全 文 ：昆明学 院学报　　2010, 32(3):44 ～ 46 CN53-1211/G4　ISSN1674-5639
JournalofKunmingUniversity
收稿日期:2010-03-25
作者简介:杨黎江(1969— ),女 , 云南昆明人 ,副教授 , 硕士 , 主要从事生理学 、药理学及生物化学研究;路金荣(1988— ),
女 , 山东济南人 , 2008级生物科学专业学生 ,主要从事天然产物开发研究;王晓娟(1988— ), 女 , 云南昆明人 ,
2008级生物技术及应用专业学生 , 主要从事天然产物开发研究.
通讯作者:沈放(1973— ),女(满族),辽宁凤城人 , 讲师 ,硕士 , 主要从事生物化学 、天然产物开发和药理学研究 , E-mail:fs
@163.com.
蛇菰多糖的提取及测定
杨黎江 ,路金荣 ,王晓娟 ,沈　放
(昆明学院 生命科学与技术系 ,云南 昆明 650031)
摘要:以蛇菰为材料 ,采用水提醇沉法提取浓缩后获得蛇菰多糖 , 以改良苯酚—硫酸比色法测定其多糖量.研究
表明 ,蛇菰中多糖的质量分数为 0.38%;加样回收率为 100.73%, RSD为 1.61%.因此 , 水提醇沉法可作为蛇菰
中多糖的提取方法 , 改良苯酚—硫酸比色法可以作为蛇菰中多糖的定量测定方法.
关键词:蛇菰;多糖;提取;水提醇沉法;苯酚—硫酸比色法
中图分类号:R284.2;O629.12　文献标识码:A　文章编号:1674-5639(2010)03-0044-03
TheContentDeterminationandExtractionofPolysaccharideinBalanophorainvolucrateHook.f.
YANGLi-jiang, LUJin-rong, WANGXiao-juan, SHENFang
(DepartmentofLifeScienceandTechonolgy, KunmingUniversity, YunnanKunming650031, China)
Abstract:InordertodeterminethecontentofpolysaccharideandconfirmthepolysaccharideextractingmethodinBalanophorainvolu-
crateHook.f..ExtractingpolysaccharidesfromBalanophorainvolucrateHook.f.bytheprocessthatwaswater-decoctingfollowedby
alcoholicwashingforprecipitation.Theresultshowedthatthecontentofpolysaccharideswasdeterminedbymodifiedphenol-sulphate
colorimetry.ThecontentsofpolysaccharidesextractedinBalanophorainvolucrateHook.f.were0.38%.Recoverieswere100.73%
andrelativestandarddeviation(RSD)are1.61%.Therefore, themethodofwater-decoctingfollowedbyalcoholicwashingcanbeused
asthepolysaccharidesextracting, andthemodifiedphenol-sulphatecolorimetrycanbeusedasdeterminationofthecontentandthe
qualitycontrolforpreparationsofpolysaccharidesinBalanophorainvolucrateHook.f.
Keywords:BalanophoreinvolucrataHook.f.;polysaccharide;extract;waterextracting-alcoholprecipitating;phenol-sulphatecolorimetry
　　筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrateHook.f.)
又名文王一枝笔 、鸡心七 、鹿仙草 , 系蛇菰科蛇菰
属植物 , 为拉枯族药 “密都那此”.具有补肝益肾 ,
止血生机 , 调经活血 , 清热醒酒之功效 [ 1] .拉枯族
民间医生用其治疗肝炎 、肝硬化腹水 、消化道出
血 、神经官能症 、阳萎 、外伤出血 、痔疮 、痛经 、醒
酒等病症 [ 2] .已有研究表明 , 蛇菰含有多糖 、黄
酮 、蒽醌及强心苷等类成分 , 用于肝炎和肝硬化
有一定疗效 , 对小白鼠实体型肝癌具有显著抑制
作用 , 对晚期肝癌病人也有一定疗效 [ 3] .研究证
实 , 多糖类化合物除了具有营养的生理功能外 ,
还有具有提高人体免疫力 、抗肿瘤 、降血压 、降血
脂及抑制癌细胞等方面的药理活性.蛇菰脂溶性
成分的研究工作较多 [ 4 -6] , 但是对于蛇菰多糖的
研究还未见报道.因此 , 拟对蛇菰中多糖成分的
提取和测定方法展开研究 , 以期为蛇菰中多糖成
分的活性研究提供方法和依据.
1　材料与方法
1.1材料
筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrateHook.f.),由
翟书华于昆明市石林县圭山野外采集而得 , 并分类
鉴定.
1.2仪器
旋转蒸发仪(东京理化);UV-1600双光束紫
外 -可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);电
热恒温水浴锅;循环水式多用真空泵;干燥箱.试剂
均为国产分析纯.
