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Effect of polygonatum sibiricum polysaccharides on preventing from the suppression and
apoptosis of bone marrow stromal cells induced by vincristine
Hu Weixu1，Wen Zhu2，Rong Jiping2，Yu Huo2，Hu Guozhu3
(1 Fudan University Shanghai Cancer Center，Shanghai 200032;2 Department of Hematology，Jiangxi Institute of Medical Science，
Nanchang 330006;3 The Clinical Medical Institute of Jiangxi province people＇s hospital，Nanchang 330006)
Objective:To investigate the effect of PSP (polygonatum sibiricum polysaccharides)on preventing from the suppression and apoptosis
of mice bone marrow stromal cells(BMSCs)induced by VCR (Vincristine)． Methods:The BMSCs were cultured with PSP (500，1000，
2000，4000mg /L)or VCR (2． 5，5，10，15 mg /L )for 14 days，respectively and the BMSCs proliferation was determined by MTT． The
BMSCs were pretreated with PSP (500，1000，2000，4000mg /L)for 2 hour，then cultured with VCR(5 mg /L)for 14 days，and the BMSCs
proliferation was determined by MTT． After the BMSCs were cultured for 14 days，then VCR (2． 5，5，10，15 mg /L)was added to culture
for 24 hours，respectively，and cell apoptosis was determined by FACS with Annexin V /PI． The BMSCs were cultured with PSP (500，1000，
2000，4000mg /L)for 14 days，then VCR(5 mg /L)was added to culture for 24 hours，respectively，and cell apoptosis was determined by
Hoechst 33342 fluorescent staining and FACS with Annexin V /PI． Results:After the BMSCs were cultured with PSP (1000，2000，4000mg /
L)for 14 days，the OD value of BMSCs were 3． 80，4． 48，4． 05，and it was significantly higher in the PSP(2000mg /L)than in the normal
control group(3． 70) (P ＜ 0． 05)． In the VCR groups(5，10，15mg /L)the BMSCs grew slower along with VCR concentration increasing，and
the OD value was significantly lower in the VCR groups (2． 36，1． 83，1． 67)than in the normal control group(3． 70)in 14th day(P ＜ 0． 05)．
After the BMSCs were pretreated with PSP for 2 hours，then cultured with VCR(5． 0mg /L)for14days，the OD value of BMSCs was signifi-
