全 文 ：收稿日期:2003-04-05
＊为本校 2000 级植物工程专业学生。
爬山虎多糖提取与含量的测定
董爱文 赵虹桥 施立毛＊ 何 征＊ 彭钧辉＊
(武陵高等专科学校 ,湖南 张家界 427000)
摘 要 建立石油醚去脂—80%乙醇去杂—热水提取—乙醇沉淀—氯仿 、正丁醇去蛋白质—活性碳去色素的提取
工艺 ,从爬山虎中提取多糖 , 用蒽酮—硫酸法比色测定多糖的含量 , 研究结果表明 , 此方法简便 、供试液显色稳定 、
重现性较好 ,回收率为:99.36%, RSD=5.08%,熟果 、茎 、叶的多糖含量为:4.68%、22.71%、11.71%。
关键词 爬山虎;多糖 , 蒽酮—硫酸法;含量测定
Polysaccharide Extraction and Content Measuring of Parthenocissus tricuspidata
Dong Aiwen , Zhao Hongqiao , Shi Limao＊ , He Zheng＊ , Beng Junhui＊
(Department of Biology , Wuling Technical College , Zhangjiajie 427000)
Abstract By the technique of eliminaing fat from Petroleum ether-ridding impurity from 80%ethanol-extract-
ing with hot water-precipitating by ethanol-ridding protein-ridding pigment from active carbon , and polysaccha-
ride is extracted from Parthenocissus tricuspidate Plach , polysaccharide content is measured by way of anthrone-
sulphuric acid.The research shows that the method is easy to operate , the color of tried solid appears stable
and well , the recycle rate reaches 99.36%, RSD equals 5.08%, polysaccharide content of ripe fruits , stem
and leave reach 4.68%,22.71%and 11.21% respectively.
Key words Parthenocissus tricuspidate Plach;Polysaccharide;Anthrone-sulphuric acid method;Content
measuring
爬山虎(爬墙虎 、地锦)(Parthenocissus tricuspidate
Plach)为葡萄科爬山虎多年生落叶木质藤本植物 ,
其根 、茎可入药 , 具有破淤血 、清肿毒的功效[ 1 , 2] 。
多糖是爬山虎中重要营养成份之一 ,近年来 ,大量的
药理和临床研究表明 ,多糖是一种免疫调节剂 ,它能
激活免疫细胞 ,提高机体的免疫功能 ,有的还具有抗
病毒 、抗衰老作用[ 3] 。松本保久等研究发现滑菇子
实体多糖对小鼠肉瘤抑制率为86.5%[ 4] 。为了比
较 、评价以多糖为有效成份的药材和药品质量 ,对多
糖含量测定方法研究就具有重要的意义 。对爬山虎
中多糖含量的测定尚未见有报道。本文用精制爬山
虎果多糖测得爬山虎多糖对葡萄糖的换算因子 ,用
蒽酮 —硫酸比色法测得爬山虎熟果 、茎 、叶中多糖的
含量 ,为武陵山区中草药材的综合开发利用和研究
提供一些参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
仪器:电子天平 AEG-220(日)岛津 、旋转蒸发
仪 RE-52(日)、恒温水浴锅 133-220(日)、低温冰
柜MAF-492AT(日)三洋 、脂肪抽出装置SF -6(日)
三绅 、电热恒温真空干燥箱 DP-3(日)岛津 、紫外可
见分光光度计 UV-160(日)岛津 、752 分光光度计
(上海)、离心机 LD5-2A(北京)。
试剂:蒽酮 、浓硫酸 、无水乙醇 、丙醇 、石油醚(60
～ 90℃)、乙醚 、氯仿 、正丁醇等以上试剂均为国产分
析纯。
材料:试材于 2001年 10月采集于本校校园内 ,
用水洗净置室温下(15℃)左右 ,晾干后装于食品袋
中 ,于-25℃冰柜中保存待用。
1.2 实验方法
1.2.1 爬山虎多糖的提取与精制
称取已干燥的爬山虎果 、茎 、叶粉末各60 g ,置
脂肪抽出装置中 ,加入石油醚(60 ～ 90℃)250 mL ,
—55—
