全 文 ：收稿日期:2012-10-28; 修订日期:2013-04-07
基金项目:国家“重大新药创制”科技重大专项
( No． 2010ZX09401 － 304 － 105C)
作者简介:包永睿( 1978 － ) ，男( 汉族) ，辽宁抚顺人，现任辽宁中医药大学
药学院实验师，硕士学位，主要从事中药质量分析及作用机制研究工作．
* 通讯作者简介:孟宪生( 1964 － ) ，男( 汉族) ，辽宁沈阳人，现任辽宁中医
药大学药学院教授，博士学位，主要从事从事中药组分配伍、代谢组学及
药品质量分析工作．
白茅根水提物对人肝癌细胞株 SMMC － 7721
细胞周期及细胞凋亡的影响
包永睿1，王 帅1，孟宪生1* ，杨欣欣1，王 莹1，2
(1．辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600; 2．通辽市职业学院，内蒙古 通辽 028000)
摘要:目的 研究白茅根水提物对人肝癌细胞株 SMMC － 7721 增殖抑制率、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法 采用
MTT法研究白茅根水提物对人肝癌细胞 SMMC －7721 的抑制率及抑制率与时间剂量关系;并通过 PI染色法和 Annexin V
－ EGFP /PI双染法研究白茅根水提物作用于人肝癌细胞株 SMMC －7721 后细胞周期 DNA含量变化及对细胞凋亡率的影
响。结果 不同浓度的白茅根水提物处理肝癌 SMMC －7721 细胞 24，48，72，96 h后，均呈现出显著的细胞增殖抑制作用，
抑制作用具有明显的时间 －剂量 －效应关系，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ;细胞周期与细胞凋亡实验结果显示不同浓
度的白茅根水提物处理肝癌 SMMC －7721 细胞 46 h后可显著增加肝癌细胞凋亡率，差异有统计学意义( P ＜ 0． 001) ，作
用 36 h后，可增加 S期比例同时降低 G2 /M期细胞比例，差异有统计学意义( P ＜ 0． 001) 。结论 白茅根水提物对人肝癌
细胞株 SMMC －7721 具有明显的增殖抑制作用并可诱导其凋亡，该作用是通过抑制 G2 /M期细胞比例，将细胞周期阻滞
在 S期实现的。
关键词:白茅根水提物; MTT法; 流式细胞技术; 人肝癌细胞株 SMMC －7721
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 07． 018
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 07-1584-03
Effect of flavonoids of Lalang Grass Ｒhizome Water Extract on cell cycle and apoptosis
induction of human hepatoma cell line SMMC －7721
BAO Yong-rui1，WANG Shuai1，MENG Xian-sheng1* ，YANG Xin-xin1，WANG Ying1，2
( 1． College of pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China; 2．
Tongliao City Vocational College，Tongliao 028000，China)
Abstract: Objective To investigate the inhibitory effects，cell cycle and apoptosis of human hepatoma cell line SMMC － 7721 in-
duced by different concentrations of flavonoids of Lalang Grass Ｒhizome Water Extract．Methods MTT method was used to study
the inhibitory rate and time － dose relationship of flavonoids on SMMC －7721． Flow cytometry PI staining and Annexin V － EGFP /
PI double staining were used to measure the DNA concentration and apoptosis rate in SMMC － 7721 after the flavonoids of Lalang
Grass Ｒhizome Water Extract of different concentration were cultured． Ｒesults With different concentrations of Lalang Grass Ｒhi-
zome Water Extract processing liver cancer SMMC － 7721 cells 24，48，72，96 h later，it showed significant cell proliferous inhibi-
tion with obvious time － dose － effect relationship，and the difference was statistically significant ( P ＜ 0． 05) ． The cell cycle and
cell apoptosis experimental results showed that the different concentration of Lalang Grass Ｒhizome Water Extract processing liver
