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蛇葡萄素钠增强肝癌细胞放疗敏感性的实验研究



全 文 :蛇葡萄素钠增强肝癌细胞放疗敏感性的实验研究
潘晓婧1,王 敏1,2* ,吴勇杰2,张 红3
(1. 兰州大学口腔医学院,甘肃 兰州 730000;2. 兰州大学 /甘肃省新药临床前研究重点实验室,甘肃 兰州
730000;3. 中国科学院近代物理研究所,甘肃 兰州 730000)
摘要 目的:研究蛇葡萄素钠(AMP-Na)对人肝癌 HepG2 细胞株的 X 射线增敏作用,并探讨其作用机制。方
法:应用 MTT法和集落形成法测定 AMP-Na对 HepG2 细胞的 X 射线增敏作用,单因素方差分析确定增敏作用,单
击多靶模型曲线拟合计算增敏比;流式细胞术检测其对细胞周期和凋亡的影响。结果:MTT 检测结果表明,AMP-
Na能显著抑制 HepG2 细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖效应;对 X射线增敏作用方差分析表明,AMP-Na能增加 X
射线对肝癌 HepG2 细胞的敏感性,最佳增敏剂量为 12. 5 ~ 25 μg /mL。集落形成法检测结果表明,应用增敏剂量的
AMP-Na后,D0、Dq 和 N值减小,增敏比为 1. 94。流式细胞仪检测表明 20 μg /mL AMP-Na和 X射线合用后出现明
显的诱导细胞凋亡作用,细胞周期主要表现为 S期阻滞,G2 /M期细胞比例明显减少,表明联合应用具有增强效应,
但细胞周期作用点仍以 S 期为主。结论:AMP-Na 能增强肝癌 HepG2 细胞对 X 射线的敏感性,最佳增敏剂量为
12. 5 ~ 25 μg /mL,其机理可能通过诱导细胞凋亡、调控细胞周期停滞于 S期发挥作用。
关键词 蛇葡萄素钠;肝癌细胞株;X射线;增敏
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)02-0283-05
收稿日期:2012-09-04
基金项目:甘肃省自然科学基金项目(0710RJZA016) ;中央高校基本科研费面上项目(lzujbky-2012-154)
作者简介:潘晓婧(1976-) ,女,硕士,讲师,研究方向:肿瘤药理学;Tel:0931-8915062,E-mail:panxj@ lzu. edu. cn。
* 通讯作者:王敏,Tel:0931-8915184,E-mail:wangmin@ lzu. edu. cn。
放射治疗是临床治疗恶性肿瘤最常用的方法之
一,而放射敏感性是决定肿瘤放射治疗成败的关键。
因此,如何提高肿瘤放射敏感性进而提高放射疗效
已成为肿瘤治疗学领域一个研究的热点,放疗增敏
剂的研究应运而生。但化学合成的放疗增敏剂存在
许多难以克服的缺陷,因此学者们把目光投向了传
统中药。蛇葡萄素(3,5,7,3,4,5-六羟基 2,3 双
氢黄酮醇(Ampelopsin,AMP)是黄酮类化合物的重
要一员〔1〕。近年研究表明 AMP 具有广泛的生理活
性,其药理作用主要有:抗肿瘤、抗炎镇痛、抑菌、降
血糖、保肝护肝等。但 AMP难溶于水,对光、热不稳
定,严重制约了其研究开发进程。本研究组制备成
钠盐(AMP-Na)后(工艺已申请专利) ,在水中的溶
解度是 AMP水中溶解度的 125 倍;静脉注射急性毒
性较前者降低了 2 倍以上,说明其溶解性及毒性均
有显著变化。小鼠静脉注射药动学研究表明,药物
在肝、肾等组织中分布较多,且生化检测并未出现肝
功能异常,提示 AMP-Na 对治疗肝癌具有重要的临
床意义。虽然动物实验单用抗肿瘤细胞不佳,却与
常用抗肿瘤药物如 5-氟尿嘧啶、顺铂等产生很好的
协同作用。为此,推测 AMP-Na 对放疗是否同样存
在协同或者增敏作用。本研究旨在观察 AMP-Na
联合放疗对人肝癌 HepG2 细胞的抑制作用,为临
床开展 AMP-Na 与放疗合用治疗肝癌提供有益探
索。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 人肝癌 HepG2 细胞株,引自中科院
