全 文 ：基金项目:青海省重大科技攻关项目(2004-N-103-02)
作者简介:吴艳 ,女 ,硕士研究生　　＊通讯作者:李晓波 ,女 ,教授 ,博士生导师　　Tel:(021)34204806　　E-mail:xbli@sjtu.edu.cn
·论　著·
青海产不同海拔唐古特大黄的遗传多样性分析
吴艳 1 , 格日力2 , 魏全嘉 2 , 屠鹏飞 3 , 王戌梅 1 , 李晓波 1＊ (1.上海交通大学药学院 , 上海 200240; 2.青海大学高原医学
研究中心 , 西宁 810001;3.北京大学中医药现代研究中心 , 北京 100083)
摘要:目的　探讨海拔高度对唐古特大黄遗传多样性的影响 , 为进一步研究其品质提供参考。方法　采用 (intersimplese-
quencerepeat, ISSR)分子标记技术 , 从 97个 ISSR引物中筛选出 14个多态性引物用于不同海拔唐古特大黄样品的总 DNA
扩增 , 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果 , GIS凝胶图像处理系统统计电泳结果 , POPGENE32分析遗传多样性 , MVSP构建
UPGMA聚类树。结果　从 14个 ISSR引物中共扩增出 213个位点 , 其中多态性位点 208个 , 多态位点百分率 (PPB)为
97.7%, 观测等位基因数 (Na)1.976 5, 有效等位基因数 (Ne)1.533 5, Nei′s基因多样性 (He)32.0%, Shannon′s指数
(Ⅰ )0.487 5。大黄样品个体平均多态位点数随海拔的升高而上升。 UPGMA聚类分析结果将所有大黄样品分为 3类:海拔
3 000 m以下的样品聚为一类;海拔 3 000 m以上的样品也聚为一类;海拔 3 000m的样品单独聚为一类。结论 　唐古特大
黄的遗传多样性随海拔升高而上升。在进行青海省不同海拔唐古特大黄的化学成分分析时 , 可将 3 000 m海拔作为研究其
化学成分差异的参照分界线 , 为进一步评价其品质提供参考依据。
关键词:唐古特大黄;海拔;ISSR;遗传多样性;遗传结构
中图分类号:R931　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494 (2008)21-1608-04
GeneticDiversityAnalysisofRheumtanguticumMaxim.exBalf.UnderDiferentAltitudesinQinghai
WUYan1 , GERi-li2 , WEIQuan-jia2 , TUPeng-fei3 , WANGXu-mei1 , LIXiao-bo1＊(1.SchoolofPharmacy, Shanghai
JiaoTongUniversity, Shanghai200240, China;2.ResearchCenterforHighAltitudeMedicine, QinghaiUniversity, Xining810001,
China;3.ModernResearchCenterofTraditionalChineseMedicine, PekingUniversityHealthScienceCenter, Beijing100083, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToinvestigatethegeneticdiversityofRheumtanguticumMaxim.exBalf.distributedindiferentaltitude
regions.METHODS　14Primersscreenedfrom97ISSRprimerswereusedforInterSimpleSequenceRepeat(ISSR)amplificationof
totalDNAsamplesofR.tanguticum.TheISSR-PCRproductsweredetectedbyagarosegelelectrophoresisandTanonGISgel
documentationsystem.POPGENE32wasusedtocalculatethegeneticdiversityparametersandMVSPwasusedtoclusterthesamples.
RESULTS　 213DiscernibleDNAfragmentswereproduced, ofwhich208 documentations(PPB=97.7%)werepolymorphicloci.
Theobservednumberofalleles(Na)was1.976 5.Effectivenumberofalleles(Ne)was1.533 5.Nei′sgenediversity(He)was
32.0%.Shannon′sinformationindex(Ⅰ )was0.487 5.TheindividualmeanISSRsiteswereincreasedwiththeraiseofaltitude.All
thesamplesweredividedintothreetypesbyclusteranalysis(UPGMA).Samplesfromaltitude3 000 m, belowandabove3 000 m
weregroupedrespectively.CONCLUSION　ThegeneticdiversityofR.tanguticumwasincreasedwiththeraiseofaltitude, andthe
criticalaltitudeofclusteringis3 000m, whichmaybealsousedasthecriticallineinitschemicalanalysisforfurtherqualitystudy.
