全 文 ：261
青荚叶多酚超声波辅助提取工艺
及抗氧化活性研究
孙志武1，李 宁2，李 好1，李红萍2，*
(1.郑州大学公共卫生学院，河南郑州 450001;
2.郑州大学化工与能源学院，河南郑州 450001)
收稿日期:2015－05－15
作者简介:孙志武(1989－) ，男，硕士，研究方向:公共卫生，E－mail:sunzhiwuyf@ 163.com。
* 通讯作者:李红萍(1967 －) ，女，博士，教授，研究方向:绿色化工，E－mail:lhpdgw@ zzu.edu.cn。
基金项目:河南省教育厅科技攻关项目(13A330459)。
摘 要:确定超声波辅助提取青荚叶多酚的最佳工艺条件及其体外抗氧化活性。在单因素实验的基础上，固定超声功
率 65 W，提取次数 2 次，通过响应面法优化设计提取多酚的工艺参数，并对其抗氧化活性进行测定分析。结果表明:
超声辅助提取青荚叶多酚的最佳工艺参数为乙醇体积分数 40.8%、提取时间 4.8 min、料液比 1∶ 60 (g∶ mL)、提取温度
67.5 ℃，多酚提取量为 29.43 mg /g。青荚叶多酚具有较强的还原能力，清除 DPPH自由基和 ABTS +·自由基 IC50分别为
44.28、35.07 mg /L。因此，青荚叶可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和医药工业中。
关键词:青荚叶，多酚，超声辅助，响应面法，抗氧化
Study on the ultrasound－assisted extraction
and antioxidant capacity of Polyphenols from Helwingia Japonica
SUN Zhi－wu1，LI Ning2，LI Hao1，LI Hong－ping2，*
(1.College of public health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China;
2.School of Chemical Engineering and Energy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)
Abstract:The research aimed to determine the optimal ultrasonic－assisted extraction process of Helwingia japonica
helwpolyphenols and its antioxidant activity in vitro. On the basis of design and analysis of single － factor
experiments，through which the optimal ultrasonic power and the frequency of extraction were found to be 65 W
and two times，the technological conditions of ultrasonic － assisted for the Helwingia japonica polyphenols were
optimized by response surface methodology and the antioxidant activity of Helwingia japonica polyphenols was
also studied by DPPH· and ABTS +·.The result showed that the optimum extraction conditions of Helwingia
japonica polyphenols were the volume fraction of 40.8% ethanol，ultrasonic time 4.8 min，solid － liquid ratio 1 ∶ 60
(g ∶ mL) ，extraction temperature 67.5 ℃.Under this condition，the yield of polyphenols obtained was 29.43 mg /g.
The tests of antioxidant capacity showed that Helwingia japonica polyphenols had strong deoxidizing ability，and
the IC50 of DPPH·and ABTS
+·were 44.28 mg /L and 35.07 mg /L respectively.Therefore，Helwingia japonica has a
good potential as a natural antioxidant used in food or medicine industries.
Key words:Helwingia japonica;polyphenols;ultrasound － assisted;response surface methodology;antioxidant
activity
中图分类号:TS255.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)03－0261－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 03． 046
