全 文 ：·论著·
* 通讯作者:赵雄，Email:mlltq@ 163． com
狗脊提取物对去势大鼠抗骨质疏松活性的实验研究
李天清 雷伟 马真胜 王林 吴子祥 赵雄*
第四军医大学第一附属医院脊柱二科，西安 710032
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1006-7108(2014)07-0736-05
摘要:目的 探讨狗脊提取物对去势大鼠的抗骨质疏松作用。方法 选择 3 个月龄雌性 SD大鼠 72 只，随机分为对照组和 5
个去势组:单纯去势组;雌激素组(25 μg /kg·d);狗脊提取物低剂量组，中剂量组，高剂量组(100，300，500 mg /kg·d)。去势后
4 周开始应用狗脊提取物和雌激素治疗，16 周后将大鼠处死，测量骨量、骨转换和骨强度指标、生化指标和三点弯曲试验，同时
行 Micro-CT检查评价骨小梁结构。结果 狗脊提取物可以降低大鼠去势引起的股骨骨量丢失，在骨重建过程中骨转换指标
如骨钙素(OC)，碱性磷酸酶(ALP) ，脱氧吡啶啉(DPD)降低，尿钙、磷排泄减少。狗脊提取物也可以提高骨强度，防止骨小梁
微结构恶化。结论 狗脊提取物可能是绝经后骨质疏松症预防和治疗的一个潜在替代药。
关键词:狗脊提取物;骨质疏松
Experimental study of the effect of Cibotiumbarometz extract on ovariectomy-induced
osteoporosis in rats
LI Tianqing，LEI Wei，MA Zhensheng，WANG Lin，WU Zixiang，ZHAO Xiong
The Second Department of the Spine，the First Affiliated Hospital of the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China
Corresponding author:ZHAO Xiong，Email:mlltq@ 163． com
Abstract:Objective To investigate the effect of Cibotiumbarometz extract (CBE)on ovariectomy-induced osteoporosis in rats．
Methods A total of 72 3-month female Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into sham-operated group and
five ovariectomized (OVX)groups:OVX with vehicle (OVX);OVX with 17α-ethinylestradiol (E2，25 μg /kg·d) ;OVX with
CBE of graded doses (100，300，and 500 mg /kg·d)． Daily oral administration of CBE or E2 began at the 4th week after the
surgery and lasted for 16 weeks． After the execution，the bone mass，bone turnover，and bone strength were analyzed using DXA．
The biochemical markers were detected． And three-point bending test was also performed． The microarchitecture of the trabecular
bone was evaluated using micro-CT． Ｒesults CBE prevented the decrease of total BMD in the femur induced by OVX，which
was accompanied by a significant decrease in skeletal remodeling，shown as the decreased levels of the bone turnover markers，
including osteocalcin (OC) ，alkaline phosphatese (ALP) ，deoxypyridinoline (DPD) ，and the excretion of urinary Ca and P． The
treatment could also improve the bone strength and prevent the deterioration of trabecular microarchitecture． Conclusion
