全 文 ：正交试验法优化 3 种乌蔹莓属植物中黄酮和多糖的水提醇沉工艺
江 念1，2， 万佐玺1， 陈根洪1， 郑小江2*
(1． 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000;2． 湖北民族学院生物科学与技术学院，
湖北 恩施 445000)
收稿日期:2016-05-16
基金项目:湖北省自然科学基金创新群体项目 (2009CDA115) ;生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目 (PKLHB1525，
1526) ;恩施州技术研发项目 (2013，2014)
作者简介:江 念 (1991—) ，男，硕士生，从事林特食品资源保护与利用研究。Tel:15587583747，E-mail:1654825982@ qq． com
* 通信作者:郑小江 (1958—) ，男，教授，从事野生植物资源保护与利用研究。E-mail:hbzxj123@ 126． com
摘要:目的 采用正交试验法优化乌蔹莓、华中乌蔹莓和鸟足乌蔹莓中黄酮和多糖的水提醇沉工艺。方法 以提取温
度、提取时间、料液比为因素，正交试验法优化提取工艺。结果 最佳条件为温度 80 ℃，提取时间 1 h，料液比
1 ∶ 60。乌蔹莓黄酮提取率 2. 41%，多糖提取率 4. 75%;华中乌蔹莓黄酮提取率 6. 79%，多糖提取率 6. 47%;鸟足乌
蔹莓黄酮提取率 3. 77%，多糖提取率 7. 75%，均接近于理论值。结论 华中乌蔹莓与鸟足乌蔹莓中黄酮和多糖的提
取率均高于乌蔹莓，应加以关注并优先考虑。
关键词:乌蔹莓;华中乌蔹莓;鸟足乌蔹莓;黄酮;多糖;水提醇沉;正交试验
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)10-2281-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 10. 041
乌蔹莓 Cayratia japonica (Thunb．)Gagnep． 为草质藤
本植物，生于山谷林或山坡灌丛中，别名母猪藤、五爪龙、
五叶藤等;华中乌蔹莓 Cayratia oligocarpa (Levl． ＆Vant．)
Gagnep． 为草质藤本植物，生于山谷或山坡林中，海拔
400 ～ 2 000 m;鸟足乌蔹莓 Cayratia pedata (Lamk．)juss．
为木质藤本植物，别名七叶大麻藤，生于坡林、灌木或岩
石缝中，海拔 800 ～ 2 200 m［1-3］。以上 3 种乌蔹莓属植物均
具有活血消肿、利尿止血的效果，民间多用于治疗毒蛇咬
伤［4-5］，而且其易于采集和炮制，生物量大，有着很好的
抗菌作用［6］。
乌蔹莓属植物富含甾醇、黄酮、氨基酸、多糖及酚性
物质［5-8］，其中黄酮类化合物具有明显的抗溃疡、解痉、抗
炎、抑菌及降血脂等生物活性，其独特的化学结构对哺乳
动物细胞具有许多重要的生理生化作用，抗氧化功效良
好［9-13］。除黄酮外，多糖也是重要的活性成分，其抑菌、
抗氧化、抗肿瘤及调节免疫等活性越来越受到重视［14-17］，
但近年来鲜有该属植物活性成分提取工艺的报道，相关开
发利用也较少，其在亚洲、欧洲和非洲共有 30 余种，其中
我国约有 16 种，而且其活性成分含有量也不尽相同［2］。本
实验选取湖北省恩施州常见的乌蔹莓、华中乌蔹莓和鸟足
乌蔹莓 3 种植物，应用正交试验法优化其中黄酮和多糖的
水提取工艺，为评价该属植物的内在质量和拓展其开发利
用提供了依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 乌蔹莓、华中乌蔹莓和鸟足乌蔹莓分别
采自湖北省农业科学院中药材研究所华中药用植物园 (恩
施市新塘乡长岭岗)、湖北省恩施州星斗山国家级自然保
护区 (利川市谋道乡)、湖北省恩施州来凤县三胡乡石桥
村，均经湖北民族学院生物科学与技术学院郑小江教授鉴