cancer SMMC － 7721 cells 46 h can significantly increase the liver cell apoptosis rate，the difference was statistically significant
( P ＜ 0． 001) ，acting 36 h，it can increase S period ratio at the same time reduce the G2 /M phase cell proportion，and the differ-
ence was statistically significant ( P ＜ 0． 001) ． Conclusion The Lalang Grass Ｒhizome Water Extract could inhibit the hepatoma
cell line SMMC － 7721 in vitro by inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis of the cell，the effect was implemented by in-
hibiting G2 / M phase cell proportion and made the cell cycle arrested in S phase．
Key words: Lalang Grass Ｒhizome Water Extract; MTT method; Flow cytometry; Human hepatoma cell line SMMC －
7721
白茅根为禾本科植物白茅 Imperata cylindrical Beauv． var．
major (Nees)C． E． Hubb．的干燥根茎。性甘味寒，具有凉血止血，
清热利尿的功效［1］。临床常用于治疗水肿、高血压、急慢性肾炎
等病［2，3］。近年来发现其具有一定的抗肿瘤作用，但对于其抗癌
的作用机制尚不清楚。本实验研究白茅根水提物对人肝癌细胞
株 SMMC －7721 增殖抑制率、细胞周期及细胞凋亡的影响，旨在
揭示其抗癌作用机理，为研制抗肝脏肿瘤新药提供一定的实验基
础。
1 材料
1． 1 细胞株 人肝癌 SMMC － 7721 细胞株(购自上海复蒙生物
有限公司)。
1． 2 药品与试剂 白茅根水提物(由辽宁中医药大学分析测试
中心提供，按文献［4］方法制备)［5］;胎牛血清(美国 Hyclone 公
司) ;四甲基偶氮唑盐、胰蛋白酶、DMEM 培养基(均购自美国
GIBCO公司) ;二甲基亚砜(DMSO) (北京索莱宝科技有限公
司) ;Annexin V /PI 双染色试剂盒(南京凯基生物技术有限公
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司) ;细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有
限公司) ;实验中所有溶液均由 Milli － Q水配制而成。
1． 3 仪器与设备 二氧化碳培养箱(德国 NUAIＲE 公司) ;SUN-
ＲISE酶标仪(瑞士 TECAN 公司) ;流式细胞仪(美国 BD 公司) ;
倒置相差显微镜(德国 Motic 公司) ;电子天平(德国 Saritorius 集
团) ;血球计数板(上海求精生化仪器厂) ;低速离心机(北京医用
离心机厂)。
2 方法
2． 1 白茅根水提物体外药效学检测
2． 1． 1 细胞培养 人肝癌 SMMC －7721 细胞株，按贴壁细胞培养
法，以适量浓度接种于培养瓶中，加入含体积分数为 10%小牛血
清的 DMEM培养液，置于 37℃恒温、5% CO2、饱和湿度的培养箱
中常规培养，2 天换液并传代一次，取对数生长期细胞作后续实
验［6］。
2． 1． 2 MTT法检测细胞生长抑制率 取对数生长期的细胞，调
整细胞浓度为 5 × 104 个 /ml，接种于 96 孔培养板中，每孔 100
μl，继续培养约 12 h待细胞贴壁完全。分别设试验孔、空白对照
孔(加细胞，但不加药物)和空白调零孔(只加培养基，酶标仪调
零用) ，每组设 5 个复孔。培养 24，48，72，96 h后，每孔避光加入
MTT(5 mg /ml)溶液 20 μl，继续培养 4 h后，吸弃孔内上清液，每
孔加入 DMSO 150μl。震荡混匀，待紫色结晶充分溶解后。用酶
标仪在 492 nm波长下扫描，测定吸光值(OD) ;计算脂肪酸类成
分对细胞的生长抑制率。
细胞存活率(%)= OD试验组 /OD对照组 × 100%
细胞生长抑制率(%)= (1 － OD 试验组 /OD 对照组)×
100%
2． 1． 3 统计学方法 实验数据采用 SPSS16． 0 进行统计学处理，
多组间比较采用单因素方差分析，计算半数有效浓度(IC50)。
2． 2 不同浓度白茅根水提物对人肝癌细胞株 SMMC －7721 细胞
周期的影响
2． 2． 1 药物配制及分组 精密称取白茅根水提物适量，置 25 ml
量瓶中，加 0． 5%的 DMSO培养液超声溶解并定容至刻度，摇匀，
制成浓度为 0． 641 2 mg /ml 的储备液;再按比例稀释成高、低两
个剂量组，其浓度分别为0． 641 2，0． 321 0 mg /ml，0． 22 μm 微孔
滤膜过滤，备用。
2． 2． 2 碘化丙啶 PI 单染法检测细胞周期 取对数生长期细胞，
培养瓶中常规培养至细胞浓度达到 1 × 107 个 /瓶，分别加入
0． 641 2，0． 3210 mg /ml白茅根水提物药液，对照组加入等体积培
养液，培养 36 h后收集细胞。用冰浴预冷的 PBS 液洗涤细胞 2