KEYWORDS:Rheumtanguticum;altitude;intersimplesequencerepeat;geneticdiversity;geneticstructure
　　大黄为蓼科 (Polygonaceae)大黄属 (Rheum)
多年生草本植物 [ 1] , 普遍分布于亚洲海拔 1 000 ～
5 200 m的高山草地 、 灌木丛缘潮湿冷凉地带 , 其
中唐古特大黄 (R.tanguticumMaxim.exBalf.)分
布于甘肃 、 青海及青海与西藏交界一带海拔
2 300 ～ 4 200m的高山沟谷[ 2] 。唐古特大黄是大黄
药材的主要来源 , 其有效成分主要是蒽醌类衍生
物 , 如大黄酸 、大黄素 、大黄酚 、芦荟大黄素和大
黄素甲醚等 , 具有泻下 、抗菌 、 抗炎 、 抗肿瘤 、 降
血脂 、保肝利胆等药理作用 [ 3] , 为临床常用中药。
目前 , 有关唐古特大黄的的研究已涉及多个方
面[ 3-4] , 但关于不同海拔唐古特大黄的遗传多样性
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研究未见报道。本实验采用 ISSR分子标记技术 [ 5]
首次分析不同海拔唐古特大黄的遗传差异 , 以探讨
其遗传多样性水平与海拔的关系 , 为其化学成分分
析及品质评价提供依据。
1　材料与仪器
1.1　实验材料
实验样品为 2006年 9月采集于青海省不同海
拔地区 , 经魏全嘉教授鉴定为唐古特大黄和掌叶大
黄 (表 1)。新鲜叶片洗净后用硅胶快速干燥 , 密
封袋封装保存。标本保存于上海交通大学药学院中
药品质与活性物质组实验室。
表 1　采自青海省不同海拔地区的大黄实验材料
Tab.1　SamplesunderdiferentaltitudesinQinghai
No. Species Origin Altitude/m
Colecting
date
No.of
sample
01 R.tanguticumMaxim.exBalf. Guoluo 4 100 2006.09.08 Rta-1
02 R.tanguticumMaxim.exBalf. Guoluo 3 400 2006.09.08 Rta-2
03 R.tanguticumMaxim.exBalf. Guoluo 4 500 2006.09.09 Rta-3
04 R.tanguticumMaxim.exBalf. Guoluo 3 850 2006.09.09 Rta-4
05 R.tanguticumMaxim.exBalf. Guoluo 3 100 2006.09.09 Rta-5
06 R.tanguticumMaxim.exBalf. Xianmi 2 700 2006.09.13 Rta-6
07 R.tanguticumMaxim.exBalf. Xianmi 2 800 2006.09.13 Rta-7
08 R.tanguticumMaxim.exBalf. Qilian 3 290 2006.09.14 Rta-8
09 R.tanguticumMaxim.exBalf. Wulan 3 600 2006.09.15 Rta-9
10 R.palmatumL. Minhe 2 540 2006.09.16 Rpa-10
11 R.tanguticumMaxim.exBalf. Tongren 3 000 2006.09.17 Rta-11
1.2　试剂与仪器
ISSR引物 (上海生工生物工程技术有限责任公
司合成)共 97条;2×TaqPlusPCRMasterMix和
200bpDNAladder(北京天为时代科技有限公司);
DNA提取试剂盒 (Qiagen, Germany)、 Eppendorf
PCR扩增仪 (Mastercyclepersonal)、 Eppendorf离心
机 (Centrifuge5415)、 凝胶成像分析系统 (Tanon
GIS2010)、 水平电泳仪 (TanonEPS100)、 各型号
微量移液器均来自 Eppendorf公司。
2　实验方法
2.1　基因组 DNA提取
分别称取 0.1 g唐古特大黄或掌叶大黄干叶
片 , 置液氮中快速碾碎 , 用 DNeasyPlantMiniKit
试剂盒提取 DNA(操作按试剂盒要求进行)。 1%
琼脂糖凝胶检测 DNA的质量 , 稀释 10倍备用。
2.2　ISSR-PCR及产物检测
2.2.1　25 μL反应体系 　10 μmol· L-1引物 , 1
μL;2×TaqPlusPCRMasterMix, 12.5 μL;模板
DNA, 1 μL;ddH2O。
2.2.2　扩增程序　 94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性
1min, 52 ℃退火 1min, 72℃延伸 2min, 39个循
环;循环结束后于 72 ℃延伸 10 min, 4 ℃保存。