第 23 卷第 1期
2004 年 2月 中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant Resources Vol.23 No.1Feb.2004
90℃回流脱脂 。抽滤 、滤渣挥干溶剂后 ,加入 80%
乙醇 90℃回流提取 2次 ,每次1.5 h ,离心取滤渣 ,挥
干溶剂 ,滤渣加蒸馏水400 mL沸水浴回流提取1 h ,
离心 ,取上清液 ,滤渣再加蒸馏水300 mL提 1次 ,合
并上清液 。上清液用氯仿—正丁醇液(V∶V=4∶1)
轻摇 ,静置取多次 ,除去蛋白质 ,过滤;滤液中加入粉
末活性碳 1%(相对多糖干物质)60℃保温30 min ,抽
滤;滤液中加入乙醇 ,使乙醇浓度达 85%,放置 4℃
冰箱中过夜 。离心分离 ,沉淀依次用 95%无水乙
醇 、丙醇 、乙醚各洗 3次 ,真空干燥至恒重 ,即得精制
爬山虎果 、茎 、叶多糖 ,密封保存在 60℃下备用 。
1.2.2 标准曲线的绘制
1.2.2.1 标准溶液的配制
精密称取 105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品
0.2 000 g ,置100 mL容量瓶中 ,加蒸馏水溶解并稀释
至刻度;摇匀 ,制成 2.000 mg/mL 的标准溶液 ,然后
分别移取 0.1 、0.3 、0.5 、0.8 、1.0 mL标准溶液。置于
10 mL容量瓶中;以蒸馏水定容至刻度 ,摇匀 、配成系
列标准溶液。
1.2.2.2 蒽酮—硫酸试液的配制
称取 0.200 0 g 蒽酮和 1.000 g 硫脲 , 加入
100 mL浓硫酸 ,置于棕色瓶中 ,混合摇匀置暗处备用
(现配现用)。
1.2.2.3 标准曲线的绘制
分别准确移取系列标准溶液1 mL于具塞试管中
(各平行 3份),以1 mL蒸馏水作空白 ,各加入5 mL蒽
酮试剂(立即摇匀 ,置冰水浴中),加完后一起沸水浴
8 min ,取出流水冷却 ,室温静置10 min ,于620 nm处
测定吸光值 ,以吸光值(A)对葡萄糖浓度(C)作回归
处理 ,得回归方程:A=3.359C -0.011 19 , r=0.999
8。
1.2.3 换算因子的测定
精密称取 60℃干燥至恒重的精制果多糖10 mg ,
置100 mL容量瓶中 ,加蒸馏水溶解并稀释至刻度 ,摇
匀。精密吸取此液1.0 mL置10 mL容量瓶中 ,加蒸馏
水稀释至刻度摇匀作贮备液 。精密吸取贮备液
2.0 mL ,用标准曲线项的方法测吸光值 ,从回归方程
中求出多糖供试液中葡萄糖浓度 ,按下式计算 ,测得
换算因子 f=4.435。
换算因子 f=w/c×d[w为多糖含量(mg)、c多糖稀
释液中葡萄糖浓度mg/mL 、d为多糖的稀释因素]
1.2.4 样品中爬山虎多糖含量测定
1.2.4.1 样品溶液的制备
精密称取茎 、叶 、果干粉各0.5 g(过 60目筛 、各
平行3份)分别置三角瓶中 ,加 80%乙醇30 mL ,80℃
水浴回流提取1 h ,趁热过滤 , 残渣用热乙醇洗涤
(8 mL×3 次),残渣连同滤纸置三角瓶中 ,以40 mL
蒸馏水 100℃水浴 ,提1 h ,趁热过滤 ,残渣用热水洗
涤(8 mL×3次),洗液并入滤液中 ,置冷后 ,定容于
100 mL容量瓶中 ,摇匀备用 。
1.2.4.2 样品中爬山虎多糖含量测定
精密吸取样品溶液 2.0 mL ,同 1.2.2.3项方法
操作 ,测定供试液中葡萄糖含量。按下式计算样品
中多糖的含量:多糖含量(%)=C.D.F/w ×100[ C
为供试液中葡萄糖浓度(mg/mL)、D 为供试液的稀
释因素 、F 为换算因子 、W供试样品重量(mg)] 。其
结果见表1 、表 2 、表 3。
表 1 爬山虎果中多糖含量测定结果
项 目 1 2 3
W(mg) 500.1 499.6 501.0
C(mg/mL) 0.105 15 0.104 25 0.108 72
含量(%) 4.641 4 4.606 3 4.790 4
平均 4.68%
RSD 4.75%(n=3)
表 2 爬山虎茎中多糖含量测定结果
项 目 1 2 3
W(mg) 500.3 502.1 501.4
C(mg/mL) 0.509 0.521 5 0.515
含量(%) 22.49 22.93 22.70
平均 22.71%
RSD 1.98%(n=3)
表 3 爬山虎叶中多糖含量测定结果
项 目 1 2 3
W(mg) 502.1 500.5 501.2
C(mg/mL) 0.259 4 0.256 1 0.257 9
含量(%) 11.404 6 11.295 5 11.359 0
平均 11.35%
RSD 1.01%(n=3)
1.2.5 重现性实验
精密称取过 60 目筛的果粉0.5 g 5 份 ,按 1.2.