上海生物研究所细胞库,本所自行传代保种。用含
10%小牛血清、100 U /L 青霉素、100 U /L 链霉素的
DMEM培养液,在 5% CO2、37 ℃细胞培养箱培养,
细胞呈贴壁生长,用 0. 5%的胰酶消化传代。
1. 2 药物与试剂 AMP-Na 冻干剂:50 mg /支,批
号:081030,纯度 98. 8%,取 AMP-Na 冻干剂,用
AMP-Na 专用稀释液和 pH 6. 5 的 PBS 按 1 ∶ 1. 5 的
比例溶解到 4 mg /mL,0. 22 μm微孔滤器过滤,然后
用生理盐水稀释至所需浓度;AMP-Na 冻干剂专用
稀释液(0. 1 mol /L,pH =6. 8 磷酸盐缓冲液) :5 mL /
支,批号:081113,均由广东泰禾医药科技有限公司
提供;注射用顺铂,10 mg /支,批号:706031CF,齐鲁
制药有限公司;小牛血清,杭州四季青公司产品;
RMPI-1640 培养基干粉:GIBCO 公司产品;噻唑蓝
(MTT)和碘化丙啶(PI) :SIGMA 公司产品;其余试
剂均为国产分析纯。
1. 3 主要仪器 倒置相差显微镜:OLYMPUS
IX70,OLYMPUS 公司产品;BIO-RAD iMark 自动酶
标仪,日本;流式细胞仪(FCM) :EPICS XL,COUL-
TER公司产品。
2 方法
·382·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 2 期 2013 年 2 月
2. 1 MTT法检测 AMP-Na对 HepG2 细胞增殖抑制
作用 参照文献 MTT 法〔2〕,实验设阴性对照组(细
胞悬液 +专用稀释液,用于计算抑制率)、空白对照
组(DMEM 培养液 +专用稀释液,用于消除培养液
颜色误差)、AMP-Na 各剂量组(细胞悬液 +不同浓
度的 AMP-Na) ,AMP-Na各剂量颜色对照组(DMEM
培养液 +不同浓度的 AMP-Na,用于消除药物颜色
误差)。取对数生长期 HepG2 细胞,消化,吹打均
匀,计数,调整细胞浓度至 5 × 104 /mL,在 96 孔培养
板中以 90 μL /孔加入细胞悬液;贴壁 24 h 后,阴性
对照组和空白对照组加 AMP-Na 专用稀释液,实验
组分别加入不同浓度的 AMP-Na,置培养箱培养 24、
48、72 h后,每孔加入 MTT 10 μL(5 mg /mL) ,再培
养 4 h后吸去培养液,加入二甲基亚砜(DMSO)150
μL,震荡 10 min,酶标仪单波长 490 nm 测定每孔光
密度 D(λ)。每个浓度设 3 个复孔,以 3 个复孔 D
(λ)值的均数作为一次实验的数据,实验重复 3 次。
应用曲线专家程序 IC50 Calculator,根据最佳拟合曲
线计算 IC50值。
抑制率(IR,%)=
D(λ)阴性 - D(λ)空白 -〔D(λ)实验 - D(λ)实验〕
D(λ)阴性 - D(λ)空白
× 100 %
2. 2 MTT法检测 AMP-Na 增加 HepG2 细胞 X 射
线的敏感性 96 孔板加入细胞悬液及药物同“2. 1”
项下方法。实验组加入不同浓度的 AMP-Na,置培
养箱培养 48 h后,接受 X射线照射。照射采用中国
医学科学研究院肿瘤医院 6MV 加速器产生的剂量
率为 2. 5 Gy /min 的 X 射线,吸收剂量分别为 0、
0. 5、2、6、12 Gy,源皮距为 100 cm。照射后吸去培养
液,重新加入含 10%新生牛血清完全培养液,置培
养箱继续培养 72 h,每孔加入 MTT 10 μL(5 mg /
mL) ,D(λ)490检测、抑制率计算同前。数据采用单
因素方差分析。
2. 3 集落形成法检测 AMP-Na 增加 HepG2 细胞 X
射线的敏感性 MTT 检测结果表明蛇葡萄素钠对
肝癌 HepG2 细胞有显著的杀伤作用,呈剂量依赖效
应,以 IC20(20 μg /mL)作为增敏浓度进行药物增敏
实验。HepG2 消化后计数并稀释为 3 × 10
4 /mL,分