1.3筒鞘蛇菰粗多糖的提取
取适量蛇菰 , 用 95%乙醇室温浸泡脱脂 , 残
渣室温干燥切片.将脱脂后的蛇菰加 8倍量水于
100℃提取 60 min, 过滤 , 再加入 6倍量水于
100℃提取 60 min, 过滤 , 合并滤液.滤液减压浓
缩至一定体积.浓缩液加入乙醇 , 使乙醇的体积
分数分别达 50%, 70%, 80%, 静置过夜 , 六层纱
布过滤 , 合并沉淀物 ,无水乙醇洗涤 3次 , 50 ℃烘
DOI :10.14091/j.cnki .kmxyxb.2010.03.010
干 , 取出块状干品研磨成粉末密闭保存 , 得蛇菰
多糖.
1.4还原糖的定性试验
通过氨性硝酸银(Tolen)试剂法、苯酚硫酸法
和 α-萘酚硫酸法 , 验证蛇菰提取物是否具有还原
性多糖.
1.5葡萄糖标准溶液的制备
精密称取葡萄糖 100.0mg, 干燥恒重 , 加蒸馏
水定容至 100mL得到质量浓度为 1.00mg/mL的葡
萄糖标准液.
1.6供试品蛇菰多糖溶液的制备
精密称取蛇菰多糖 10.0 mg, 用蒸馏水配制成
质量浓度为 1.00 mg/mL的供试品蛇菰多糖储
备液.
1.7多糖的测定方法 [ 7 -9]
多糖测定法有蒽酮比色法、苯酚—硫酸比色法、
碱性铜试剂法 、高锰酸钾滴定法和直接滴定法等 ,现
多糖的测定多采用苯酚—硫酸比色法.
1.7.1反应温度选择
鉴于多糖干燥的温度 , 并参考文后有关文献
[ 7, 10]选定反应温度为 40℃.
1.7.2反应时间选择
精密吸取标样溶液、对照品溶液各 20μL, 加入
蒸馏水 180μL,苯酚溶液 0.4mL,混匀 ,迅速加入浓
硫酸 2mL, 混匀 , 40℃水浴 , 分别于 5, 10, 15, 20, 25
min测定吸光度 A
490
,由吸光度的变化选择最佳反应
时间.
1.7.3测定方法的可靠性验证
精密吸取标样溶液 、对照品溶液各 10, 15, 20,
25μL, 按上法操作 , 40℃水浴 15min, 测定吸光度.
以各样品 A490值为纵坐标 ,含量为横坐标做图 ,从供
试品和对照品溶液的曲线来验证测定方法的可
靠性.
1.8标准曲线的测定
精密吸取葡萄糖标准液 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14
mL,分别定容至 100mL.分别吸取上述溶液各 0.2
mL(含糖 4 ～ 28μg),加入苯酚溶液 0.4mL,混合后
迅速加入浓硫酸 2 mL, 混匀 , 40 ℃水浴 15min, 在
490nm波长处测定吸光度 A490,并绘制标准曲线 , 每
个样品做 4个平行.
1.9精密度试验
精密吸取 6份葡萄糖标准溶液各 2mL,如上法
操作 ,测定吸光度 , 并计算含量(质量分数 , 以下同)
和 RSD.
1.10样品的含量测定和重现性试验
精密称量 3份干燥蛇菰多糖 4mg, 加入蒸馏水
配制成质量浓度为 1mg/mL溶液备用.测定按照
1.8中标准曲线测定方法进行 ,测定样品中的蛇菰
多糖的含量并计算 RSD.
1.11回收率试验
精密制备 3份已知含量的蛇菰多糖溶液 ,在 3份
溶液中分别加入葡萄糖标准溶液 2mL,运用苯酚—硫
酸法测定 A
490
并计算其含量和回收率.
加样回收率 =
样品中总糖量 -样品中葡萄糖量
加入标准无水葡萄糖的量 ×100%.
2　试验结果
2.1蛇菰多糖的定性
通过氨性硝酸银(Tolen)试剂法 、苯酚硫酸法
和 α-萘酚硫酸法进行多糖定性 ,结果表明 ,蛇菰提
取物在 3种方法的检测中均表现出阳性反应.
2.2蛇菰多糖测定条件的确定
2.2.1反应条件的确定
鉴于多糖干燥的温度 , 并参考文后有关文献
[ 10]选定反应温度为 40℃.
精密吸取供试品溶液 、对照品溶液各 20μL,水
浴 ,分别于 5, 10, 15, 20, 25min测定吸光度 A490, 选
择最佳反应时间.结果如图 1.
结果表明 , 15, 20, 25min时测定数值较为接近 ,
与 5, 10min时测定的数据有较为明显的差别 , 由此
看来 ,当反应达到 15 min时反应较为完全 , 应选择
15min为本试验的反应时间.