4.1项方法同时制取 5份样品溶液 。精密吸取样品
—56—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 23 卷
液2.0 mL ,同 1.2.4.2项方法测定吸光值 ,计算其多
糖含量。结果见表 4
表 4 爬山虎多糖含量测定重现性试验结果
样品号 1 2 3 4 5 平均
多糖含量(%) 4.718 9 4.696 8 4.687 3 4.654 9 4.636 4 4.678 9
RSD 2.84%(n=5)
1.2.6 稳定性实验
精密吸取 1.2.4.1项中样品溶液2.0 mL于具塞
试管中 ,按 1.2.4.2项方法测定吸光值(茎的提取液
稀释10倍),每隔1 h测定1次 ,连续 4次考察其稳定
性 ,结果见表 5
表 5 爬山虎多糖稳定性试验结果
时间(h) 0 1 2 3 4 RSD
果的吸光值 0.342 0.343 0.343 0.342 0.340 1.17%(n=5)
茎的吸光值 0.164 0.163 0.164 0.165 0.162 2.69%(n=5)
叶的吸光值 0.849 0.853 0.852 0.847 0.844 1.65%(n=5)
1.2.7 回收率的测定
精密称取果粉 0.5 g 3 份 , 各加入精制多糖
20 mg ,按 1.2.4.1项样品溶液的制备和 1.2.4.2项
方法测定吸光值 。计算回收率 ,结果见表6
表 6 加样回收率测定
样品号 1 2 3
取样量(g) 0.5058 0.5023 0.5012
加入精制多糖量(g) 0.024 2 0.023 2 0.020 1
吸光度 0.705 0.703 0.644
回收率(%) 97.73% 101.90% 98.49%
平均回收率(%) 99.36%
RSD 5.08%n=3
2 结果讨论
(1)本文首先用 80%乙醇回流以除去单糖 、低
聚糖 、生物碱 、苷类及其它醇溶性的干扰成分防止其
成为多糖中的杂质 ,再用水提取多糖成分 。
(2)多糖类化合物是多种中草药的有效成份之
一 ,某些多糖还有抗癌 、抗炎 、抗病毒 、提高免疫力等
作用[ 5] ,而多糖多无法直接测定 ,本文利用多糖在硫
酸的作用 ,水解成单糖分子 ,并迅速脱水生成糖醛衍
生物 ,然后与蒽酮生成深绿色化合物 ,以比色法测定
其含量 ,结果表明 ,此方法简便 ,供试液显色稳定 、重
现性好 ,适合中草药中多糖含量的测定。
(3)在多糖提取过程中 ,去除脂类 ,不能单以时
间为准 ,而应以提取剂回流出来的颜色变化为准 ,因
为不同材料所含脂类的多少和种类不同 ,去除的时
间就会不同 。
(4)在多糖提取液中除去蛋白质后经UV-160A
紫外光谱检测在 260 ～ 280 nm处未见到核酸和蛋白
质的吸收峰 ,而在280 nm处检测 ,吸收率低于 0.03 ,
说明所提多糖液中基本不含蛋白质杂质。
(5)醇沉下来的白色多糖 ,经硫酸—苯酚颜色反
应为棕红色 ,与硫酸—蒽酮试剂反应呈深绿色 ,证明
所提物质为多糖[ 6] 。
参考文献:
[ 1] 李 颜.崂南几种常见野生攀援植物及利用.特种经济动植
物, 2001 , 4(10):18-19.
[ 2] 尹祖棠 ,刘永生.识别园林植物的一把钥匙.北京:中国林业
出版社 , 1990.5.
[ 3] 刘卫军 ,李书平 ,何云庆 ,等.植物多糖抗肿瘤活性研究进展.
中国野生植物资源 , 1997 ,16(1):1-3.
[ 4] 松本保久.制癌剂としてのサルノコシカケについて.汉方
の研究 , 1976 ,(11):419.
[ 5] 中国科学院上海药物研究所.中草药有效成份提取与分离.
上海:上海科学技术出版社.1983:7.
[ 6] 李雪华 ,龙盛京.木耳多糖的提取与抗活性氧的研究.食品科
学, 201 , 22(3):26-29.
(上接第 49页)
参考文献:
[ 1] 中国科学院植物研究所主编.中国高等植物图鉴 , 第二册.北
京:科学出版社 , 1972 , 162.
[ 2] 中国植物志编缉委员会.中国植物志 , 35卷 ,第二分册.北京:
科学出版社 ,1979 , 70-72.
[ 3] 中国树木志编辑委员会.中国树木志 ,第二卷.北京:中国林业
出版社 ,1985 , 1900～ 1999.
[ 4] 侯伯鑫 ,童新旺 ,林 峰 ,等.红花 木品种资源的研究.中国野
生植物资源 , 2002 ,21(6):15-17.
[ 5] 林昌梅 ,黄瑞康 ,黄程前.红花 木栽培.长沙:湖南科学技术出
版社 , 2001 , 1-5.
[ 6] 唐前瑞.红 木遗传多样性及其叶色变化的生理生化研究.湖
南农业大学 , 2001,博士论文.
[ 7] 宁季渊 ,谭子雄.红花 木的生物学特性及栽培.湖南园林 ,
1981, (2):29-31.
[ 8] 沙 石.红 木扦插试验报告.湖南园林 , 1983(1):6-11.
—57—
第1 期 董爱文等:爬山虎多糖提取与含量的测定