全 文 ：显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的提取纯化
夏慧玲1，胡居吾2，熊 伟2，李雄辉2，万翠香1，林金枝1
(1．南昌大学中德联合研究院(江西 － OAI) ，江西南昌 330047;2．江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330029)
摘要 ［目的］优化显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的提取纯化工艺。［方法］采用水提法从显齿蛇葡萄中提取二氢杨梅素，并对二氢杨梅素
进行了纯化和检测。通过单因素试验和正交试验优化工艺提取条件。［结果］最佳工艺条件为:提取温度为 90 ℃，料液比为 1∶10
(g∶ml)，提取时间为 60 min，在此工艺条件下，二氢杨梅素的得率最大;重结晶 5次后总黄酮纯度由原来的 68． 51%提高至 91． 0%。［结
论］该二氢杨梅素的提取纯化工艺简单，成本低、原料来源易，作为抗氧化剂生产工艺前景看好。
关键词 二氢杨梅素;显齿蛇葡萄;纯化
中图分类号 S663． 1 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)32 －19783 －03
Extraction and Purification of Dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata
XIA Hui-ling et al (Jiangxi-OAI Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047)
Abstract ［Objective］To optimize the extraction and purification technology of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata． ［Method］
Dihydromyricetin was extracted from Ampelopsis grossedentata with water as extracting agent，then purified and determined，the extraction con-
ditions were optimized through single factor test and orthogonal experiment． ［Result］The optimum extraction conditions were:extracting tem-
perature was 90 ℃，solid-liquid ratio 1∶10 and extracting time 60 min，under which the yield of dihydromyricetin was the largest，the purity of
total flavonoids increased from 68． 51% to 91． 0% after 5 times re-crystallization． ［Conclusion］The extraction and purification technology of
dihydromyricetin was simple and affordable with convenient source of materials，therefore it had broad prospect in producing antioxidant．
Key words Dihydromyricetin(DMY);Ampelopsis grossedentata;Purification
基金项目 江西省科学院青年基金(200912)。
作者简介 夏慧玲(1962 － ) ，女，江西南昌人，高级实验师，从事天然产
物提取与改性研究，E-mail:hlxia@ ncu． edu． cn。
收稿日期 2011-08-04
显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)属葡萄科(Vitace-
ae) ，蛇葡萄属多年生木质藤本植物，多生于福建、江西等地
的山野林间。显齿蛇葡萄中含有的主要有效成分是以二氢
杨梅素为主体的黄酮类化合物，其中二氢杨梅素含量最高，