cantly higher in the PSP(2000mg /L) (3． 51)than in the VCR group(5mg /L) (2． 62) (P ＜ 0． 05)． After the BMSCs were cultured for 14
days，VCR(5，10 or 15 mg /L)was added to culture and continued to be cultured for 24 hours，the apoptosis rates of BMSCs were signifi-
cantly higher in the VCR groups (31． 12%，39． 37%，64． 10%)than in the normal control group(7． 70%) (P ＜ 0． 05)by FACS with An-
nexin V /PI． After the PSP(1000，2000，4000mg /L)culturing with BMSCs for 14 days，VCR(5 mg /L)was added to culture to continue
culture for 24 hours，then apoptosis rates of BMSCs were significantly lower in the PSP groups(27． 77%，24． 33%，25． 20%)than in the
only VCR(5 mg /L)group(35． 93%) (P ＜ 0． 05)by FACS with Annexin V /PI，and in the PSP groups(2000mg /L，29． 0%;4000mg /L，
29． 67%)than in the only VCR(5 mg /L)group(40． 33%) (P ＜ 0． 05)by Hoechst 33342 fluorescent staining． Conclusion:The results
suggest that polygonatum sibiricum polysaccharides can promote BMSCs proliferation and prevent from proliferation inhibition and apoptosis of
BMSCs induced by vincristine．
Key words Polygonatum sibiricum polysaccharides(黄精多糖) ;vincristine;bone marrow stromal cells;proliferation;apoptosis
广东产大叶桉叶挥发油的化学成分和遗传毒理学研究
*
兰美兵，李啸红，余永莉＊＊，王传铜，冯国纹，唐于川，赵晟珣，王 霞
(遵义医学院珠海校区，珠海 519041)
摘 要 目的:分析广东产大叶桉叶挥发油的主要化学成分，探讨其对小鼠的遗传毒性。方法:用气相色谱-质谱法分析大叶
28 中药药理与临床 2012;28(6)
* 贵州省科学技术基金资助项目(黔科合 J字［2008］2193) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2012.06.029
桉挥发油的化学成分，用归一化法测定各组分的相对百分含量;采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠胚胎肝转移微核试验、
小鼠精子畸形试验。结果:分离出 19 个峰，并全部鉴定，广东产大叶桉叶挥发油主要成分为 1，8-桉油素(84． 15%)、γ-松油烯(4．
82%)、对伞花烃(3． 49%)、α-蒎烯(3． 19%)等;桉叶油灌胃剂量 400，200，100 mg /kg 时，诱发的骨髓微核率、胚胎肝微核率、精子畸
形率与阴性对照组相比，均无显著性差异。结论:本实验条件下桉叶油对小鼠无遗传毒性。
关键词 桉叶油;气相色谱-质谱;微核试验;遗传毒性
大叶桉叶是大叶桉(Eucalyptus Robusta )的叶，其水煎剂具
有疏风发表、清热解毒、祛痰止咳、杀虫止痒之功效，是华南地区
民间常用中草药［1］。桉叶油是从桉叶中提取出来的挥发油，居
十大精油之首，广泛应用于医药、化工、食品等领域，具有较高的
应用价值。华南产大叶桉叶油的化学成分虽有报道［2 ～ 5］，但是
均为实验室自行提取，工业化生产之后的成分分析未见报道。
本文将桉叶油的成分分析与遗传毒性研究结合起来，为其作为
食品添加剂、香料利用，以及药品开发提供一些遗传毒性方面