成 10 个小瓶,每个小瓶为 4. 5 mL,待细胞贴壁后,
药物增敏组 5 瓶细胞加入 AMP-Na 500 μL,终浓度
为 20 μg /mL,单纯照射组 5 瓶细胞加入等体积专用
稀释液。2 组细胞继续培养 48 h 后全部接受照射。
吸收剂量分别为 0、1、2、6、12 Gy。照射后,将各瓶
细胞分别接种到直径 60 mm 的平皿内(每个剂量点
3 皿重复) ,如表 3 设计加入不同浓度细胞悬液。随
后将培养皿放置 37 ℃、CO2温箱培养 2 w;取出平
皿,弃掉液体,用 PBS洗 2 次,甲醇固定 15 min,然后
用 1∶ 20 的姬姆萨染色 15 min,用蒸馏水水洗 3 次,
统计大于 50 个细胞的集落数,求得细胞的存活率。
存活率 = 某剂量的集落形成数
某剂量下种植的细胞数
× 100%
2. 4 流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡和细胞周期分
布 取对数生长期 HepG2 细胞,消化,计数,调整细
胞浓度至 5 × 105 /mL,培养 24 h 后,对照组加 AMP-
Na 专用稀释液,实验组加入 AMP-Na(终浓度 20
μg /mL) ,培养 48 h 后接受照射。照射结束后吸去
含药培养液,加入新鲜不含药培养液继续培养 72 h。
结束后 1 000 r /min离心 5 min,收集细胞,将细胞转
移至 1. 5 mL Eppendorf 管中,用冷的 PBS(pH 7. 4)
洗 2 次,弃上清,加入 300 μL PBS(pH 7. 4) ,制成细
胞悬液。将 0. 7 mL预冷的无水乙醇沿管壁分多次
加入,4 ℃固定过夜。上机前用 PBS 洗 2 次,加入
100 μg /mL RNA酶,37 ℃消化 30 min,酶切 RNA;加
50 μg /mL碘化丙啶(PI) ,4 ℃避光染色。用 200 目
细胞筛过滤后在流式细胞仪上检测(激发波长 488
nm,吸收波长 600 nm)。
2. 5 统计学处理 MTT 增殖抑制率检测数据以 珋x
± s表示,做两独立样本 t 检验,MTT 增敏各组光密
度值差异采用单因素方差分析,集落形成存活率分
析采用单击多靶模型曲线拟合,SPSS 17. 0 软件。
流式细胞术检测结果用计算机自带 Multicycle
(Phoenix Flow System,San DieGo,CA,USA )软件分
析,计算出细胞周期分布和凋亡情况。
3 结果
3. 1 AMP-Na 对 HepG2 细胞的增殖抑制作用
AMP-Na对 HepG2 细胞有明显的增殖抑制作用,并
呈现时间和剂量依赖性,但在低于 12. 5 μg /mL 剂
量时对肿瘤细胞的抑制作用不明显,高于 100 μg /
mL 剂量时抑制率增加不明显。所以 AMP-Na 对
HepG2 细胞最佳作用范围为 12. 5 ~ 100 μg /mL。抑
制率和 IC50值见表 1。
3. 2 MTT法检测 AMP-Na 增加 HepG2 细胞 X 射
线的敏感性 结果如表 2 所示,X 射线和 AMP-Na
均可显著影响肿瘤细胞的存活率,且二者之间存在
协同关系(P < 0. 01)。但三者对细胞杀伤的贡献不
同,作用因素依次为 X射线 >蛇葡萄素钠 >二者合
用。为进一步分析二者之间的相关性,固定其中一
个因素水平即药物浓度,研究各浓度药物的增敏作
用。结果表明,在药物浓度小于 12. 5 时,药物对肿
瘤细胞没有杀伤作用,也无增敏作用,主要是 X 射
线对肿瘤细胞的杀伤;药物浓度大于 12. 5 到 25 之
·482· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 2 期 2013 年 2 月
间时,药物对肿瘤细胞有杀伤作用,开始表现增敏作
用,X射线对肿瘤细胞杀伤为主要作用;药物剂量大
于 25 时,药物对肿瘤细胞的杀伤作用增强,表现为
协同作用,所以 AMP-Na 最佳增敏剂量为 12. 5 ~ 25
μg /mL。
3. 3 集落形成法检测 AMP-Na 增敏作用 肿瘤细
胞具有无限增殖的潜力,但以药物干预或 X 射线照