黄酮化合物提取量高达 20% ～ 28%［1］。二氢杨梅素具有很
强的抗氧化作用和良好的抑菌、抗病毒效果［2］。笔者对显齿
蛇葡萄干叶中二氢杨梅素的提纯及纯化技术进行了研究，以
期为其开发新型的天然抗氧化剂和药品。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验对象。显齿蛇葡萄芽头干叶，购自江西抚州。
1． 1． 2 主要试剂。二氢杨梅素标准品，由中国生物制品检
定所提供;浓度 95%的乙醇，丙酮，试剂均为市售，分析纯，蒸
馏水自制。
1． 1． 3 主要仪器与设备。恒温水浴锅上海亚荣生化仪器厂
生产、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵由上海亚荣生化仪器厂生产、
RE －52CS旋转蒸发仪，由上海亚荣生化仪器厂生产;电子天
平，由余姚纪铭设备有限公司生产;电热恒温真空干燥箱，由
上海南汇老港机械厂生产;752型紫外 －可见分光光度计，由
上海洪纪仪器设备有限公司生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 二氢杨梅素的提取［2 －3］。称取 100． 000 g 显齿蛇葡
萄芽头干叶，加入1 000 ml的蒸馏水，浸泡10 min，在95 ℃的
水浴下煮沸回流2次，每次60 min;趁热用200目的双层滤布
过滤，收集、合并滤液并浓缩;此操作重复 3 次，放置 1 d，析
出浅黄色颗粒状结晶，抽滤，干燥，得粗结晶体。
提取率(%)=提取量(g)/原料量(g)×100。
1． 2． 2 二氢杨梅素粗提物的纯化。取上述粗结晶物 10． 000
g，加入 80 ml无水丙酮回流 60 min，提取 2 次，合并提取液，
经旋转浓缩后，加入 400 ml的热蒸馏水溶解，放置，待析出白
色结晶后，过滤，得结晶物。所得物经 5次重复操作，最后抽
滤干燥，得黄白色粉末状结晶物。
1． 2． 3 定性鉴定。取结晶物 10． 000 g，加浓度 95%的乙醇
配成溶液。取 1 ml上述样液置于试管中，分别加入盐酸镁
粉、三氯化铁、氢氧化钠和锫盐 －柠檬酸试剂，摇匀后静置一
段时间，观察其颜色变化;并观察不同的重结晶次数其晶体
的形状和颜色等的变化。
1． 2． 4 定量测定。紫外分光光度法［4］。
1． 2． 4． 1 最大吸收峰的确立。精确称取二氢杨梅素标准品
30． 0 mg，用浓度 95%的乙醇溶解并定容至 100 ml，用移液管
精确吸取 1 ml上述溶液，置于 100 ml的容量瓶中，并用浓度
95%的乙醇定容，摇匀，得 0． 003 mg /ml 标准溶液。静置 40
min，于 282 ～304 nm波长范围内测定该溶液最大吸收峰。
1． 2． 4． 2 二氢杨梅素标准曲线图的绘制。精确称取二氢杨
梅素标准品 2． 5 mg，加浓度 95%的乙醇溶解并定容至 25 ml，
制成标准液备用。取 6个 10 ml的容量瓶，洗净烘干，依次编
号;精密吸取二氢杨梅素标准液 0，0． 5，1． 0，1． 5，2． 0，2． 5 ml
分别置于 10 ml的容量瓶中，加浓度 95%的乙醇定容，摇匀，
室温下静置 40 min，于最大吸收峰处测 OD 值，建立标准曲
线，确定回归方程。
1． 3 单因素试验
1． 3． 1 料液比。称取 100 g显齿蛇葡萄芽头干叶，分别加入
1∶5、1∶7、1∶10、1∶12、1∶15 的料液比的水(g∶ ml) ，先浸泡 10
min，后在 95 ℃的水浴下煮沸回流 2 次，每次 60 min;趁热用
200目的双层滤布过滤，收集过滤液;此操作重复 2 次，合并
滤液并浓缩，放置 1 d后，析出浅黄色颗粒状结晶。滤液经抽
滤、干燥，得粗结晶物。
1． 3． 2 提取温度。称取 100 g 显齿蛇葡萄芽头干叶，加入
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(32):19783 － 19785 责任编辑 夏静 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.32.039
1∶10(g∶ ml)的料液比的水，先浸泡 10 min，后分别在 50、60、
70、80、90、100 ℃温度下水浴煮沸回流 2 次，每次 60 min;趁
热用 200目的双层滤布过滤，收集过滤液;此操作重复 2 次，
合并滤液并浓缩，放置 1 d，析出浅黄色颗粒状结晶，经抽滤、