的实验依据。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 桉叶油:购自珠海德信行，采用水蒸气蒸馏提
取，纯度 99． 5%，产地:广东，批号:H071126。环磷酰胺:山西普
德药业有限公司生产，批号:08061521。花生油:金龙鱼食用油
有限公司生产，市售。
1． 2 动物 昆明种小鼠，普通级，购自广东省医学实验动物中
心，合格证号:SCXK(粤)2007-0002。
1． 3 仪器 HP6890 /5975C气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦
公司) ，色谱柱为 HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane (30 m × 0．
25 mm ×0． 25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温 4 ℃(保留 2 min) ，
以 3． 5 ℃ /min升温至 200 ℃，保持 2 min，汽化室温度 250 ℃，载
气为高纯 He(99． 999%) ，柱前压 7． 62 psi，载气流量 1． 0 ml /
min，进样量 1 μl，分流比 20:1。离子源为 EI 源，离子源温度
230 ℃，四极杆温度 150 ℃，电子能量 70 eV，发射电流 34． 6 μA，
倍增器电压 1037 V，接口温度 280 ℃，扫描范围 20 ～ 550 amu。
Olympus CX-41 型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。
1． 4 方法
1． 4． 1 分析方法 桉叶油 1 μl，用气相色谱-质谱联用仪分
析，通过 HPMSD化学工作站检索 Nist 库和 WILLEY 库进行图
谱解析。
1． 4． 2 小鼠骨髓微核试验和胚胎肝转移微核试验 25 只孕鼠
随机分为 5 组，每组 5 只。受试药物分为桉叶油 400，200，100
mg /kg 3 个剂量组，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CP)40 mg /
kg，阴性对照组灌胃花生油 0． 4 ml /只。受试药物组及阴性对照
组小鼠于其孕 12 d开始灌胃，每天 1 次，连续 5 d。阳性对照组
于处死前 1 d开始腹腔注射 CP，连续 2 d。各组孕鼠于孕 16 d
用药 2 h后脱颈椎处死，打开孕鼠腹腔，记录活胎、死胎与吸收
胎情况。每只孕鼠取其两侧股骨骨髓和 2 只胚胎的肝脏，按照
李啸红等［6］实验方法制片。细胞涂片置显微镜油镜下观察，每
只胚胎鼠肝涂片计数 1 000 个嗜多染红细胞，每只成年鼠骨髓
涂片计数 1 000 个骨髓嗜多染红细胞，微核率以含微核的嗜多
染红细胞数的千分率计。
1． 4． 3 小鼠精子畸形试验 30 只雄性小鼠随机分为 5 组，每
组 6 只。各组用药剂量同微核试验。受试药物组及阴性对照组
小鼠每天灌胃给药 1 次，阳性对照组每天腹腔注射 CP 1 次，均
连续 5 d。各组小鼠于第 1 次给药后 35 d，脱颈椎处死，取出其
双侧附睾放入盛有生理盐水的离心管中，按胡怡秀等［7］方法制
片、镜检。每只小鼠观察 1 000 个精子，记录畸形(折尾、镰刀
形、双尾、胖头、无钩、无定形等)数目并 统计畸形率(‰)。
2 结果
2． 1 化学成分 广东产大叶桉叶挥发油分离出 19 个峰，并
全部鉴定出 19 个化合物，主要成分为 1，8-桉油素(84． 15%)、γ-
松油烯(4． 82%)、对伞花烃(3． 49%)、α-蒎烯(3． 19%)等，具体
分析结果见表 1。
表 1 桉叶油的化学成分分析结果
序号
相对保留
时 间
化合物
相对含量
(%)
序号
相对保留
时 间
化合物
相对含量
(%)
1 8． 64 α-蒎烯 3． 19 11 13． 59 γ-松油烯 4． 82
2 9． 18 莰烯 0． 02 12 14． 17 (Z)-氧化芳樟醇 0． 06
3 10． 24 β-蒎烯 0． 48 13 14． 79 γ-萜品油烯 0． 33
4 10． 89 冬青油烯 0． 79 14 15． 34 L-芳樟醇 0． 23
5 11． 36 α-水芹烯 0． 80 15 15． 84 葑醇 0． 05
6 11． 86 α-松油烯 0． 16 16 16． 51 别罗勒烯 0． 04
7 12． 22 对伞花烃 3． 49 17 16． 85 (E)-松香芹醇 0． 12