青荚叶(HeLwingia japonica)为山茱萸科青荚叶
属落叶灌木，因雌花无梗，生于叶脉中部而得名，主
要分布于亚洲东部和东南部的一些国家和地区。在
《植物名实图考》中，青荚叶又称为阴证药、大部参，
植株各部位均可入药，具有活血消肿、清热解毒等功
效［1］。青荚叶富含人体必需的氨基酸、不饱和脂肪
酸、多糖、多酚类等生物活性成分，是一种药食同源
的新资源食品［2］，且在食品、医药、化工等行业也有广
泛的用途，是极其宝贵的自然资源。多酚是重要的
植物次级代谢产物，大量研究结果表明，植物多酚能
显著的清除人体内自由基，具有抗氧化、抗心血管疾
病、抗菌和抗癌等生物学功效［3－4］。近年来，以植物
多酚为原料的营养和保健食品需求量日益增多。青
荚叶作为一种药食同源的新资源食品，目前对其的
262
研究主要集中在观赏和种植、药用价值、化学成分及
多糖提取等方面，对青荚叶中具有营养和保健功能
的多酚类物质的研究鲜有报道。超声辅助提取天然
产物活性成分分离技术，利用超声产生的空化效应
加速原料细胞壁的破碎，增加溶剂的穿透力，从而加
速细胞内物质的溶出、释放和扩散，具有操作简单、
提取效率高、节省溶剂等特点［5－7］，近年来已逐渐被
应用到天然植物活性成分的提取。本实验采用响应
面分析法优化超声辅助提取青荚叶多酚(Helwingia
japonica Polyphenols，以下简写为 HLJP)的提取工艺，
并对 HLJP的体外抗氧化活性进行测定分析，为青荚
叶资源的开发利用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
青荚叶 新鲜野生，2013 年 6 月采自河南省伏
牛山脉卢氏县狮子坪原始森林;正己烷、没食子酸、
无水乙醇、盐酸、无水碳酸钠、福林试剂、1，1－二苯基
－2－三硝基苯肼(DPPH)、3－乙基苯并噻唑啉－6－磺
酸(ABTS)、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸二
氢钾、磷酸氢二钾等试剂 均为国产分析纯级，所用
水均为二次蒸馏水。
UV－1750 紫外可见分光光度计 岛津国际贸易
(上海)有限公司;BILON－650CT 多用途超声波提取
机 上海比朗仪器有限公司;BILON－W－530B 低温
恒温槽 北京比朗实验设备有限公司;ＲE－52AA 旋
转蒸发仪 巩义予华设备有限责任公司;TG－16 高
速离心机 巩义科华设备有限责任公司;PHS－3C 酸
度计 上海雷磁仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 HLJP提取工艺流程 青荚叶→清洗→低温干燥
→粉碎→索氏提取法(正己烷为溶剂)脱脂→低温真空干燥
→超声(65 W)辅助浸提→6000 r /min 离心 30 min 取上清液
→旋转蒸发浓缩→定容→测定吸光度→计算 HLJP提取量。
1.2.2 多酚含量的测定 采用福林酚法［8］进行测定，
以没食子酸溶液为标准，根据吸光值与没食子酸浓
度建立回归方程为 Y =0.0896X + 0.0221(Y:吸光值;
X:没食子酸溶液浓度;Ｒ2 = 0.9985)。多酚提取量按
公式(1)计算:
HLJP提取量(%)= CVm 式(1)
式中:C为 HLJP 质量浓度(mg /mL) ;V 为 HLJP
提取液体积(mL) ;m为青荚叶样品质量(g)。
1.2.3 HLJP提取工艺优化 根据已做的超声辅助提
取 HLJP单因素实验结果，选择乙醇体积分数、超声
时间、料液比和提取温度，进行四因素三水平的
Box－Behnken中心组合实验设计，所取各因素及水平
见表 1。以 HLJP提取量为响应值，通过响应面法优
化提取工艺条件。
1.2.4 HLJP对 Fe3 +还原能力测定 配制不同浓度梯
度的样品溶液(50、100、150、200、250、300 mg /L) ，依
次在比色管中加入样品 1.00 mL、磷酸盐缓冲溶液
(pH6.6)1.0 mL、铁氰化钾溶液(1%)1.0 mL，混匀，
50 ℃恒温水浴 30 min，取出冷却至室温，加入 1.0 mL
三氯乙酸溶液(10%) ，混匀，4000 r /min离心20 min，
移取 1.00 mL上清液至另一具塞试管中，加入 2.0 mL
水和 1.0 mL三氯化铁溶液(0.1%) ，摇匀后室温静置
10 min，测定液体在波长 700 nm处的吸光度，以维生
素 C(50、100、150、200、250、300 mg /L)做标准对
照品［9－10］。
表 1 Box－Behnken中心组合因素水平表
Table 1 Factors and levels of
Box－Behnken central composite experimental design
因素
水平
－ 1 0 1
X1 乙醇体积分数(%) 30 40 50
X2 超声时间(min) 3 5 7
X3 料液比(g /mL) 1∶ 45 1∶ 55 1∶ 65
X4 提取温度(℃) 50 60 70
1.2.5 DPPH·清除能力的测定 配制不同浓度梯度
的样品溶液(5、25、50、75、100、125 mg /L) ，依次在
10 mL的比色管中加入样品 2.00 mL，磷酸盐缓冲溶
液(pH 6.88)4.0 mL，0.1 mmol /L DPPH·溶液2 mL，
摇匀，避光反应 30 min，以 95%的乙醇溶液作参比，