干燥，得粗结晶体。
1． 3． 3 提取时间。固定提取条件为温度 95 ℃，料液比为
1∶10(g∶ ml) ，选择不同的提取时间 30、40、50、60、70、80、90、
100、110和 120 min，按“1． 2． 1”方法进行提取，考察提取时间
对提取率的影响。
1． 4 正交试验 按表 1对进行试验，各处理做 3 次平行，测
定挥发油含量，取平均值，并作极差和方差分析。根据单因
素试验结果设计 L9(3
4)正交试验(表 1)。
表 1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平
Levels
A料液比
Solid-liquid
ratio∥g /ml
B萃取温度
Extraction tem-
perature∥℃
C提取时间
Extracting
time∥min
1 1∶8 80 50
2 1∶10 90 60
3 1∶12 100 70
1． 5 二氢杨梅素纯度测定 精确称取粗结晶物和纯化后结
晶物30 mg，用浓度95%的乙醇溶解并定容，摇匀。精确吸取
1 ml的该溶液，于 100 ml 的容量瓶中用浓度 95%的乙醇定
容，摇匀，在室温下静置 40 min 后，于最大吸收峰处测 OD
值，利用标准曲线和回归方程分别计算其纯度。
2 结果与分析
2． 1 二氢杨梅素的定性分析
2． 1． 1 化合物鉴定。从表 2可知，提取物与镁反应呈玫瑰红
色，与铁反应呈黑色，与铝反应呈墨绿色，根据二氢杨梅素的化
学反应特性可以认定，所得物质主要含有二氢杨梅素。
表 2 二氢杨梅素的定性分析
Table 2 Qualitative identification of dihydromyricetin
添加试剂
Agents
颜色反应
Color reaction
结论
Conclusion
盐酸镁粉 Mydrochloric acid magnesium 玫瑰红色 二氢杨梅素
三氯化铁 FeCl3 紫黑色 二氢杨梅素
三氯化铝 AlCl3 强黄绿色荧光 二氢杨梅素
氢氧化钠 NaOH 橙黄色 －绿色 二氢杨梅素
锫盐 －柠檬酸 鲜黄色不褪 二氢杨梅素
2． 1． 2 重结晶次数对产品性状的影响。由表 3 可知，随着
重结晶次数的增加，提取物的纯度呈上升趋势。显齿蛇葡萄
水提物中主要成分为二氢杨梅素，但不可避免地含有单宁
质、蛋白质及色素等杂质。资料显示显齿蛇葡萄中的单宁质
含量高达 12%［4］，是产生苦涩味的主要物质。粗提物经 5次
重结晶后，样品随重结晶次数的增加苦涩味逐步降低，颜色
也由浅灰色逐步呈现为其特有的鲜黄色，外观呈粉末状。
2． 2 方法学考察
2． 2． 1 最大吸收峰的确立。按“1． 2． 4． 1”进行操作，经紫外
－可见分光光度计测定后，看出二氢杨梅素在紫外光区的最
大吸收峰为 292 nm(图 1)。
2． 2． 2 二氢杨梅素标准曲线的确定。按“1． 2． 4． 2”进行操
作，得标准曲线的回归方程:y = 0． 034 6x － 0． 024 6，R2 =
0． 994(图 2)。
表 3 重结晶产品的性状
Table 3 Character of recrystallized products
评价指标
重结晶次数
Times of recrystallization
1 2 3 4 5
颜色 Color 浅灰色 黄白色 鲜黄色 鲜黄色 鲜黄色
状态 State 粉末 粉末 粉末 粉末 粉末
口感 Taste 微苦，涩 微苦，涩 无味 无味 无味
图 1 二氢杨梅素的紫外吸收峰图
Fig． 1 UV adsorption curve of dihydromyricetin(DMY)
图 2 二氢杨梅素标准曲线
Fig． 2 Standard curve of dihydromyricetin(DMY)
2． 3 单因素提取条件的确立
2． 3． 1 料液比的确定。从图 3可知，当料液比为 1∶5(g∶ ml)
时，水太少，二氢杨梅素不能被充分溶解出来;高于 1 ∶ 10
(g∶ ml)时，虽然二氢杨梅素在水中的溶出量会增加，但在此
浓度下，二氢杨梅素处于不饱和状态，不会自然沉降下来，须
蒸发部分水分使二氢杨梅素析出，势必加大能耗。料液比为
1∶10(g∶ ml)时，得率最高;表明在这种浓度下，二氢杨梅素能
够较好地溶解出来。
图 3 料液比对提取率的影响
Fig． 3 Effect of different solid-liquid ratios on extraction rate