定为正品。苯酚、氢氧化钠、浓硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、
正丁醇、葡萄糖、芦丁、石油醚、无水乙醇均为分析纯。
1. 2 仪器与设备 TU-1901 双光束紫外可见分光光度计
(北京瑞利分析仪器公司);BC-Ｒ501C 旋转蒸发仪 (上海
贝凯生物化工设备有限公司) ;FA-1004B 电子天平 (上海
精密科学仪器有限公司);HHS 数显恒温水浴锅 (上海博
迅实业有限公司) ;TDL-80-2B低速台式离心机 (上海安亭
科学仪器厂);AF-20A摇摆式粉碎机 (温岭市林大机械有
限公司) ;101 型电热鼓风干燥箱 (上海博讯实业有限公司
医疗设备厂)。
1. 3 方法
1. 3. 1 材料处理 将 3 种药材置于 60 ℃烘箱中烘干，取
其复叶作为实验原料，粉碎机粉碎成粉末，过 60 目筛，保
存备用。
1. 3. 2 提取工艺流程 药材脱脂→热水浸提→离心→收集
上清液→浓缩→醇沉→离心→a． 取上清液减压浓缩后冷冻
干燥，得黄酮粗提物;b． 沉淀复溶，冷冻干燥，得多糖粗
提物［16］。
1. 3. 3 含有量测定
1. 3. 3. 1 多糖 以 105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖为标准
品，采用苯酚-硫酸法测定［18］。精密称取标准品 0. 1 g，置
于 1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得
葡萄糖标准液。精密吸取 10、20、30、40、50、60、
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70 mL，置于 7 个 100 mL 量瓶中，去离子水定容，摇匀。
分别取 1 mL，置于 7 个 25 mL 试管中，加入新配的 5%苯
酚溶液 1. 0 mL，再迅速加入 5 mL 浓硫酸，充分摇匀，另
取 1 mL去离子水作为对照，25 ℃下放置 30 min，490 nm
波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标 (y)，样品溶液质
量浓度为横坐标 (x)绘制标准曲线［5］，得线性回归方程
y = 10. 517x － 0. 005 5 (Ｒ2 = 0. 999 5) ，计算多糖提取率，
公式为提取率 = (C × V × N /m) × 100%，式中 C 为样品
溶液中葡萄糖的含有量 (mg /mL) ，V 为样品溶液的最终稀
释体积 (mL) ，N为稀释倍数，m为药材质量 (mg)。
1. 3. 3. 2 黄酮 以 120 ℃下干燥至恒重的芦丁为标准品，
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合分光光度法测定［19］。
精密称取标准品 0. 2 g，置于 1 000 mL量瓶中，加水溶解并
稀释至刻度，摇匀，制得 0. 2 mg /mL 标准品溶液。精密吸
取 1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL，置于 25 mL 量瓶中，加
入 10 mL去离子水和 1 mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，静置
6 min，再加入 1 mL 10% Al (NO3)3 溶液，摇匀，静置
6 min，加入 4 mL 10%NaOH溶液，静置 20 min，在 510 nm
波长处测定吸光度，绘制标准曲线。结果，线性回归方程
为 y = 8. 687 5x － 0. 057 1 (Ｒ2 = 0. 999 7) ，计算黄酮提取
率，公式为提取率 =(C × V × N /m) × 100%，式中 C为
样品溶液中黄酮的质量浓度(mg/mL)，V为样品溶液的最终
稀释体积 (mL)，N为稀释倍数，m为药材质量 (mg)。
1. 3. 4 单因素试验 分别以料液比 (A、D、G)、提取温