在 517 nm处测定溶液的吸光度［11］，以维生素 C(5、
25、50、75、100、125 mg /L)做标准对照品，无水乙醇
做空白对照。自由基清除率计算公式为(2) :
Y = 1－
AS－AS0
A( )0 × 100 式(2)
式中:Y为 DPPH·清除率，A0 为空白对照溶液吸
光度，AS 为样品溶液吸光度，AS0为未加 DPPH·溶液
的本底吸光度。
1.2.6 ABTS +·清除率测定 将7 mmol /L ABTS 溶液
5 mL和 140 mmol /L 过硫酸钾溶液 88 μL 混合产生
ABTS +·，室温下避光静置反应 12 ～ 16 h，即得到
ABTS +·溶液。使用时用水稀释 ABTS +·溶液定容至
500 mL，使其在 734 nm 处的吸光度为 0.700 ±
0.02［12］。依次在 10 mL的比色管中加入 0.50 mL 不同
浓度梯度的样品溶液(5、15、25、50、60、65 mg /L)、
5.5 mL的 ABTS +·溶液，混匀，在 37 ℃水浴中保温
20 min，测定其在 734 nm 处吸光度，以维生素 C(以
下简称 VC) (5、15、25、50、60、65、70、75 mg /L)做标
准对照品。以纯水做为空白对照。样品抗氧化能力
以其对 ABTS +·的清除率 Y 来表示，计算公式同式
(2)。式中:Y为 ABTS +·清除率，A0 为空白对照溶液
吸光度，AS 为样品溶液吸光度，AS0为未加 ABTS
+·溶液
的本底吸光度。
1.2.7 数据处理 运用 Design － Expert.V8.0.6.1 和
origin9.0 软件对实验结果分析并作图。
2 结果与分析
2.1 响应面法优化青荚叶提取工艺
在单因素实验基础上，选择 4 个对 HLJP 提取量
影响较为显著的因素(X1 为乙醇体积分数，X2 为超
声时间，X3 为料液比，X4 为提取温度) ，依据 Box－
Behnken 中心组合设计原理，进行 4 因素 3 水平的中
心组合设计，实验设计及结果见表 2。
263
表 2 Box－Behnken 中心组合实验设计及结果
Table 2 Box－Behnken central composite
experimental design and the results
实验号 X1 X2 X3 X4
实测值
(mg /g)
预测值
(mg /g)
相对误差
(%)
1 0 1 － 1 0 27.45 27.44 0.04
2 0 0 － 1 1 28.01 28.02 0.04
3 1 0 0 － 1 27.78 27.61 0.61
4 1 1 0 0 27.23 27.17 0.22
5 － 1 1 0 0 26.95 26.87 0.30
6 － 1 － 1 0 0 26.56 26.61 0.19
7 － 1 0 － 1 0 25.94 25.80 0.54
8 1 0 0 1 27.95 27.84 0.40
9 0 0 0 0 29.12 29.26 0.48
10 0 1 0 1 28.90 28.97 0.24
11 0 0 0 0 29.24 29.26 0.07
12 0 1 0 － 1 28.06 28.26 0.71
13 1 － 1 0 0 27.56 27.63 0.25
14 1 0 1 0 27.84 28.02 0.65
15 1 0 － 1 0 26.22 26.32 0.38
16 0 1 1 0 28.79 28.67 0.42
17 0 － 1 1 0 29.12 29.11 0.03
18 0 0 － 1 － 1 27.34 27.29 0.18
19 0 0 1 1 29.35 29.39 0.14
20 0 － 1 － 1 0 27.12 27.23 0.41
21 － 1 0 0 1 27.33 27.48 0.55
22 0 0 0 0 29.46 29.26 0.68
23 0 0 1 － 1 29.07 29.05 0.07
24 0 － 1 0 1 29.07 28.90 0.59
25 0 － 1 0 － 1 28.57 28.53 0.14
26 － 1 0 0 － 1 26.56 26.65 0.34
27 0 0 0 0 29.18 29.26 0.27
28 0 0 0 0 29.29 29.26 0.10
29 － 1 0 1 0 27.28 27.22 0.22
运用 Design－Expert.V8.0.6.1 软件对表 2 中数据
拟合，得到多酚提取量的二次多元回归模型方程为:
Y = 29.26 + 0.33X1 － 0.052X2 + 0.78X3 + 0.27X4 －
0.18X1X2 + 0.07X1X3 － 0.15X1X4 － 0.17X2X3 +
0.085X2X4 － 0.098X3X4 － 1.73X1
2 － 0.46X2
2 － 0.69X3
2
－0.13X24
回归方程的方差分析结果见表 3，回归模型 p ＜
0.0001，模型极其显著。失拟项 p = 0.3603 ＞ 0.05，失
拟不显著。用该模型分析、预测超声辅助提取 HLJP
的结果见表 2。模型中，除 X2、X1X3、X1X4、X2X4、
X3X4 外，其他项 p ＜ 0.05，表明这些项对 HLJP提取量
的影响均达到显著水平。
根据回归方程所绘制的响应曲面见图 1，依据曲
面的陡峭程度，可判断料液比 X3、乙醇体积分数 X1、
提取温度 X4 对 HLJP提取量影响均较为显著。结合