2． 3． 2 提取温度的确定 从图 4可知，当温度低于 50 ℃时，
水分子几乎没有进入到细胞中，不能将二氢杨梅素提取出来，
当提取温度达到 70 ℃以上，得率大大提高;由于二氢杨梅素在
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240 ℃以下稳定，所以应尽量选择较高的温度进行提取。从图
2中还可知，当温度达到 90 ℃和 100 ℃时，产品的得率变化不
大，从节省能源的角度考虑，选取 90 ℃作为最佳提取温度。
图 4 提取温度对提取率的影响
Fig． 4 Effect of different temperatures on extraction rate
2． 3． 3 提取时间的确定。从图 5 可知，当提取时间达到 60
min时，溶液体系中原料细胞内外二氢杨梅素的浓度已达到
平衡，得率最大;延长提取时间，其他杂质溶出，且提取出来
的二氢杨梅素在长时间加热条件下会加速氧化，最后导致收
率下降。综合考虑选择 50 ～70 ℃范围较好。
图 5 提取时间对提取率的影响
Fig． 5 Effect of time on extraction rate
2． 4 二氢杨梅素提取工艺条件的优化 根据上述单因素的
试验研究结果发现，料液比(A)、萃取温度(B)和萃取时间
(C)对二氢杨梅素得率的影响较大。因此，采用 3 因素 3 水
平的正交试验方法对工艺条件进行优化，以挥发油含量为评
价指标，进行评价(表 4)。
表 4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal experiment
编号
No．
A B C
得率
Yield ∥%
1 1 1 1 14． 2
2 1 2 2 15． 6
3 1 3 3 15． 0
4 2 1 2 17． 5
5 2 2 3 18． 1
6 2 3 1 16． 5
7 3 1 3 17． 4
8 3 2 1 16． 7
9 3 3 2 17． 9
k1 14． 933 16． 367 15． 800
k2 17． 367 16． 800 17． 000
k3 17． 333 16． 467 16． 833
R 2． 434 0． 433 1． 200
从表 4 比较 3 个因素的极差 R 值可以看出，RA ＞ RC ＞
RB，即各因素对提取物得率影响的顺序为液料比 ＞萃取时
间 ＞萃取温度，说明因素 A对指标的影响最大。对试验结果
进行方差分析，结果 A因素达显著水平(F0． 05(2，2)= 19，FA
=37． 806，P ＜ 0． 05)。根据 K 值分析得最佳工艺组合为
A2B2C2，即料液比为 1∶10(g:ml)、提取温度 90 ℃，提取时间
60 min。依照优化条件进行重复试验，获得二氢杨梅素得率
为 18． 2%，证明该工艺条件相对稳定，重现性好。
2． 5 重结晶次数对产品得率与纯度的影响 二氢杨梅素产品
得率与纯度变化曲线结果见图5 ～6。由图5可知，二氢杨梅素
粗提物相对得率随重结晶次数的增加而减少，尤其是第 1次结
晶得率为78． 5%，到第5次时得率降低到33． 9%。这说明提取
物中二氢杨梅素浓度较低重结晶提纯的过程中失败较大。由
图 6可知，二氢杨梅素纯度随重结晶次数的增加提高较快，纯
度由第 1次结晶物的 68． 51%提高到第 5次结晶物的 91． 88%，
尤其是经过前 3次重结晶后其纯度提高明显。
图 6 重结晶次数与粗提物相对得率之间的关系
Fig． 6 Relation between recrystallization times and relative yield
of crude extracts
图 7 重结晶次数对产品纯度的关系
Fig． 7 Relation between recrystallization times and purity of
crystal
3 结论
水提法制备显齿蛇葡萄芽头干叶中的二氢杨梅素的最
佳条件:料液比 1∶10，温度 90 ℃，提取时间 60 min，得率最
大，达到 18． 2%，粗提物中二氢杨梅素黄酮纯度为 68． 51%。
5次重结晶后产品纯度达 91%以上，产品外观为黄白色细针
状晶体，无味。该二氢杨梅素的提取纯化工艺简单、成本低、
原料来源易，作为抗氧化剂生产应用前景看好。
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5879139卷 32期 夏慧玲等 显齿蛇葡萄中二氢杨梅素的提取纯化