射后会使部分未立即死亡细胞在继续分裂数代后停
止增殖。所以集落形成法观察细胞的增殖抑制作
用,以“多靶单击模型”进行曲线拟合,模型方程:
SF = 1 -(1 - e - D/D0)N,Dq = D0 lnN,其中 SF 为存活
分数,D 为放射剂量(Gy) ,D0 代表平均致死量,Dq
代表准域剂量,N 为外推数,结果如表 3、4 所示,蛇
葡萄素钠对 X射线有显著的增敏作用,药物作用后
D0 值降低,表明细胞对 X射线敏感性增加;Dq 反映
肩区的大小,表明细胞亚致死损伤修复能力。药物
作用后,Dq 变小,说明细胞修复亚致死损伤的能力
变弱,N值减小则细胞在低剂量区时对亚致死损伤
的耐受性降低,增敏比为 1. 94。
表 1 AMP-Na和顺铂作用 HepG2细胞
各时间的抑制率(珔x ± s,n =3)
组别
抑制率 /%
24 h 48 h 72 h
AMP-Na /(μg /mL)
6. 25 1. 56 ± 1. 55 5. 12 ± 0. 94 7. 47 ± 1. 06
12. 5 4. 88 ± 2. 76 9. 17 ± 0. 34* 10. 27 ± 2. 37*
25 6. 66 ± 2. 05* 18. 01 ± 5. 49** 26. 82 ± 4. 48**
50 14. 46 ± 2. 51* 35. 86 ± 3. 38** 35. 14 ± 4. 51**
100 25. 55 ± 2. 21** 70. 81 ± 5. 27** 84. 46 ± 7. 83**
200 34. 69 ± 2. 38** 71. 47 ± 6. 36** 98. 38 ± 1. 49**
IC50 231. 67 ± 31. 68 75. 59 ± 7. 16 39. 80 ± 1. 87
顺铂 /(μg /mL)
2 8. 20 ± 1. 00 28. 30 ± 3. 30 50. 57 ± 3. 19
4 16. 64 ± 3. 23 37. 54 ± 1. 98 62. 19 ± 2. 09
8 38. 09 ± 3. 83 75. 22 ± 8. 20 86. 95 ± 7. 32
16 61. 80 ± 3. 47 95. 31 ± 2. 65 98. 47 ± 2. 07
注:与对照组比较,* P < 0. 05,**P < 0. 01
表 2 各剂量蛇葡萄素钠与不同剂量的 X射线照射 HepG2 细胞后 D(λ)490值
AMP-Na /(μg /mL) 0 Gy 0. 5 Gy 2 Gy 6 Gy 12 Gy
- 0. 893 ± 0. 040 0. 818 ± 0. 018 0. 526 ± 0. 018 0. 370 ± 0. 046 0. 254 ± 0. 013
3. 125 0. 875 ± 0. 027 0. 798 ± 0. 025 0. 518 ± 0. 043 0. 324 ± 0. 016 0. 210 ± 0. 022*
6. 25 0. 808 ± 0. 051 0. 707 ± 0. 040* 0. 443 ± 0. 066* 0. 275 ± 0. 019* 0. 155 ± 0. 003
12. 5 0. 668 ± 0. 080* 0. 556 ± 0. 010** 0. 360 ± 0. 020** 0. 192 ± 0. 009** 0. 108 ± 0. 007**
25 0. 441 ± 0. 013** 0. 512 ± 0. 016** 0. 287 ± 0. 023** 0. 130 ± 0. 014** 0. 090 ± 0. 009**
50 0. 385 ± 0. 023** 0. 313 ± 0. 018** 0. 103 ± 0. 012** 0. 091 ± 0. 008** 0. 007 ± 0. 007**
100 0. 238 ± 0. 014** 0. 263 ± 0. 011** 0. 056 ± 0. 003** 0. 008 ± 0. 008** 0. 002 ± 0. 015**
注:D(λ)490值为减去颜色对照后的数值,与各阴性对照组比较,* P < 0. 05,**P < 0. 01