表 3 数据，可知 X1X2、X2X3 的交互作用对 HLJP 提取
量的影响显著，X1X4、X3X4、X2X4、X1X3 的交互作用对
HLJP提取量的影响不显著，比较各因素 F 值大小，
判断各因素对 HLJP提取量影响的顺序为:料液比 X3
＞乙醇体积分数 X1 ＞提取温度 X4 ＞超声时间 X2。
表 3 回归方程的方差分析结果
Table 3 Analysis of variance for regression equation
项目 平方和 自由度 均方 F值 p值
模型 0.3078 14 0.0220 94.42 ＜ 0.0001＊＊
X1 0.0131 1 0.0131 56.11 ＜ 0.0001＊＊
X2 0.0003 1 0.0003 1.376 0.2604
X3 0.0732 1 0.0732 314.2 ＜ 0.0001＊＊
X4 0.0087 1 0.0087 37.33 ＜ 0.0001＊＊
X1X2 0.0013 1 0.0013 5.565 0.0334*
X1X3 0.0002 1 0.0002 0.842 0.3745
X1X4 0.0009 1 0.0009 3.865 0.0695
X2X3 0.0011 1 0.0011 4.676 0.0484*
X2X4 0.0003 1 0.0003 1.241 0.2840
X3X4 0.0004 1 0.0004 1.633 0.2221
X1
2 0.1944 1 0.1944 834.6 ＜ 0.0001＊＊
X2
2 0.0136 1 0.0136 58.57 ＜ 0.0001＊＊
X3
2 0.0309 1 0.0309 132.5 ＜ 0.0001＊＊
X4
2 0.0011 1 0.0011 4.878 0.0444*
残差 0.0033 14 0.0002
失拟项 0.0026 10 0.0003 1.538 0.3603
纯误差 0.0007 4 0.0002
总和 0.3111 28
注:* 差异显著，p ＜ 0.05;＊＊ 差异极显著，p ＜ 0.01。
图 1 各因素的交互作用对 HLJP提取量影响的响应曲面
Fig.1 Ｒesponse surface of
different factors on HLJP yield
通过 Design－Expert.V8.0.6.1 软件分析，HLJP 提取最
佳工艺条件是:乙醇体积分数 40.8%，提取时间
4.8 min，料液比 1∶ 60 g∶ mL，提取温度 67.5 ℃，在此
条件下，HLJP的预测提取量为 29.58 mg /g，五组平行
验证实验所得的 HLJP 平均提取量为 29.43 mg /g，预
测值和验证值误差在 ± 1%以内，由此可知，响应面
分析法优化提取条件可靠。
2.2 HLJP的抗氧化性分析
2.2.1 HLJP对 Fe3 +还原能力测定 在还原能力分析
中，反应产物在 700 nm 波长处的吸光度越大，样品
的还原能力越大［13］。实验结果见图 2，随着浓度的增
大，HLJP和 VC 对 Fe
3 +还原能力逐渐增强，存在明显
的量效关系。比较相同浓度下的吸光度可知，HLJP
264
的还原能力强于维生素 C。
图 2 HLJP对 Fe3 +的还原能力
Fig.2 The reducing power of HLJP to Fe3 +
2.2.2 HLJP 对 DPPH·清除率测定 通过测定物质
对 DPPH·的清除能力，可以快速的评价物质的抗氧
化性［14－15］。实验结果见图 3，随着溶液浓度的增大，
HLJP和维生素 C对 DPPH·清除能力逐渐增强。当清
除剂浓度达到 80 mg /L 时，HLJP 和 VC 对 DPPH·的
清除率增速变缓。较高浓度时，HLJP 对 DPPH·清除
能力要明显强于 VC。HLJP和 VC 的 IC50分别为 44.28、
65.09 mg·L －1。
图 3 HLJP对 DPPH·的清除率
Fig.3 Scavenging rate of HLJP on DPPH· free radicals
2.2.3 HLJP对 ABTS +·清除率的测定 HLJP和 VC 对
ABTS +·清除率见图4。在 5～65 mg·L －1的浓度范围内，
ABTS +·清除率随着清除剂浓度的增加逐渐增强，
存在良好的量效关系。在浓度为 65 mg·L －1时，
HLJP和 VC 对 ABTS
+·清除率分别可达到100%、
87.39%。比较相同浓度下的清除率可知，HLJP 对
ABTS +·清除能力强于 VC。HLJP和 VC 的 IC50分别为
35.07、44.17 mg·L －1。
图 4 HLJP对 ABTS +·清除作用
Fig.4 Scavenging rate of HLJP on ABTS +· free radicals
3 结论
在植物有效成分的提取中，由于超声波独特的
机械效应、空化效应及热效应，越来越受到学者的重
视。本文利用响应面法对超声辅助提取 HLJP 的工
艺参数进行优化实验设计，影响提取得率的因素依
次为:料液比 ＞乙醇体积分数 ＞提取温度 ＞提取时
间，优化后的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数
40.8%、提取时间 4.8 min、料液比 1∶ 60 g∶ mL、提取温
度 67.5 ℃。在此工艺条件下，HLJP 的提取量为
29.43 mg /g。HLJP对 Fe3 +的还原能力、清除 DPPH·