Cibotiumbarometz extract may be a potential alternative drug for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis．
Key words:Cibotiumbarometz extract (CBE) ;Osteoporosis
骨质疏松症是目前世界上发病率、死亡率及保
健费用消耗较大的疾病之一，骨质疏松症是以骨量
减少、骨的微观结构退化为特征的一种全身性骨代
谢疾病，伴有骨脆性增加而易于发生骨折。狗脊
(家庭蚌壳蕨科)，俗称“沟集”，早在古代就已经当
做药物使用，金毛狗植株上金黄色的茸毛，是良好的
止血药，它的根状茎有抗炎镇痛、补肝肾、利尿等功
效［1］。目前还没有关于狗脊对雌激素缺乏引起的
骨质疏松症治疗的相关信息。最新研究证实，金毛
狗对破骨细胞形成具有抑制作用［2］。因此，本研究
的目的是寻找狗脊提取物在预防和改善去卵巢大鼠
骨丢失方面的作用。
1 材料和方法
1. 1 狗脊提取物的制备
狗脊在西安中药店购买，根据形态，组织学和化
学方法确认保证质量。制成 25 kg 均匀干燥细粉，
存储在室温(18 ～ 22℃)。70%乙醇提取两次，提取
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Published online www． wanfangdate． com． cn doi:10. 3969 / j． issn． 1006-7108. 2014. 07. 004
液通过滤纸过滤，再浓缩、喷雾、干燥，萃取率约
10%。
1. 2 动物与处理
72 只 3 月龄雌性 SD-大鼠是由第四军医大学实
验动物中心购买，提前 1 周驯化满足实验条件。实
验动物被安置在一个在 21 ～ 25℃房间，昼夜交替，
湿度(45 ～ 50%)。统一喂养，饲料中含有 0. 9%的
钙和 0. 7%的磷酸盐，可自由饮用蒸馏水。研究开
始时，大鼠平均体重 230 ± 12 g，每星期称量体重。
所有大鼠使用戊巴比妥钠(50 mg /kg，腹腔注
射)进行麻醉。对照组 12 只大鼠行双侧探查术，去
势组 60 只大鼠行双侧卵巢切除术。4 周后大鼠从
手术中恢复，去势组大鼠随机分为 5 组:单纯去势
组，雌激素组(25 μg /kg·d)，低剂量的狗脊提取物
(CBE)组(100 mg /kg) ，中剂量狗脊提取物(CBE)
组(300 mg /kg) ，和高剂量的狗脊提取物(CBE)组
(500 mg /kg)。单纯去势组，3 个狗脊提取物(CBE)
组和雌激素组均通过一个定制的胃管喂食，手术后
4 周开始喂养，所有去势大鼠喂养 16 周后施行处
死，处死前一天禁食，利用容器收集尿液样本，尿液
样品经 2ml HCl(1 mmol /L)酸化。采用乙醚麻醉后
剖腹探查，抽取腹主动脉血液样本离心制备血清
(2000 转 20 分钟)。分离股骨标本，用盐水纱布包
裹，存储在 － 20℃环境中，准备做结构分析和生物力
学测试。所有的动物试验都得到伦理委员会批准，
并根据第四军医大学实验动物护理和使用指南的进
行操作。
1. 3 测定血清和尿液化学成分
在自动分析仪(CIBACOＲNING 550，美国)使用
体外测定的试剂盒测定血钙，血清无机磷，血清碱性
磷酸酶活性，测定尿钙、磷和血清的肌酐浓度。使用
ELISA方法测定血清骨钙素。通过比较酶免疫分析
法，试剂盒测定尿脱氧吡啶啉浓度(nmol / Cr)。
1. 4 骨密度分析
使用 DXA测定右股骨的骨矿物质密度和骨矿
含量，通过骨矿含量的实测面积由软件自动分析计
算 (encore 2006， GE healthcare， Madison，WI，
USA)骨密度。
1. 5 三点弯曲试验
力学性能测试之前，左股骨在室温下慢慢解冻
后放置两小时，去掉覆盖的纱布。用卡尺测量股骨
的长度和中段的直径。分别采用三点弯曲材料试验
机测试(MTS 858 Mini Bionix II，MTS systems Corp．
Minneapolis，MN，USA)。左股骨两个支撑点的距
离为 20 mm，中央加载点位移，加载速率为 2 mm /
min，直至股骨发生断裂。进行数据采集并绘制负
荷-变形曲线，对样本断裂时的加载负荷和位移距离
进行记录。通过载荷应变曲线，获得最大载荷，刚
度，能量吸收值丢失，最大应力和弹性模量。
1. 6 Micro-CT分析
将 75%乙醇固定的大鼠股骨从中间截断，取远
端部分固定于样品杯中。采用 eXplore Locus SP 型
Micro-CT 对股骨样本进行扫描。在对样本进行三
维重建后，采用半自动的方式在每个二维平面上调