表 3 集落形成法检测 AMP-Na放射增敏抑制率
0 Gy 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy
种植细胞数(个 /mL) 500 500 1000 1000 1000
单放集落形成数 249 ± 9 212 ± 5 378 ± 15 280 ± 20 178 ± 21
SF 1 0. 851 0. 760 0. 562 0. 358
药物 +放射集落形成数 222 ± 25 150 ± 19 121 ± 14 78 ± 4 52 ± 11
SF 1 0. 677 0. 273 0. 176 0. 117
表 4 AMP-Na增敏作用曲线拟合分析
K N D0 Dq
单独 X射线照射 0. 191 2. 034 5. 236 3. 717
药物和 X射线照射 0. 371 1. 700 2. 695 1. 430
3. 4 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期 依据
以上结果,在增敏浓度 20 μg /mL 下进行增敏实验,
流式细胞仪检测药物和 X 射线作用后细胞凋亡和
细胞周期的变化,结果见表 5。流式细胞术检测显
示单独 2 Gy X射线照射并没有显著诱导细胞凋亡,
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但细胞周期出现显著的 S 期阻滞,在高剂量的 12
Gy X射线作用下,除了 S 期阻滞外尚出现 G2 /M 期
阻滞,G0 /G1 期细胞比例减少。缘于 X 射线照射后
出现的 S期和 G2 /M期阻滞,导致有丝分裂延迟,使
细胞经有丝分裂进入 G0 /G1 期的细胞呈剂量依赖
性减少。单独应用 20 μg /mL AMP-Na 作用 HepG2
细胞 48 h,也并没有显著诱导细胞凋亡,细胞周期出
现 G1 期阻滞和 S 期阻滞。通过对细胞周期调控因
子的检测发现 AMP-Na 可以引起细胞内 CyclinD1
mRNA表达下调,CyclinD1 通过磷酸化而控制着细
胞周期 G1 /S 转换,是细胞周期调节的关键基因,
AMP-Na可能通过下调 CyclinD1 基因表达,阻滞
HepG2 细胞停滞于 G1 期发挥抗肿瘤作用。AMP-Na
和 X射线合用后出现明显的诱导细胞凋亡作用,细
胞周期主要表现为 S 期阻滞,G2 /M 期细胞比例明
显减少,表明联合应用具有增强效应,但细胞周期作
用点仍以 S期为主。
表 5 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化
SubG1 G1 S G2 /M
0 0. 114 58. 124 29. 704 12. 171
2 Gy射线 0. 733 56. 873 41. 481 1. 646
12 Gy射线 2. 30 24. 550 31. 867 43. 583
20 μg /mL药物 0. 389 64. 221 35. 779 0. 000
20 μg /mL + 2Gy射线 9. 50 57. 442 42. 558 0. 000
4 讨论
恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之
一,肿瘤的手术治疗、放疗和化疗为当前肿瘤三大治
疗手段,在实际应用中往往需要根据实际情况选择
2 种或 3 种治疗手段进行配合治疗。其中,放射治
疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一,约 70%的肿瘤
患者,不论手术与否,都需要采用放疗。而肿瘤细胞
天然或者获得的辐射抗性严重制约了放疗的疗效。
因而,放射增敏剂已成为肿瘤放射治疗学中的一个
研究热点。近年来,许多工作转向了中药提取物的
放疗增敏作用,中药作为放疗辅助用药有很多优势,
大多数价格低廉,而且自身并没有太大毒副作用,这
两点在肿瘤的长期治疗中显示了无可比拟的优势。
AMP是从葡萄科蛇葡萄属植物楝叶玉葡萄的叶中