和 ABTS +·的能力均强于 VC，说明青荚叶多酚具有较
强的抗氧化能力。因此，青荚叶可以作为抗氧化的
功能性食品，有进一步开发利用的价值。
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作者简介:吕雪鹏(1989－) ，男，硕士，研究方向:农产品深加工，E－mail:lvxuepeng@ 126.com。
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基金项目:黑龙江省高校科技成果产业化前期研发培育项目(1253CGZH26) ;东北农业大学博士启动基金(2012ＲCB02) ;东北农业大学大学生
SIPT计划项目(201410224176
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
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摘 要:以牛骨为原料，利用蛋白酶对牛骨水解进行单因素实验，在单因素基础上，根据中心组合实验设计原理运用响
应面法，以水解度和多肽得率为响应值，得到最佳酶解条件为:酶解时间 3.45 h，加酶量 10500 U /g，底物浓度 12%，温
度 45 ℃，pH7.5，此参数下水解度(DH)为 14.29%，多肽得率 69.76%，接近响应面预测值。结果表明，酶水解牛骨可以
有效分解骨蛋白产生短链肽类，对牛骨蛋白利用以及开发活性肽有十分重要意义，为牛骨资源的精深加工提供实验
依据。
关键词:牛骨，骨多肽，酶解，多肽得率，响应面法
Study on enzymatic process of bovine bone for the peptides
by response surface optimization
LV Xue－peng1，ZHANG Hua－jiang1，* ，MU Yu－de2，SHI Yun－jiao1，
SHAO Hua1，HAN Han－ lin1，SONG Ge1，LI Xue－feng1
(1.College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;
2.Swan Native Produce and Animal Technology Development Company，Harbin 150036，China)
Abstract:Bovine bone as the raw material，the enzymatic process for bone peptide was studied.Then on the basis
of single－ factor experiments，response surface analysis was adopted according to Box－Behnken center－united
experimental design principle with hydrolysis degree and the rate of peptides as the responses. The optimum
enzymolysis condition was obtained as follows:substrate concentration was 12%，hydrolysis pH was 7.5，enzyme
concentration was 10500 U/g，hydrolysis temperature was 45 ℃，and hydrolysis time was 3.45 h，in this condition
the rate of peptides and hydrolysis degree are 69.76% and 14.29% .The predicted values for optimization process
conditions were in good agreement with experimental data.The results showed that enzymatic hydrolysis of bovine
bone can produce peptides and provide experimental basis for the intensive processing of bone resources.
Key words:bovine bone;bone peptide;enzymolysis;the rate of peptides;response surface methodology
中图分类号:TS251.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)03－0265－06
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 03． 047
我国是一个畜牧养殖业大国，随着人们消费水
平的提高，对肉制品的需求不断增长，而畜禽骨质量
约占动物体质量的 20% ～30%，所以畜禽骨的产量也
不断增加，每年产生近 2000 万 t 的畜禽骨副产品［1］。
但是对畜禽骨的利用却处于初级阶段，目前我国对
畜禽骨副产物的精深加工和高值化利用比例不足
3%，除了加工成附加值较低的骨粉等初级产品外，
大多都被随意丢弃，不仅造成资源浪费，而且还造成