整矩形的位置来提取股骨干骺端的松质骨。在干骺
线上方约 1mm 处向上选取 100 层作为 VOI，三维重
建图像直接用来进行骨小梁微结构的分析。采用
GE 公司 MicroView 软件对三维重建的骨小梁进行
分析，计算如下参数:骨组织比例(BV /TV)、骨小梁
数量(Tb． N)、骨小梁厚度(Tb． Th)、骨小梁间隙
(Tb． Sp)、结构模型指数(SMI)及骨小梁连接密度
(Conn． D)。
2 统计分析
使用 SPSS 13 统计软件分析，实验数据采用平
均值 ±标准差的方法。方差分析判断是否有统计学
意义(P ＜ 0. 05)，并分析组之间的差异。当方差分
析表明存在任何显著差异，Student-Newman-Keuls多
重比较用来确定哪个具有最显著性差异(P ＜
0. 05)。
3 结果
3. 1 体重和子宫指数
在本研究中，六组的初始体重相似(P ＞ 0. 05)。
除了雌激素组其它各组体重都在不断增加。尽管消
耗饲料量在每一组中无明显差异，实验组体重明显
高于对照组(P ＜ 0. 01)。去势导致的体重增加是通
过显著抑制 E2 导致的(P ＜ 0. 01)，但所有三个剂量
的狗脊提取物组在防止体重增加方面无明显差异。
去势组比对照组子宫重量明显降低，有显著性
差异(P ＜ 0. 01) ，表明雌激素缺乏导致去势大鼠子
宫萎缩。雌激素组与单纯去势组相比，雌激素组防
止子宫重量丢失有显著性差异(P ＜ 0. 01) ，但子宫
重量仍低于对照组。而 CBE 治疗没有任何增重效
果。
3. 2 血清和尿液中的化学指标
去势组在增加尿钙(P ＜ 0. 01)和磷(P ＜ 0. 01)
排泄和血清 ALP水平(P ＜ 0. 01)比对照组有显著性
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差异。在逆转去势诱导的大鼠 ALP 活性的增加方
面，E2 治疗组和 CBE300 和 CBE500(P ＜ 0. 05 或
0. 01)有类似的效果，有显著性差异，这似乎是 CBE
剂量依赖性。CBE500 治疗组可明显减少去势导致
的尿钙及尿磷丢失，这和 E2 治疗组具有类似的作
用(P ＜ 0. 01 和 0. 05)。经过 16 周的喂养，去势组
尿脱氧吡啶啉 /肌酐水平和血清骨钙素水平增加比
对照组有显著性差异(P ＜ 0. 01)。所有三个剂量
CBE治疗组显著抑制去势引起尿脱氧吡啶啉 /肌酐
与血清 OC水平下降(P ＜ 0. 05 或 0. 01)。E2 治疗
组与 CBE3 个治疗组在减少骨质流失方面也有类似
的效果(P ＜ 0. 01)。
3. 3 股骨的总骨矿含量及骨密度
表 1 狗脊提取物和雌激素对去势大鼠左股骨力学性能测试结果
Table 1 Effect of CBE or E2 on the bone biomechanical parameters in the femoral diaphysis of OVX rats
对照组 单纯去势组 雌激素组 CBE 100 CBE 300 CBE 500
最大负荷(N) 121． 46 ± 9． 05 98． 17 ± 7． 53## 118． 08 ± 10． 12＊＊ 101． 44 ± 8． 31 104． 60 ± 10． 25 106． 33 ± 9． 69
强度 (N /mm) 163． 74 ± 17． 09 150． 32 ± 13． 64 161． 42 ± 12． 31 155． 68 ± 13． 22 157． 50 ± 18． 14 156． 26 ± 17． 93
能量 (N × mm) 54． 95 ± 6． 83 43． 92 ± 5． 24## 52． 14 ± 4． 52＊＊ 45． 01 ± 4． 23 48． 73 ± 7． 66* 53． 21 ± 4． 78＊＊
杨氏模量 (MPa) 6894． 27 ± 745． 38 4514． 92 ± 651． 20## 6418． 44 ± 738． 24＊＊ 5428． 83 ± 891． 23* 6227． 56 ± 932． 25＊＊ 6036． 74 ± 822． 81＊＊
最大应力 (MPa) 195． 16 ± 16． 40 152． 19 ± 10． 99## 180． 26 ± 20． 38＊＊ 154． 72 ± 17． 97 169． 10 ± 16． 15* 176． 26 ± 14． 34＊＊
Values are mean ± S． D，n = 12 in each group．
* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 与单纯去势组对比;#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01 与对照组比较