PCR产物在含 EB的 2%琼脂糖凝胶中电泳分离 ,
以 200bpDNALadder作为标准相对分子质量对照 ,
TanonGIS2010凝胶成像系统观察 、照相。
2.3　数据处理
采用 TanonGIS2010凝胶图像处理系统对 ISSR
图谱统计分析 。对每一个特定引物 , 将扩增出的每
一个条带看作一个独立的检测位点 , 有条带记为
1, 无条带记为 0。利用 POPGENE32软件进行遗
传参数分析 , 分别计算多态位点百分率 (PPB)、
观测等位基因数 (Na)、 有效等位基因数 (Ne)、
Nei′s基因多样性 (He)、 Shannon′s信息指数
(I), Nei′s遗传相似度 (F)和遗传距离 (D)。利
用 MVSP软件按 Nei＆Li′s相似系数公式 , 进行
UPGMA (Unweighted Pair Group Method with
ArithmeticMean, UPGMA)聚类。
3　结果及分析
3.1　唐古特大黄的遗传多样性
从 97个 ISSR引物中筛选到 14个扩增条带清
晰的引物 (表 2), 用于大黄 DNA样品的 ISSR-
PCR扩增 , 共产生 213个位点 , 片段大小分布在
200 ～ 2 700 bp之间 , I18引物扩增结果见图 1。利
用 POPGENE32软件分析 , 结果为多态性位点 208
个 , 多态位点百分率 (PPB)97.7%, 观测等位基
因数 (Na) 1.976 5, 有效等位基因数 (Ne)
1.533 5, Nei′s基 因 多 样 性 (He) 32.0%,
Shannon′s信息指数 (Ⅰ)0.487 5。
3.2　唐古特大黄的遗传结构
为了分析各品种之间的遗传分化程度 , 用
POPGENE32软件计算 Nei′s遗传相似度 (I)和遗
传距离 (D), 所有大黄样品的 I值分布在
0.333 3 ～ 0.833 3之间 , D值分布在 0.182 3 ～
0.980 8之间 (表 3)。其中 Rta-5和 Rta-2、 Rta-3、
Rta-4、 Rta-8间的遗传相似度最大 , 为 0.833 3;
Rta-6与 Rta-11的遗传相似度最小 , 为 0.333 3。
将所有样品基于引物 I22 、 P1 、 P2的扩增结果进
行 UPGMA聚类 , 得树状图 (图 2)。在相似系数
0.57时可将 11份大黄样品分为 3类:第 Ⅰ类仅
Rta-11一种样品;第 Ⅱ类包括 Rta-6、 Rta-7、 Rpa-
10 3种样品;第 Ⅲ类包括 Rta-1、 Rta-2、 Rta-3、
Rta-4、 Rta-5、 Rta-8 、 Rta-9共 7种样品。
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表 2　不同海拔唐古特大黄 ISSR-PCR扩增结果
Tab.2　 ISSR-PCRresultsofRheum tanguitcum Maxim.ex
Balf.underdiferentaltitudes
Primer Primersequence(5′-3′) Totalsite/unit
Polymorphic
site/unit
Polymorphic
siterate/%
I17 AGAGAGAGAGAGAGAGCA 16 16 100
I18 GAGAGAGAGAGAGAGACT 18 17 94
I19 GAGAGAGAGAGAGAGATT 14 14 100
I20 GAGAGAGAGAGAGAGACC 15 14 93
I22 GAGAGAGAGAGAGAGACG 12 12 100
I39 GAGAGAGAGAGAGAGAGC 17 17 100
I40 AGAGAGAGAGAGAGAGCTT 18 18 100
P1 AGAGAGAGAGAGAGAGT 12 11 92
P2 AGAGAGAGAGAGAGAGCC 16 16 100
P5 GAGAGAGAGAGAGAGAC 14 14 100
P13 AGAGAGAGAGAGAGAGGT 19 18 95
P22 GAGAGAGAGAGAGAGAT 14 14 100
P34 AGAGAGAGAGAGAGAGCC 16 16 100
P35 GCGACACACACACACA 12 12 100
图 1　不同海拔唐古特大黄基于引物 I18的 ISSR-PCR扩增
结果
M-200bpDNALadder;01 ～ 11-供试材料编号;C-空白对照
Fig.1　ISSR-PCR ResultofRheum tanguitcum Maxim.ex
Balf.underdiferentaltitudesbasedonprimerI18
M-200bpDNAladder;01 ～ 11-samplenumbers;C-control
图 2　唐古特大黄样品的 Nei＆Li′s遗传相似度 UPGMA聚
类图
Fig.2　Dendrogram ofRheum tanguitcum Maxim.exBalf.