8 12． 51 1，8-桉油素 84． 15 18 18． 44 松油烯-4-醇 0． 38
9 12． 79 (E)-β-罗勒烯 0． 21 19 19． 01 α-松油醇 0． 62
10 13． 20 (Z)-罗勒烯 0． 07
2． 2 小鼠骨髓微核试验和胚胎肝转移微核试验 表 2 结果显
示，桉叶油各剂量组诱发的骨髓与胚胎肝微核率与阴性对照组
比较，均无显著性差异。阴性对照组和桉叶油各剂量组诱发的
骨髓与胚胎肝微核率明显低于阳性对照组，且差异有统计学意
义(P ＜ 0． 05) ，提示用环磷酰胺诱发了小鼠骨髓微核和胚胎肝
嗜多染红细胞出现较多的微核，阳性对照组造模成功。
表 2 桉叶油对孕鼠骨髓和胚胎肝嗜多染红细胞微核率的影响(珋x
± s)(骨髓细胞 n = 5;胎肝细胞 n = 10)
组别
剂量
(mg /kg)
嗜多染
红细胞数
含微核
细胞数
微核率
(‰)
骨髓细胞 对照组 5 000 2 0． 4 ± 0． 8
环磷酰胺 40 5 000 67 13． 4 ± 2． 4*
桉叶油 400 5 000 11 2． 2 ± 2． 0
桉叶油 200 5 000 1 0． 2 ± 0． 4
桉叶油 100 5 000 2 0． 4 ± 0． 8
胎肝细胞 对照组 10 000 1 0． 10 ± 0． 3
环磷酰胺 40 10 000 102 10． 2 ± 2． 0*
桉叶油 400 10 000 10 1． 0 ± 2． 7
桉叶油 200 10 000 1 0． 10 ± 0． 3
桉叶油 100 10 000 1 0． 10 ± 0． 3
与对照组比较 * P ＜ 0． 05(下同)
2． 3 小鼠精子畸形试验 表 3 结果显示，桉叶油各剂量组诱
发的骨髓与胚胎肝微核率与阴性对照组比较，均无显著性差异。
阳性对照组发生畸变的精子数目较其它各组显著升高(P ＜ 0．
05) ，提示用环磷酰胺诱发了小鼠精子畸形率升高，阳性对照组
造模成功。
38中药药理与临床 2012;28(6)
表 3 桉叶油对小鼠精子畸形的影响(珋x ± s，n = 6)
组 别
剂量
(ml /kg)
精子数 畸变精子数
畸变率
(‰)
对照组 6 000 41 6． 8 ± 2． 8
环磷酰胺 40 6 000 402 67． 0 ± 26． 4*
桉叶油 400 6 000 22 3． 7 ± 1． 6
桉叶油 200 6 000 21 3． 5 ± 1． 5
桉叶油 100 6 000 39 6． 5 ± 2． 5
3 讨论
现代药理学研究表明，桉叶油具有抗菌［5，8］、消炎［9］、防腐、
杀虫驱蚊［10］及抗氧化等多种生物学效应［11，12］。化学成分是生
物学效应的基础，而不同的产地、品种以及提取方法等因素可
造成其成分差异较大，因此，分析天然产物的化学成分对该产
物的开发利用具有较高的价值。由成分分析结果可知，经工业
化生产的广东大叶桉叶油的成分多为萜类、萜醇类及其含氧衍
生物，其中具有抗菌、止咳作用的桉叶素含量最高(84． 15%) ，
已达到国家药典的要求。其次为 γ-松油烯(4． 82%) ，可用于香
精和食品添加剂。对伞花烃(3． 49%)具有显著的祛痰作用和
抗炎作用，是一种重要的有机合成中间体，有广泛的用途。α-蒎
烯(3． 19%)具有抗真菌作用，是合成香料的重要原料。
遗传毒性是指环境中的理化因素作用于有机体，使其遗传
物质在染色体水平、分子水平和碱基水平上受到各种损伤而诱
发突变，出现细胞衰老、肿瘤、出生缺陷(流产、死胎、先天性疾
病)等。遗传毒理学试验又称遗传学终点试验，是通过直接检
测遗传学终点或检测导致某一终点 DNA 损伤过程中的伴随现
象，从而确定理化因素产生遗传物质损伤并导致遗传性改变的
能力。美国环保局(USEPA)提出的常规遗传毒理学试验有微
核试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验、果蝇伴性隐性致死试
验等 10 种。微核试验是进行体内遗传毒性试验的经典和首选
方法，用来检测染色体断裂剂和非整倍体诱导剂对染色体的损
伤作用［13］。精子形态是评价化学物质对精子遗传物质产生不
良的潜在性影响的间接指标。精子的畸形率可评价受试药物
对精子生成、发育的影响，反映该药物对生殖细胞的遗传毒性
作用。微核试验和精子畸形试验都具有操作方便、经济实用和
快速等特点，是药物安全性评价的重要检测内容。
根据本实验的结果提示，本实验条件下桉叶油各剂量组对
孕鼠、胚胎鼠及成年雄鼠均未发现明显的遗传毒性。根据相关
剂量折算公式，小鼠 400mg /kg 的剂量约相当于人 48mg /kg 的
剂量，按美国香味料和萃取物质制造者协会(FEMA)的相关剂