度 (B、E、H)以及提取时间 (C、F、I)进行单因素试
验，研究其对黄酮和多糖得率的影响［5］。
1. 3. 4. 1 料液比 称取 3 种药材粉末各 0. 4 g，置于具塞
试管中，固定提取温度 90 ℃、提取时间 2 h，在料液比
1 ∶ 20 ～ 1 ∶ 100 条件下进行考察。
1. 3. 4. 2 提取温度 称取 3 种药材粉末各 0. 4 g，置于具
塞试管中，固定料液比 1 ∶ 80、提取时间 2 h，在提取温度
60 ～ 100 ℃条件下进行考察。
1. 3. 4. 3 提取时间 称取 3 种药材粉末各 0. 4 g，置于具
塞试管中，固定料液比 1 ∶ 80、提取温度 90 ℃，在提取时
间 0. 5 ～ 2. 5 h条件下进行考察。
1. 3. 5 正交试验 根据单因素试验结果，选择提取温度、
提取时间、料液比作为影响因素，进行 3 因素 3 水平正交
试验，结果见表 1。
表 1 因素水平
水平
乌蔹莓 华中乌蔹莓 鸟足乌蔹莓
A提取时间 /h B提取温度 /℃ C料液比 D提取时间 /h E提取温度 /℃ F料液比 G提取时间 /h H提取温度 /℃ I料液比
1 0. 5 80 1 ∶ 60 1 80 1 ∶ 60 0. 5 80 1 ∶ 60
2 1 90 1 ∶ 80 1. 5 90 1 ∶ 80 1 90 1 ∶ 80
3 1. 5 100 1 ∶ 100 2 100 1 ∶ 100 1. 5 100 1 ∶ 100
2 结果与分析
2. 1 单因素试验
2. 1. 1 料液比对黄酮和多糖提取率的影响 由图 1 可知，
乌蔹莓中两者提取率均随料液比增加而提高，但前者在
1 ∶ 60 ～ 1 ∶ 100 范围内变化程度较小;华中乌蔹莓中黄酮提
取率在 1 ∶ 60 时最高，而多糖仍不断提高，但是在 1 ∶ 80 ～
1 ∶ 100 范围内变化程度较小;鸟足乌蔹莓中黄酮提取率在
1 ∶ 60 时最高，而多糖仍不断提高。
图 1 料液比对黄酮和多糖提取率的影响
2. 1. 2 提取温度对黄酮和多糖提取率的影响 由图 2 可
知，乌蔹莓中黄酮的提取率随温度增加而提高，在 80、
90、100 ℃之间的变化程度较小，而多糖在 80 ℃时最高;
华中乌蔹莓和鸟足乌蔹莓中两者提取率均在 90 ℃时最高。
图 2 提取温度对黄酮和多糖提取率的影响
2. 1. 3 提取时间对黄酮和多糖提取率的影响 由图 3 可
知，乌蔹莓中两者提取率在 1 h 时最高;华中乌蔹莓中黄
酮提取率在 1. 5 h 后变化程度较小，而多糖最高;鸟足乌
蔹莓中两者提取率在 1 h时最高。
2. 2 正交试验 结果见表 2 ～ 4。
采用 SPSS17. 0 软件处理正交试验数据，结果见表
5 ～ 8。
由表 5 可知，提取时间对乌蔹莓中黄酮提取率有显著
影响，而对多糖有极显著影响，结合表 8，提取时间应设
为 1 h;提取温度对黄酮提取率有显著影响，而对多糖影响
不显著，结合表 8，提取温度应设为 100 ℃;料液比对多
糖提取率有极显著影响，而黄酮影响不显著，结合表 8，
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图 3 提取时间对黄酮和多糖提取率的影响
料液比应设为 1 100。综上所述，乌蔹莓最佳提取工艺为提
取时间 1 h，提取温度 100 ℃，料液比 1 ∶ 100。
表 2 乌蔹莓正交试验结果
试验号
A提取时
间 /h
B提取温
度 /℃
C料
液比
黄酮提取
率 /%
多糖提取
率 /%
1 1 1 1 0. 98 1. 69
2 1 2 2 1. 58 3. 22
3 1 3 3 2. 41 3. 26
4 2 1 2 1. 55 4. 65
5 2 2 3 2. 56 5. 13
6 2 3 1 2. 86 3. 26
7 3 1 3 1. 41 5. 09
8 3 2 1 1. 75 3. 83
9 3 3 2 1. 96 4. 69
表 3 华中乌蔹莓正交试验结果
试验号
D提取时
间 /h
E提取
温度 /℃
F料
液比
黄酮提
取率 /%
多糖提