表 2 微 CT测量 CBE和 E2 治疗去势大鼠股骨远端相关参数
Table 2 Effect of CBE or E2 on bone parameters measured using micro-CT at the distal femur region of OVX rats
对照组 单纯去势组 雌激素组 CBE高剂量组
BV /TV (l) 0. 3827 ± 0. 025 0. 1730 ± 0. 0262## 0. 2951 ± 0. 028＊＊ 0. 2217 ± 0. 031*
Conn. D(1 /mm3) 60. 516 ± 9. 512 37. 523 ± 5. 282## 46. 431 ± 7. 125* 44. 741 ± 5. 260*
SMI(1) 0. 8619 ± 0. 097 1. 4167 ± 0. 026## 0. 9146 ± 0. 059＊＊ 1. 0251 ± 0. 092＊＊
TB． N(1 /mm) 3. 9796 ± 0. 311 2. 3880 ± 0. 193## 3. 0350 ± 0. 362＊＊ 2. 7584 ± 0. 362*
Tb. Th(mm) 0. 0965 ± 0. 016 0. 0712 ± 0. 011## 0. 0860 ± 0. 009* 0. 0908 ± 0. 012＊＊
Tb. Sp(mm) 0. 1852 ± 0. 013 0. 3578 ± 0. 042## 0. 2437 ± 0. 020＊＊ 0. 2681 ± 0. 034＊＊
平均值 ±标准差，每组 n = 6
* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 与单纯去势组比较;#P ＜ 0. 05，##P ＜ 0. 01 vs．与对照组比较
如图 1A 和 1B 所示，右股骨 BMC 最终在任何
治疗组没有差异。去势组右股骨骨密度与对照组相
比显著下降，有显著性差异(P ＜ 0. 01)。CBE300，
CBE500 和 E2 治疗组与单纯去势组相比右股骨骨
密度显著增加(P ＜ 0. 01)。
3. 4 股骨的生物力学质量
去势组与对照组相比 20 周后雌激素缺乏，最大
负荷明显降低(P ＜ 0. 01)。雌激素治疗组与对照组
相比能明显抑制去势引起的最大负荷降低(P ＜
0. 01)。去势组与对照组比较骨强度显著降低(P ＜
0. 01)。CBE300，CBE500 和 E2 治疗组和单纯去势
组相比，可以显著阻止去势引起的骨强度减少(P ＜
图 1 狗脊提取物和雌激素对去势大鼠右股骨
骨矿物含量和骨密度的影响
Fig． 1 Effect of CBE or E2 on (A)bone mineral
density (BMD)and (B)the bone mineral content
(BMC)in the right femur of OVX rats detected using DXA
0. 05 或 0. 01)。去势组与对照组相比在减少最大应
力和股骨杨氏模量方面具有显著性差异(P ＜
0. 01)。三种强度 CBE组、E2 组和对照组相比显著
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增加杨氏模量(P ＜ 0. 05 或 0. 01)。CBE 中剂量、
CBE高剂量组和 E2 组可逆转去势引起的最大应力
下降(P ＜ 0. 05 或 0. 01)。
3. 5 微型 CT评价
在股骨干骺端骨小梁性能分析表明，与对照组
相比，去势股骨近端骨小梁结构的 BV /TV，Conn．
D，Tb． N and Tb． Th 参数较对照组明显降低(P ＜
0. 01)(表 2)，而 S MI 与 Tb． Sp 值(P ＜ 0. 01)明显
高于对照组。高剂量的 CBE组和 E2 治疗组对去卵
巢大鼠能明显扭转卵巢切除所致的参数变化(P ＜
0. 05 或 0. 01)，并维持大鼠股骨近端及干骺端骨小
梁微体系结构(图 2)。
图 2 股骨远端干骺端区域内骨小梁的三维结构(A)对照组，(B)单纯去势组，(C)雌激素组，(D)CBE高剂量组．
Fig． 2 Three-demensional structure of the trabecular bone within the distal metaphyseal femoral region．
A:control group;B:OVX group;C:OVX + E2 group;D:OVX + high dose CBE group．
4 讨论
本文是国内首次研究不同剂量狗脊提取物对去
势大鼠骨量和骨强度降低的预防作用，辽宁中医药
大学的索天姣等人 2012 年曾经做过研究，狗脊生、
制品乙酸乙酯提取物组可使卵巢去势后的大鼠体重