量规定，正常范围内使用桉叶油是安全的。以往的研究主要在
药理学方面，对毒理学研究资料较少，主要是依据 FEMA 的
GRAS2466(兔的 LD50 ＞ 5g /kg) ，本课题组比较系统地研究了该
药的生殖毒理［14 ～ 16］，为我国桉叶油的应用与开发提供了较为
丰富的实验数据。
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Study on chemical constituents and genotoxicity of volatile oil in folium Eucalyptus Robusta from Guangdong
Lan Meibing，Li Xiaohong，Yu Yongli ，Wang Chuantong，Tang Yuchuan，Zhan Shengxun，Wang Xia
(Zunyi Medical College Zhuhai Campus，Zhuhai 519041)
Objective:To analyze the main chemical constituents of volatile oil in folium Eucalyptus Robusta from Guangdong，and explore its geno-
toxicity to mice． Methods:The chemical constituents of volatile oil in folium Eucalyptus Robusta were separated and identified by GC-MS，
the relative content of each component was determined by area normalization;Micronucleus test of adult mice bone marrow cells and fetal
48 中药药理与临床 2012;28(6)
mice hepatocytes，and sperm shape abnormality test were carried out． Results:Nineteen components were isolated and identified from volatile
oil． Compared with control group，the micronucleus rates of bone marrow and fetal hepatic cell and teratospermia number were no statistic
difference in any of the index． Conclusions:The main chemical components of volatile oil in folium Eucalyptus Robusta from Guangdong
were 1，8-cineole(84． 15%) ，γ-terpinene (4． 82%) ，camphor(6． 99% ) ，p-cymene (3． 49%) ，α-pinene (3． 19%) ，et al． Genotoxicity
of folium Eucalyptus Robusta was not verified in this research．
Key words Eucalyptus oil;GC /MS;micronucleus assay;genotoxicity
三味甘凉归肺经中药对肺阴虚模型大鼠 cAMP、cGMP的影响*
占阮娟1，陈素红2，吕圭源1＊＊，苏 洁1，牟秀华1
(1浙江中医药大学，杭州 310053;2温州医学院，温州 325035)
摘 要 目的:观察甘凉归肺经中药(南沙参、玉竹、麦冬)对肺阴虚模型大鼠 cAMP、cGMP等的影响，寻找性味归经相同中药
的共同作用规律。方法:采用灌服甲状腺片加烟熏制备肺阴虚大鼠模型。造模同时灌胃给予南沙参、玉竹、麦冬水提物，连续给药 40
天。末次给药后，取血测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UR)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲
腺原氨酸(T4)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)。结果:南沙参(1． 2g /kg)、玉竹(0． 9g /kg)、麦冬(0． 9g /kg)均能降低肺阴