取率 /%
1 1 1 1 5. 17 4. 11
2 1 2 2 6. 96 6. 68
3 1 3 3 6. 32 6. 25
4 2 1 2 5. 44 5. 81
5 2 2 3 7. 39 6. 88
6 2 3 1 6. 81 5. 73
7 3 1 3 5. 31 4. 99
8 3 2 1 6. 57 5. 34
9 3 3 2 6. 24 6. 26
表 4 鸟足乌蔹莓正交试验结果
试验号
G提取时
间 /h
H提取
温度 /℃
I料
液比
黄酮提取
率 /%
多糖提取
率 /%
1 1 1 1 3. 41 5. 54
2 1 2 2 4. 01 7. 19
3 1 3 3 3. 82 7. 02
4 2 1 2 3. 65 6. 89
5 2 2 3 4. 06 7. 96
6 2 3 1 3. 76 5. 94
7 3 1 3 3. 43 7. 58
8 3 2 1 3. 64 6. 94
9 3 3 2 3. 49 7. 39
表 5 乌蔹莓方差分析
因素 因变量 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
A 黄酮提取率 0. 827 2 0. 300 39. 984 *
多糖提取率 5. 959 2 14. 652 628. 049 ＊＊
B 黄酮提取率 1. 825 2 0. 628 88. 197 *
多糖提取率 0. 172 2 0. 059 18. 171 —
C 黄酮提取率 0. 282 2 0. 038 13. 632 —
多糖提取率 4. 136 2 0. 529 435. 888 ＊＊
误差 黄酮提取率 0. 021 2 0. 010 —
多糖提取率 0. 009 2 0. 05 —
注:* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01，表 6 ～ 7 同
表 6 华中乌蔹莓方差分析
因素 因变量 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
D 黄酮提取率 0. 426 2 0. 213 4. 450 —
多糖提取率 0. 606 2 3. 303 121. 240 ＊＊
E 黄酮提取率 4. 367 2 2. 184 45. 608 *
多糖提取率 3. 049 2 1. 525 609. 880 *
F 黄酮提取率 0. 041 2 0. 021 0. 433 —
多糖提取率 2. 421 2 1. 210 484. 120 ＊＊
误差 黄酮提取率 0. 096 2 0. 048 —
多糖提取率 0. 005 2 0. 002 —
表 7 鸟足乌蔹莓方差分析
因素 因变量 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
G 黄酮提取率 0. 149 2 0. 075 15. 213 —
多糖提取率 0. 778 2 0. 389 130. 627 ＊＊
H 黄酮提取率 0. 248 2 0. 124 25. 333 *
多糖提取率 0. 830 2 0. 415 139. 358 ＊＊
I 黄酮提取率 0. 043 2 0. 022 4. 435 —
多糖提取率 3. 070 2 1. 535 515. 489 ＊＊
误差 黄酮提取率 0. 010 2 0. 005 —
多糖提取率 0. 006 2 0. 003 —
表 8 Duncan多重比较结果
因素 水平
黄酮提取率 /% 多糖提取率 /%
1 2 3 1 2 3
A /h 0. 5 1. 657 2. 723
1 2. 323 4. 347
1. 5 1. 707 4. 537
B /℃ 80 1. 313 3. 810
90 1. 963 4. 060
100 2. 410 3. 737
C 1 ∶ 60 1. 697 2. 927
1 ∶ 80 1. 863 4. 187
1 ∶ 100 2. 127 4. 493
D /h 1 6. 040 5. 680