分离到的单体化合物〔3,4〕,本研究组改造成 AMP-
Na,增加了溶解性,降低了毒性。通过体外细胞毒
实验证实,AMP-Na对人乳腺癌 MCF-7 细胞、鼻咽癌
HK-1 细胞、白血病 HL-60 和 K562 细胞的增殖均具
有明显的抑制作用,提示 AMP-Na 可能是一种广谱
抗癌剂。在药代动力学研究中发现其静脉注射进入
小鼠体内后在肝、肾、肺、胰腺、膀胱及前列腺组织中
分布较多,在肝组织匀浆中药物浓度高于血药浓度,
且血液生化检测及肝脏病理检测未出现改变,提示
AMP-Na可在肝组织中浓集,对治疗肝癌具有重要
的临床意义。研究过程中发现 AMP-Na 体外对多种
细胞株表现出非常好的抗肿瘤效果,然而体内荷瘤
小鼠及裸鼠实验结果并不理想。值得注意的是虽然
动物实验单用抗肿瘤细胞不佳,却与常用抗肿瘤药
物如 5-氟尿嘧啶、顺铂等产生很好的协同作用,降
低常用化疗药的剂量增加疗效,而并未出现毒性的
叠加。为此,研究 AMP-Na 对放疗的协同或者增敏
作用,既是对 AMP-Na临床应用的拓展,也是改善肿
瘤放射抗拒的有益探索。
本研究发现 AMP-Na作用于肝癌细胞株 HepG2
细胞,抑制作用呈现时间和剂量依赖性,但存在最佳
作用范围,有效作用浓度在 12. 5 ~ 100 μg /mL 之
间,选取对细胞基本无杀伤的 IC20(20 μg /mL)作为
增敏剂量进行后续实验。单因素方差分析结果表
明,AMP-Na与 X射线对 HepG2 的杀伤存在相互作
用,统计学比较有显著性差异(P < 0. 01) ,但 X射线
对细胞的杀伤作用为主因素。AMP-Na 在 12. 5 ~ 25
μg /mL表现为增敏作用,统计学分析 X射线为主因
素,其次为二者合用,最后为 AMP-Na。药物浓度大
于 25 μg /mL 表现为协同杀伤作用。所以 AMP-Na
最佳增敏剂量为 12. 5 ~ 25 μg /mL,这也与前述实验
结果相互印证。集落形成法观察增敏剂量药物应用
后细胞对 X射线敏感性的变化,结果表明药物应用
后亚致死损伤修复能力变弱,在低剂量区亚致死损
伤耐受性降低,增敏比为 1. 94。为探讨 AMP-Na 增
敏作用机制,进行了细胞凋亡和细胞周期分析。值
得注意的是,X 射线阻滞细胞停滞于 S 期和 G2 /M
期,且随照射剂量增大,G2 /M 期阻滞加深。现有资
料表明电离辐射引起 DNA 损伤后,细胞启动 DNA
修复过程,同时伴随 P53 通路调节的细胞周期紊乱,
即 G1期、S期和 G2期的阻滞或延迟
〔5,6〕。G1期阻滞
过程中伴随着碱基切除修复、核苷酸切除修复和非
同源末端连接,S期和 G2 期阻滞过程中伴随有借助
同源染色体的同源重组修复〔7〕。辐射引起的细胞
周期 G2 /M期阻滞比 G1 期阻滞更普遍
〔5〕,P53 通过
调节下游效应分子的转录来调控 G1 期的进程。细
胞受损后,P53 上调 P21 表达,从而抑制 CDK /周期
蛋白对 pRb蛋白的磷酸化作用,使细胞发生 S 期阻
滞。而 AMP-Na在前期研究中发现主要是通过下调
CyclinD1 基因表达出现 G0 /G1 期阻滞,G2 /M 期细
胞比例减少,二者合用后细胞凋亡率增高,细胞周期
主要表现为 S期阻滞,单独 X 射线引起的 G2 /M 期
·682· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 2 期 2013 年 2 月
阻滞消失,反而 G2 /M期细胞比例明显减少,联合应
用后细胞周期出现这种变化的原因值得进一步研
究,但可以提示正是这种对细胞周期的不同调节成
就了二者合用对肿瘤细胞诱导凋亡的增强效应。
致谢:本研究由甘肃省科技厅自然科学基金项目资助,兰州大学
交叉学科青年创新研究基金项目资助,X 射线照射在甘肃省肿瘤医
院放射治疗中心完成,在此一并致谢。
参 考 文 献
[1]张友胜,杨伟丽,熊皓平 . 显齿蛇葡萄基本成分研究
[J].天然产物研究与开发,2001,13(5) :46-48.
[2]司徒镇强,吴正 . 细胞培养[M]. 西安:世界图书出版
社,2006:250-252.