2.2.2苯酚硫酸法测定蛇菰多糖的可靠性验证
精密吸取蛇菰多糖溶液、葡萄糖标准液各 10,
15, 20, 25μL,运用苯酚硫酸法测定各样品 A490值 ,验
证测定方法的可靠性.结果如图 2:
结果表明 , 蛇菰多糖的稀释曲线与葡萄糖标准
品曲线相互平行无交叉 , 并表现出良好的剂量依存
关系.因此 , 运用苯酚硫酸法测定蛇菰多糖的含量是
45第 3期　　　　　　　　　　　　　　杨黎江 , 路金荣 ,王晓娟 , 等:蛇菰多糖的提取及测定
可靠的.
2.3蛇菰多糖含量测定
2.3.1标准曲线的测定
葡萄糖标准液经测定后绘制标准曲线 , 如图 3.
试验结果表明 , 无水葡萄糖在 4 ～ 28 μg之间 ,
呈良好的线性关系 , y=0.0263x+0.0284, R2 =
0.9985.精密度试验结果表明 , 仪器精密度较好 ,
RSD=1.43%.
2.3.2蛇菰多糖含量测定
蛇菰多糖样品经含量测定 , 样品数 n=3, 平均
吸光度 A=0.613.以蛇菰多糖样品量计 , 样品中含
多糖 11.13%.以生药量计 , 蛇菰中含多糖 0.38%.
回收率试验结果表明 , 蛇菰多糖的加样回收率为
100.73%, RSD=1.61%
3　讨论
根据多糖的性质 ,多糖在水中的溶解性较大 ,却
不溶于高浓度的乙醇溶液 , 因此可利用高浓度乙醇
分级沉淀 ,分离纯化获得多糖.多糖的提取方法较
多 , 很多中药材中多糖的提取均使用水提醇沉
法 [ 7, 8, 10 -11] ,本文采用高浓度乙醇脱脂后进行水提醇
沉提取蛇菰多糖 , 通过一系列试验确定了提取方法
的可靠性.多糖可被酸水解成单糖 ,单糖可同苯酚、
蒽酮 、咔唑类发生颜色反应 [ 12] , 反应后颜色的深浅
和样品中糖的含量成正比 , 运用分光光度计进行比
色就可测定样品中糖的含量.因此 ,本文采用了文献
报道中多糖含量测定常用的方法———苯酚—硫酸法
进行蛇菰多糖含量测定 , 通过试验确定了运用苯
酚—硫酸法测定蛇菰多糖的反映温度(40℃)和反
应时间(15min).此法简便易行 , 显色稳定 ,灵敏度
高 ,效果较好.
试验结果表明 , 本试验较为成功地提取了蛇菰
多糖 ,并建立了相应的测定方法 ,为进一步蛇菰多糖
的研究打下了一定的基础.
[参考文献 ]
[ 1]邓泽 ,仓汉德 ,张绍云.复方鹿仙草糖浆的研制 [ J].中国民族民
间医药杂志, 2003, 65(3):361-362.
[ 2]思茅地区民族传统医药研究所.拉祜族常见药 [ M].昆明:云南
民族出版社, 1986.
[ 3]张绍云,宋昆生 ,王海春 ,等.拉枯族药 “密都那此”的研究 [ J] .中
国民族民间医药杂志 , 1999, 39(4):220-221.
[ 4]滕荣伟 ,王德祖 ,杨崇仁.蛇菰的化学成分 [ J] .云南植物研究 ,
2000, 22(2):225-233.
[ 5]夏新中 ,韩宏星 ,屠鹏飞.筒鞘蛇菰的三萜及甾醇成分研究 [ J] .
中草药 , 2001, 32(1):6-9.
[ 6]潘剑宇 ,周媛 ,邹坤 ,等.筒鞘蛇菰的化学成分研究 [ J] .中草药 ,
2008, 39(3):327-331.
[ 7]董群 ,郑丽伊 ,方积年.改良的苯酚—硫酸法测定多糖和寡糖含
量的研究 [ J] .中国药学杂志 , 1996, 31(9):550.
[ 8]郭胜伟,蔡宝昌.白参菌多糖的提取及含量测定 [ J] .时珍国医国
药 , 2001, 12(12):1065 -1067.
[ 9] SAHASK, BREWEREF.Determinationoftheconcentrationsofoligo-
saccharides, complextypecarbohydratesandglycoproteinsusingthephe-
nol-sulrfuricacidmethod[J].CarbohydrRes, 1994, 254:157-161.
[ 10]沈放,王德斌.当归多糖对酪氨酸酶活性的影响 [ J] .昆明师范
高等专科学校学报 , 2005, 27(4):61 -62.
[ 11]徐翠莲 ,杜林洳 ,樊素芳 ,等.多糖的提取 、分离纯化及分析鉴定
方法研究 [ J] .河南科学 , 2009, 27(12):1524 -1529.
[ 12]张惟杰.复合多糖生化研究技术 [ M] .上海:上海科学技术出版
社 , 1987.
46 　　　　　　　　　　　　　　昆明学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年 5月