下降，子宫指数升高，骨皮质及骨松质密度明显增
高，股骨中钙离子含量升高，骨小梁排列相对整齐、
规则，连续性相对较好。其中狗脊制品的乙酸乙酯
提取物组的作用比较明显，狗脊生品的乙酸乙酯提
取物组的作用不明显［3］，作者在此次研究中，将狗
脊提取物分为三个剂量组给药。根据中医理论，
“肾”影响骨代谢，骨质疏松症是由于“肾虚”。因
此，中医认为“补肾”有利于骨的形成，补肾健骨的
中药可用于治疗骨疾病，同时也是治疗骨质疏松症
的一种方法［4］。狗脊等补肾中药已被广泛用于治
疗骨折和关节疾病。虽然这些草药经济实惠，但目
前仍未被广泛接纳，要想得到进一步推广，它的疗效
尚需要大量的科学研究方法进一步证实。
狗脊提取物作为一种预防和治疗骨质疏松症的
替代药物，还需要得到认可。有研究认为，去势大鼠
和对照组大鼠相比，由雌激素缺乏造成的脂肪沉积导
致体重有显著增高，说明机体通过体重增加作为一种
刺激骨生成的因素，在承受身体重量的长骨骨量丢失
较少，也可以理解为为了减少骨质疏松带来风险的一
种保护机制［5］。去卵巢大鼠由于脂肪沉积导致体重
增加，因为体重减少将更进一步疏松［6，7］。在我们的
研究中，正如预期的那样，这多余增加的体重是可以
通过雌激素预防的。在本研究中所有三个 CBE剂量
组不能阻止去势引起的体重增加，这可能与药物的剂
量或者治疗强度有关，也可能是机体预防骨质疏松的
保护机制足够强大。子宫重量在单纯去势组和狗脊
提取物治疗组没有差异。结果表明，在这些剂量 CBE
治疗下，没有表现出像 E2 对卵巢切除大鼠在体重和
子宫组织生长方面的调控作用。
骨转换生化标志物已被广泛用于测量各种药物
对骨重建影响的研究中。已经有相关研究报道，在
绝经后妇女和实验室动物骨质疏松的研究中，骨质
疏松和血清 OC、ALP水平、骨形成、PDP，骨吸收、骨
的微结构等有关联［8］。在本研究中，CBE 在使用 16
周后降低血清 OC、ALP 水平，和尿 DPD / Cr 比值，
这表明，CBE 阻止去势引起的大鼠骨代谢的增加。
此外，尿钙、磷排泄的指标比如 Ca /Cr 和 P /Cr 的增
加表明骨代谢处于上调去势。CBE 剂量依赖性抑
制去卵巢所致的尿钙排泄，CBE 在最高剂量(500
mg /kg·d)显著降低尿磷排泄量，E2 也有这种类似
作用。整体上，这些结果表明 CBE 和 E2 治疗后骨
转换率降低。骨量减少主要影响骨的完整性，导致
骨强度下降和骨折易感性增加。骨密度是用于预测
骨质疏松症的风险，目前还没有预测骨折风险的金
标准。在目前的研究中，结果表明，单纯去势组与对
照组相比股骨骨密度显著降低。狗脊提取物阻止去
势引起的股骨骨质丢失，这与以往的研究结果吻
合［9］，我们的研究结果表明，去势导致骨密度下降，
本质上是因为减少了松质骨的强度，狗脊提取物治
疗可以增加骨密度，而且在松质骨区比在皮质骨区
效果显著(图 1B)。
在目前的研究中，三点弯曲试验用来评价狗脊
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提取物对去卵巢大鼠股骨生物力学性能的影响。在
本研究中观察到的去势组骨骼机械性能下降，这和
以往的相关研究符合。在给去势大鼠更高的 CBE
剂量组(300 或 500 mg /kg·d)，发现有显著阻止最大
应力和杨氏模量降低的作用。骨强度与骨密度、骨
连接、骨矿化密切相关，去势之后骨密度下降以及骨
生物力学强度减少，我们的数据与这些结果一致。
骨的整体质量和骨的微结构、几何形态和骨质
性质有关，所有这些都可以影响骨转换率。测量这
些结构参数比如骨量，骨小梁结构，骨小梁厚度，骨
小梁距离可能会提高我们估计骨强度的能力。在这
项研究中，微 CT扫描股骨的微体系结构，发现最大
剂量的 CBE具有增加骨微结构的作用。微型 CT评
价结果显:CBE 500 mg /kg·d治疗 SD大鼠组与单纯
去势组相比，可提高骨小梁 BV /TV，Tb． N，Tb． Th
and Conn． D 参数，同时降低 Tb． Sp 值。CBE 和 E2
治疗可防止去势引起的骨小梁进一步降低(表 1 和
图 1)。我们的研究结果表明，虽然 CBE 对骨小梁
结构性能的改善有积极作用，但也只是能够减少丢
失，却无法恢复的骨小梁的正常形态。
总之，本研究表明，对卵巢切除诱导的大鼠每日
使用 CBE 治疗，可以预防骨丢失，可能与狗脊提取
物强肝肾，增加肾脏对矿物质的重吸收，减少丢失有
关，从而减缓骨组织矿物质的减少，狗脊提取物可以
用来作为开发治疗骨质疏松的新药。狗脊提取物可
以阻止去势引起的骨量和骨小梁微结构的丢失，从
而保持骨结构的完整性和骨生物力学性能。狗脊提
取物没有雌激素对子宫的刺激作用。可以预见，狗
脊提取物可能是绝经后骨质疏松症预防和治疗的一
个潜在替代药。
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