[3]刘德育,罗曼,谢冰芬,等 . 蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究
[J].癌症,2001,20(12) :1372-1375.
[4]叶建涛,郑义磊,刘德育 . 蛇葡萄素对 K562 /ADR 细胞
耐药性的逆转作用及机制研究[J]. 中国中药杂志,
2009,34(6) :761-765.
[5]夏寿萱 . 放射生物学[M]. 北京:军事医学科学出版
社,1998:60-63.
[6]刘辉,张红,刘兵,等 . P53 及其相关蛋白对 X射线照射
肝癌细胞周期的调节[J]. 原子核物理评论,2007,24
(4) :289-293.
[7] 夏景光,李文建,王菊芳,等 . 低剂量辐射诱导 HepG2
细胞克隆存活和细胞周期适应性反应[J]. 原子核物理
评论,2005,22(2) :216-218.
益气补血方对化疗后小鼠 T淋巴细胞增殖能力
及细胞因子 IL-2 和 IL-6 分泌的影响
沈 晗1,2,3,聂建云1,胡杨朔1,苏 浴1,邵红伟1,3,黄树林1,3*
(1. 广东药学院生命科学与生物制药学院,广东 广州 510006;2. 南方医科大学,广东 广州 510515;3. 广
东省生物技术候选药物研究重点实验室,广东 广州 510006)
摘要 目的:研究中药益气补血方对化疗后小鼠 T 淋巴细胞增殖能力及细胞因子分泌功能的影响。方法:40
只雌性 SPF级 C57BL /6 小鼠随机分为四组,即生理盐水组、化疗组(环磷酰胺腹腔注射)、益气补血方组(中药灌
服)及益气补血方联合化疗组,给药 2 个疗程后处死小鼠,对各实验组小鼠骨髓细胞进行细胞周期分析,收集各实
验组小鼠脾淋巴细胞体外培养,绘制 T淋巴细胞生长曲线,并用 ELISA法检测经肿瘤抗原刺激后的小鼠淋巴细胞
分泌细胞因子 IL-2 和 IL-6 的情况。结果:益气补血方能有效缓解化疗造成的骨髓细胞 G1 期阻滞,提高 G2 /M期细
胞比例及降低凋亡细胞数;细胞生长曲线显示益气补血方能对化疗后小鼠 T 淋巴细胞的增殖能力有一定保护作
用,但未能恢复到对照组水平;益气补血方组小鼠淋巴细胞 IL-2 的分泌水平与对照组比较差异无显著性(P >
0. 05) ;在 48 h检测点,益气补血方联合化疗组的 IL-6 表达水平虽有一定程度提高,但仍显著低于对照组(P <
0. 05)。结论:益气补血方具有减轻环磷酰胺化疗引起的小鼠骨髓抑制,保护小鼠淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的
作用。
关键词 益气补血方;化疗;T淋巴细胞;细胞增殖;细胞因子分泌
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)02-0287-05
收稿日期:2012-06-25
基金项目:广东省建设中医药强省科研课题(2010419) ;国家自然科学基金(31100664)
作者简介:沈晗(1980-) ,男,讲师,在读博士研究生,专业方向:肿瘤免疫学。
* 通讯作者:黄树林,Tel:020-39352632,E-mail:shulhuang@ sina. com。
免疫系统是肿瘤患者接受化疗时最易受损的器
官之一,如何在化疗同时保护淋巴细胞的免疫功能
是值得重视的问题。目前,中医药的应用在降低放
化疗毒副作用方面取得了显著疗效,笔者在前期工
作中,针对化疗药物引发的血虚症状,研制了以黄
芪、当归和阿胶三味中药为基本组方的益气补血方,
并在环磷酰胺诱导的小鼠化疗骨髓抑制模型上证
实,益气补血方能有效促进小鼠骨髓细胞增殖,促进
造血功能,恢复骨髓损伤〔1,2〕。本实验探讨了益气
补血方在保护接受化疗后的小鼠 T 淋巴细胞增殖
能力和细胞因子分泌功能上的可能作用。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 SPF级雌性 C57BL /6 小鼠 40 只,
体质量 20 ~ 25 g,购自广东药学院实验动物中心,许
可证号:SYXK(粤)2012-0125。
1. 2 药物与试剂 益气补血方基本组方比例为黄
·782·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 2 期 2013 年 2 月