虚动物血清 TC、TG、CAMP、T3、T4 水平，升高血清 TP、ALB水平;玉竹(0． 9g /kg)、麦冬(0． 9g /kg)能降低血清 UR 水平。结论:南沙
参、玉竹、麦冬因性味归经相同(同属甘凉归肺经) ，表现出相同或相近的药理作用，通过甘凉入肺从而改善物质代谢异常(降低 TC、
TG、UR，升高 ALB、TP) ，其作用机制可能是通过下调肺阴虚模型动物体内过高的甲状腺激素(T3、T4)、环核苷酸(CAMP)的水平，改
善肺阴虚证的相关证侯。
关键词 南沙参;玉竹;麦冬;肺阴虚;作用机制
本课题组从性味结合归经层面研究相同性味归经中药
对模型动物的影响，系统观察中药药性与药效学之间的联系，
为建立中药药性 －药效 －功效谱评价体系奠定基础［1，2］。前期
研究已选择甘温归肝肾经、辛温归肺经代表性中药，采用肾阳
虚证、肺阳虚证模型动物，从整体证候、器官、血液、尿液等生理
生化指标变化，揭示了具有相同性味归经的中药拥有相同或相
似的药效。本文进一步针对肺阴虚证，选择相同性味归经的三
味中药，同属甘凉归肺经的南沙参、玉竹、麦冬，具养阴润肺之功
效，选用甲状腺加烟熏致肺阴虚大鼠模型，分析相应生化指标，
阐述甘凉归肺经的药性规律，揭示甘凉归肺经药性的现代科学
内涵。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 南沙参、玉竹、麦冬均购自浙江中医药大学中
药饮片厂。南沙参:产地山西，批号 110315，经鉴定为桔梗科植
物轮叶沙参 Adenophora tetraphylla (Thunb．)Fisch的干燥根，制
成含生药量为 0． 12g /ml 的水提取物;玉竹:产地山东，批号
091212，经鉴定为百合科植物玉竹 Polygonatum odoratum (Mill．)
Druce的干燥根茎，制成含生药量为 0． 09g /ml 的水提取物;麦
冬:产地浙江，批号 110331，为百合科植物麦冬 Ophiopogon ja-
ponicus(Thunb．)Ker-Gawl． 的干燥块根，制成含生药量为 0．
09g /ml的水提取物。百合固金片，广州诺金制药有限公司，批
号 221046(规格为 0． 4g /片) ，加蒸馏水配成浓度为 0． 06g /ml。
1． 2 动物 清洁级 SD 大鼠，雌雄各半，体重 160 ～ 180g，由浙
江省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(浙)2008-0033。
1． 3 试剂 甲状腺片，批号为 902504(规格为 0． 04g /片) ，加
蒸馏水配成浓度为 0． 03g /ml。TC 试剂盒(批号 P101021)、TG
试剂盒(批号 P100931)、ALB试剂盒(批号:L1104023)、TP试剂
盒(批号 L1105013)、UR 试剂盒(批号 P1101011) ，以上试剂均
购自上海复兴长征医学科学有限公司;T3 放免检测试剂盒
(I125-T3 RIA Kit，北京福瑞生物工程公司，批号 2011081115)、
T4放免检测试剂盒(I125-T4 RIA Kit，北京福瑞生物工程公司，
批号 2011081116)、cAMP(Rat cAMP ELISA Kit R＆D USA Lot:
03 /2012)、cGMP(Rat cGMP ELISA Kit R＆D USA Lot:03 /2012) ，
以上试剂均由北京瑞格博科技发展有限公司提供;雄狮过滤嘴
香烟(焦油量 10mg、烟气烟碱量 0． 8 mg、烟气一氧化碳量 12
mg) ，浙江中烟工业有限责任公司。
1． 4 仪器 自制烟熏箱(1． 35m × 0． 54m × 0． 5m) ;LBY-N6B自
动血液流变学测定仪(北京普利生有限责任公司) ;SELECTRA-
E全自动生化仪(荷兰威图公司) ;XHF-D 高速分散器(宁波东
芝生物科技股份有限公司)。
1． 5 方法 大鼠雌雄各半，随机分成 6 组，正常对照组、肺阴
虚组、南沙参水提取物(1． 2g /kg)组、玉竹水提取物组(0． 9g /
kg)、麦冬水提取物组(0． 9g /kg)、阳性对照组(百合固金 0． 6g /
kg)。采用烟熏 +灌服甲状腺的方法建立肺阴虚证候模型，灌
服甲状腺片 10 天，之后烟熏 30min /d，连续 30d。受试药组按相
58中药药理与临床 2012;28(6)
* 基金项目:国家重点基础研究发展计划课题(2007CB512603) ，国家重大新药创制科技重大专项(2009ZX09502 － 016) ，浙江省卫生高层次
创新人才培养工程项目。浙江中医药大学校级科研基金:治疗肾阳虚证中药药性规律初探(编号 17211090)。 ＊＊通讯作者