4 ,也有下降 0.7-0.8[ 3] .实验采用 MS基本培养基 ,灭菌前调节 pH 为 5.8;经高压灭菌后 ,pH
变为 5.5 ,下降 0.3个单位.悬浮培养中 pH 的变化如图 2所示.
图 2　悬浮培养过程中 pH 值的变化
从图 2可看出 ,在整个实验过程中培养基的PH 值呈先降低后升高的变化趋势.在培养的前3d ,pH
由 5.1下降到 4.58 ,随后培养液的 pH 开始缓慢下降 ,到培养的第30d pH 达到 4.28 ,之后逐渐升高 ,培
养结束后 ,pH 稳定在 4.36.培养基 pH 的变化与细胞生长周期有一定的相关性 ,如喜树细胞 、南方红豆
杉等细胞的悬浮培养与 pH 的变化都表现出类似的特性.培养过程中 pH 表现出的变化情况 ,与细胞吸
收和利用培养中的铵盐和氮盐有关[ 4] .
3.3　悬浮培养过程中总蒽醌含量的变化规律
唐古特大黄悬浮培养细胞的总蒽醌产生与细胞的生长周期密切相关 ,即细胞总蒽醌含量的积累随
着细胞干重的积累而增加 ,随细胞干重的下降而下降 ,呈现相似的曲线.至培养第 30d时为最高产量 ,达
0.54mg/gDCW.因此唐古特大黄培养细胞的最佳收获期为 30d左右.
3.4　诱导子水杨酸(SA)对悬浮细胞生长及总蒽醌累积的影响
水杨酸(salicylic acid ,简称 SA)是存在于植物体内的重要的酚类物质 ,与植物抗病性密切相关.它
作为一种重要的细胞信使与植物抗毒素 ,可以诱导呼吸方式从细胞色素呼吸途径到交替呼吸途径的转
变 ,为植物病理反应提供物质 、能量以及信号传导的基础[ 5] .
从图 4和图 5可知 ,在 SA 的浓度为 0.1 mg/L 和 1.0 mg/L 时 ,细胞鲜重增长率 、细胞干重增长率
和总蒽醌含量都增加 ,其中SA 的浓度为 0.1 mg/L 时增加最多.与对照组(SA的浓度为0 mg/L)比较 ,
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图 3　悬浮培养过程中总蒽醌含量的变化
Fig.3　The changes of anthraquinones content during cell suspension cu lture
在 0.1 、1.0两个 SA 浓度下 ,细胞鲜重增长率分别提高了 32.9%、26.4%;细胞干重增长率分别提高了
41.4%、37.0%;总蒽醌含量分别提高了 26.3%、15.8% .在 SA 的浓度为 5.0 mg/L 时 ,细胞鲜重增长
率 、细胞干重增长率和总蒽醌含量都低于对照组.由此表明诱导子水杨酸(SA)对唐古特大黄悬浮细胞
生长及总蒽醌累积有一定的影响 ,且与 SA 的浓度有关.
图 4　SA 对悬浮细胞生长的影响
Fig.4　Ef fect s of SA on the grow th of su spension cell
图 5　SA 对悬浮细胞总蒽醌累积的影响
Fig.5　Effect s of SA on the anthraquinones accumulat ion in suspension cell
4　讨论
在适宜条件下 ,利用诱导子来调节药用植物的次生代谢途径 ,而提高植物细胞中有用的次生代谢产
物的含量 ,带来了良好的经济和社会效益.如丹参酮 、银杏酮 、黄酮 、紫杉醇等.目前利用诱导子来促进植
物次生代谢产物生产的研究已取得了一些进展 ,在诱导子机制的推测上 ,一致认为诱导子作为一种外界
信号被植物细胞膜上的受体所识别 ,并与之结合 ,从而引起细胞膜上及细胞内一系列反应 ,使与植保素
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有关的酶合成或活性发生变化 ,从而引起植物基因表达发生变化 ,最终导致植保素的合成和积累[ 6] .
目前对诱导子的研究虽取得了一些进展 ,但还存在着一些不完善的地方 ,在诱导子作用机制以及作
用靶点方面 ,还研究得不透彻.如果知道诱导子与次生代谢产物的结构与功能关系 ,就可用现代分子生
物学技术如差别显示和异源表达等技术来研究诱导子作用于靶基因的调控机制以及对该基因进行功能
鉴定 ,从分子水平来阐明次生代谢产物的合成机制 ,为今后诱导培养提供更可靠的理论依据.此外 ,在诱
导子的纯化和结构分析 、诱导子受体的提取纯化 ,诱导子与胞膜上受体的结合情况等方面有待进一步研
究[ 7] .
参考文献:
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Physiological and Biochemical Characters on the Cell Suspension
Culture of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.
SHU X iao-he , CHE-Zhi
(Key Labo rato ry of Ministry of Education , College of Life and Geography Science ,
Qinghai Normal University , Xining 810008 , China)
Abstract:Object ive To primari ly study the phy siological and biochemical characters of Rheum tan-
g ut icum Maxim.ex Balf.suspension culture.Methods With the co ty ledon of Rheum tangut icum Max-
im .ex Balf.callus w as induced and screened , then established the suspension culture , the dynamic
changes of cell g row th , pH and anthraquinones accumulation w ere moni to red.The effects of salicy lic
acid(SA)on cel l g row th and anthraquinones accumulation w ere studied.Result The cel l grow th curve
w as like “S” , but the g row th circle w as about 36 day s;the pH of cultured mediums went dow n at
first , then w ent up gradually;the anthraquinones accumulation curve in suspension cell o f Rheum tan-
g ut icum Maxim.ex Balf.was also like“S”;the anthraquinones content in suspension cell w as highest
w hen suspension cell we re cultured in the 30th day.The SA had some ef fects on the cell g row th and
anthraquinone s accumulation in suspension cel l of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf., 0.1mg/L of
SA and 1mg/L of SA could promo te the g row th of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.cell and the an-
thraquinones accumulation.Conclusion There w as a plus relativi ty betw een cell g row th and anthraqui-
nones accumulation.
Key words:Rheum tangut icum Maxim .ex Balf.;cel l suspension cul ture;cel l g row th
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