basedontheNei＆Li′ssimilaritycoefficientandtheUPGMA
clusteringmethod
随着海拔的升高 , 个体的平均 ISSR条带数增
多 , 每个个体平均 ISSR带数呈现出随海拔高度的
上升而递增的趋势 。 2 500 ～ 3 000m处的个体平均
多态位点数基本一致 , 从 3 000m开始个体平均多
态性位点数逐渐增多 (图 3)。
图 3　唐古特大黄个体平均 ISSR条带数与海拔的关系
Fig.3　 RelationshipbetweentheindividualmeanISSRsiteof
RheumtanguitcumMaxim.exBalf.andaltitude
表 3　不同海拔唐古特大黄的 Nei′s遗传距离 (表格上方)和遗传相似系数 (表格下方)
Tab.3　Nei′sgeneticdistance(abovediagonal)andgeneticidentity(belowdiagonal)ofRheumtanguitcumMaxim.exBalfunder
differentaltitudes
Rta-1 Rta-2 Rta-3 Rta-4 Rta-5 Rta-6 Rta-7 Rta-8 Rta-9 Rpa-10 Rta-11
Rta-1 - 0.405 5 0.287 7 0.405 5 0.405 5 0.780 2 0.693 1 0.539 0 0.405 5 0.539 0 0.470 0
Rta-2 0.666 7 - 0.287 7 0.287 7 0.182 3 0.613 1 0.539 0 0.287 7 0.287 7 0.539 0 0.980 8
Rta-3 0.750 0 0.750 0 - 0.087 0 0.182 3 0.344 8 0.539 0 0.405 5 0.405 5 0.405 5 0.780 2
Rta-4 0.666 7 0.750 0 0.916 7 - 0.182 3 0.470 0 0.539 0 0.539 0 0.539 0 0.405 5 0.980 8
Rta-5 0.666 7 0.833 3 0.833 3 0.833 3 - 0.344 8 0.405 5 0.405 5 0.405 5 0.539 0 0.980 8
Rta-6 0.458 3 0.541 7 0.708 3 0.625 0 0.708 3 - 0.470 0 0.613 1 0.613 1 0.344 8 1.098 6
Rta-7 0.500 0 0.583 3 0.583 3 0.583 3 0.666 7 0.625 0 - 0.405 5 0.405 5 0.405 5 0.470 0
Rta-8 0.583 3 0.750 0 0.666 7 0.666 7 0.833 3 0.625 0 0.666 7 - 0.4055 0.693 1 0.780 2
Rta-9 0.666 7 0.750 0 0.666 7 0.583 3 0.666 7 0.541 7 0.666 7 0.666 7 - 0.405 5 0.613 1
Rpa-10 0.583 3 0.583 3 0.666 7 0.666 7 0.583 3 0.708 3 0.666 7 0.500 0 0.666 7 - 0.780 2
Rta-11 0.625 0 0.375 0 0.485 3 0.375 0 0.375 0 0.333 3 0.625 0 0.458 3 0.541 7 0.485 3 -
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4　讨　论
4.1　唐古特大黄的遗传多样性
采用 ISSR标记检测到的大黄样品总的多态位
点百分率为 97.7%, Nei′s基因多样性 (He)
32.0%, 遗传多样性水平较高 , 说明海拔高度对唐
古特大黄的基因组有显著的影响。这是由于样品分
布区的海拔不同 , 生态环境各异 , 在各自环境选择
过程中 , 所具的不同适应性遗传性状被分别保存下
来的结果。不同海拔地区的环境条件差异明显 , 主