1. 5 6. 150 6. 140
2 6. 547 5. 530
E /℃ 80 5. 307 4. 970
90 6. 973 6. 300
100 6. 457 6. 080
F 1 ∶ 60 6. 183 5. 060
1 ∶ 80 6. 213 6. 250
1 ∶ 100 6. 340 6. 040
G /h 0. 5 3. 520 6. 583
1 3. 747 6. 930
1. 5 3. 823 7. 303
H /℃ 80 3. 497 6. 670
90 3. 903 7. 363
100 3. 690 6. 783
I 1 ∶ 60 3. 303 6. 140
1 ∶ 80 3. 717 7. 157
1 ∶ 100 3. 770 7. 520
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由表 6 可知，提取时间对华中乌蔹莓中黄酮提取率的
影响不显著，而对多糖有极显著影响，结合表 8，提取时
间应设为 1. 5 h;提取温度对黄酮和多糖提取率均有显著影
响，结合表 8，提取温度应设为 100 ℃;料液比对黄酮提
取率影响不显著，而对多糖有极显著影响，结合表 8，料
液比应设为 1 ∶ 100。综上所述，华中乌蔹莓最佳提取工艺
为提取时间 1. 5 h，提取温度 100 ℃，料液比 1 ∶ 100。
由表 7 可知，提取时间对鸟足乌蔹莓中黄酮提取率的
影响不显著，而对多糖有极显著影响，结合表 8，提取时
间应设为 1. 5 h;提取温度对黄酮提取率有显著影响，而对
多糖有极显著影响，结合表 8，提取温度应设为 90 ℃;料
液比对黄酮提取率影响不显著，而对多糖提取率有极显著
影响，结合表 8，料液比应设为 1 ∶ 100。综上所述，鸟足
乌蔹莓最佳提取工艺为提取时间 1. 5 h，提取温度 90 ℃，
料液比 1 ∶ 100。
2. 3 验证试验 精密称取 3 种乌蔹莓各 0. 4 g，在其相应
的最优提取工艺下进行验证，平行 3 次，结果见表 9。由
表可知，3 种乌蔹莓中黄酮和多糖提取率均大于正交试验
中最高值，即该最佳提取工艺稳定可行。
表 9 最优提取工艺验证试验结果 (n =3)
药材 黄酮提取率 /% ＲSD /% 多糖提取率 /% ＲSD /%
乌蔹莓 2. 88 0. 01 5. 21 0. 06
华中乌蔹莓 7. 45 0. 12 7. 01 0. 07
鸟足乌蔹莓 4. 17 0. 15 8. 13 0. 05
由于提取温度和料液比偏高，在实际工业应用中能耗
较大，故最终选取料液比 1 ∶ 70，提取温度 80 ℃，提取时
间 1. 5 h进行试验，结果见表 10。由表可知，该条件下除
乌蔹莓中黄酮提取率相对较低外，其余均和最优提取工艺
相当，故该工艺具有可行性。
表 10 最终提取工艺验证试验结果 (n =3)
药材
黄酮提取率 /
%
与最优提取
工艺比值%
多糖提
取率 /%
与最优提取
工艺比值 /%
乌蔹莓 2. 41 83. 68 4. 75 91. 17
华中乌蔹莓 6. 79 91. 14 6. 47 92. 30
鸟足乌蔹莓 3. 77 90. 40 7. 75 95. 32
3 结论
由单因素试验和正交试验法可知，提取温度对黄酮提
取率影响较大，而料液比对多糖提取率影响较大，故在工
业生产中针对上述 3 种乌蔹莓属植物时，若单一开发黄酮
应注意对提取温度的控制，而单一开发多糖应注意对料液
比的控制。本实验发现，提取条件基本相同的情况下，华
中乌蔹莓与鸟足乌蔹莓中黄酮和多糖的提取率均高于乌蔹
莓，应加以关注并优先考虑。
致谢 湖北省林学一级学科硕士点 (湖北民族学院)
对本研究的资助。
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2016 年 10 月
第 38 卷 第 10 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
October 2016
Vol． 38 No． 10