要为光照和气温差异 , 而这两个因素对大黄的正常
生长起着关键的作用 , 另外 , 不同海拔地区的土壤
条件对植株的生长也可能产生较大影响 , 所以植株
对海拔的变化应该是相当敏感的。
4.2　海拔对唐古特大黄遗传多样性的影响
聚类结果可以看出 , 海拔 3 000 m成为大黄样
品聚类的分界 , 海拔 3 000 m以下的唐古特大黄样
品聚为一类 (Ⅱ), 海拔 3 000 m以上的唐古特大
黄样品也聚为一类 (Ⅲ), 海拔 3 000 m的唐古特
大黄单独聚为一类 (Ⅰ )。第 Ⅱ类中 Rta-6 (海拔
2 700 m)、 Rta-7 (海拔 2 800 m)间的遗传相似度
在 0.65以上;第 Ⅲ类中 Rta-1 (海拔 4 100 m)、
Rta-2 (海拔 3 400 m)、 Rta-3 (海拔 4 500 m)、
Rta-4 (海拔 3 850 m)、 Rta-5 (海拔 3 100 m)间
的遗传相似度在 0.7以上 , 与 Rta-8 (海拔 3 290
m)和 Rta-9 (海拔 3 600 m)间的遗传相似度在
0.6以下。第Ⅰ类仅 Rta-11 (海拔 3 000 m)一个
样品 , 且与其余 10个样品的遗传相似度在 0.45以
下 , 说明 Rta-11和其余样品的基因组存在较大差
异 。分析其可能原因为海拔 3 000 m处于第 Ⅱ类和
第 Ⅲ类的分界处 , 环境条件变化显著 , 使海拔位于
3 000 m处的大黄积累了丰富的多样性 , 表现出与
其余两类样品较大的差异 。但具体原因有待进一步
研究。
掌叶大黄与唐古特大黄分属不同的种 , 但聚类
结果显示 , 掌叶大黄样品 Rpa-10 (海拔 2 540 m)
与唐古特大黄样品 Rta-6、 Rta-7同时聚为第 Ⅱ类 ,
遗传相似度大于 0.65, 而与第 Ⅲ类样品间的遗传
相似度在 0.6以下 , 这可能从另一方面暗示海拔对
大黄植物遗传多样性的影响。
第 Ⅱ类中 , 各样品间的遗传相似度与海拔梯度
成正相关 , 海拔越接近的样品 , 相互间的遗传相似
度越大 。第 Ⅲ类中各个样品间的遗传相似度并未表
现出与海拔梯度的正相关关系 。我们认为 , 海拔
3 000 m以上除光照和气温影响外 , 其他环境条件
的影响开始凸显 , 使其成为多因素综合影响的结
果。
海拔与唐古特大黄遗传多样性的关系显示 , 随
着海拔的升高 , 唐古特大黄样品的个体平均多态位
点数呈缓慢上升的趋势 。这说明 , 随着海拔的升高
唐古特大黄的遗传多样性逐渐丰富 , 并在海拔
3 000m处 , 多样度开始提高 , 而 3 000 m以下则
变化不明显。造成这一现象的原因 , 可能是唐古特
大黄由于适应高海拔的生境 , 在 3 000m以上的高
海拔区以有性繁殖为主 , 增加了种内的遗传多样
性。
目前认为 SSR广泛分布于基因间隔区和基因
表达区。 ISSR技术扩增的片段为相邻 SSR之间的
序列 , 若扩增片段位于基因表达区 , 则其揭示的不
同样品间的遗传差异可能与功能基因的表达存在直
接和或间接的关系 , 从而直接或间接反应生物的性
状[ 6] 。 ISSR分析结果从分子生物学方面揭示了青
海省不同海拔的大黄植物间存在一定的差异 , 并发
现海拔 3 000m成为划分青海省大黄植物遗传差异
的一个可能分界。据此推测 , 青海省不同海拔的大
黄植物相应的表现型也应该存在差异 , 并且很可能
与海拔高度密切相关。在众多药用植物性状中 , 药
材所含的化学成分尤为重要 。因此我们推测青海省
不同海拔地区大黄的化学成分应该存在差异 , 并且
可能在海拔 3 000m为差异显著分界线。对于这方
面的认识 , 还需要进一步的化学成分研究 , 如采集
不同海拔地区唐古特大黄进行化学指纹图谱分析和
活性成分的含量测定 , 揭示海拔与化学成分分布的
规律 , 从而实现从遗传学及化学成分两方面揭示海
拔与唐古特大黄品质的关系 。
REFERENCES
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(收稿日期:2007-12-18)
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