次，1 000 r /min离心 5 min，弃去上清液。分别加入预冷的 70%
乙醇溶液，于 4℃下固定 12 h，1 000 r /min 离心 5 min，弃去上清
液，PBS液洗涤细胞 1 次。每组细胞样品中加入 0． 5 ml碘化丙啶
染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴 30 min，用流式
细胞仪在激发波长 488 nm 处检测红色荧光，同时检测光散射情
况，结果用细胞周期拟和软件 ModFit分析;分析时，使用 FL2 － w
和 FL2 － A显示，去除联体细胞［7］。
2． 3 不同浓度白茅根水提物对人肝癌细胞株 SMMC －7721 细胞
凋亡的影响
2． 3． 1 药物配制及分组 精密称取白茅根水提物适量，置 25 ml
量瓶中，加 0． 5%的 DMSO 培养液超声溶解并定容至刻度，制成
浓度为 0． 963 1 mg /ml 的储备液。然后按比例稀释分成高、中、
低三个剂量组，其浓度分别为 0． 963 1，0． 641 2，0． 321 0 mg /ml。
2． 3． 2 AnnexinⅤ － EGFP /PI双染色法检测细胞凋亡 取对数生
长期细胞，以 1 × 105 个 /孔接种到 6 孔板中，培养 24 h后，每孔加
入不同组别的药物 1 ml，对照组加入等体积的细胞培养液，分别
培养 24 h 和 48h 后，收集细胞，用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，
1 000 r /min离心 5 min，收集细胞，加入 500 μl 的 Binding Buffer
悬浮细胞，然后再加入 5μl AnnexinV － EGFP和 5μl Propidium Io-
dide，混匀，室温下避光反应 5 ～ 15 min，在 1h 内，用流式细胞仪
Cell Quest 软件检测并分析细胞凋亡和死亡的情况。
2． 4 统计学方法 实验数据采用 珋x ± s表示，用 SPSS16． 0 软件进
行统计学分析，参数统计采用 t 检验;* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜
0． 01，＊＊＊P ＜ 0． 001 表示差异具有统计学意义。
3 结果与分析
3． 1 白茅根水提物对人肝癌 SMMC －7721 细胞株的增殖抑制作
用 2． 5 ～ 40 mg·ml －1白茅根水提物作用于人肝癌 SMMC － 7721
细胞，作用 24，48，72，96 h后，与空白对照组比较，结果见表 1、图
1。
表 1 白茅根水提物
对人肝癌细胞株 SMMC －7721 生长曲线影响(珋x ± s)
给药时间 /
h
给药浓度 /
mg·ml －1
OD值
(珋x ± s)
细胞抑制率
(%)
IC50 /
mg·ml －1
24 0 0． 571 ± 0． 016 － 11． 329 4
2． 5 0． 531 ± 0． 034* 7． 04
5 0． 439 ± 0． 025* 23． 06
10 0． 364 ± 0． 039* 36． 23
20 0． 180 ± 0． 033* 68． 43
40 0． 044 ± 0． 016* 92． 32
48 0 1． 207 ± 0． 091 － 7． 110 3
2． 5 0． 928 ± 0． 091* 23． 07
5 0． 804 ± 0． 039* 33． 38
10 0． 563 ± 0． 090* 53． 38
20 0． 308 ± 0． 062* 74． 46
40 0． 040 ± 0． 011* 96． 70
72 0 1． 227 ± 0． 047 － 4． 197 9
2． 5 0． 687 ± 0． 045* 44． 03
5 0． 574 ± 0． 024* 53． 18
10 0． 476 ± 0． 035* 61． 17
20 0． 156 ± 0． 019* 87． 28
40 0． 042 ± 0． 016* 96． 56
96 0 1． 430 ± 0． 082 － 7． 535 7
2． 5 1． 155 ± 0． 140* 19． 22
5 0． 904 ± 0． 056* 36． 75
10 0． 729 ± 0． 096* 49． 02
20 0． 298 ± 0． 037* 79． 13
40 0． 082 ± 0． 013* 94． 24
与对照组比较，* P ＜ 0． 05;n = 6
图 1 不同浓度不同作用时间白茅根水提物对人肝癌细胞
SMMMC －7721 细胞增殖的影响
如表 1、图 1 所示，白茅根水提物能有效抑制 SMMC － 7721
细胞增殖，且随着药物浓度的增加及作用时间的延长，细胞抑制
率明显增加。结果提示药物对细胞抑制作用与给药剂量、时间存
在明显的依赖性，呈较好的时间 －剂量 －效应关系。
3． 2 不同浓度白茅根水提物对人肝癌细胞株 SMMC －7721 细胞
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周期的影响 见图 2 及表 2。
图 2 白茅根水提物细胞周期分布图示
表 2 白茅根水提物作用于细胞后细胞周期 DNA含量变化(珋x ± s)
组别
药物浓度 /
mg·ml －1
细胞周期分布(珋x ± s)
G0 /G1 S G2 /M
空白 0 75． 05 ± 1． 52 17． 27 ± 1． 46 7． 68 ± 1． 09
低剂量 3． 2 73． 67 ± 1． 43 22． 74 ± 1． 21＊＊＊ 3． 59 ± 1． 03＊＊＊
高剂量 6． 4 75． 29 ± 1． 74 24． 27 ± 2． 64＊＊＊ 0． 44 ± 1． 38＊＊＊
与阴性对照组比较，＊＊＊P ＜ 0． 001;n = 6
如图 2、表 2 所示，在 G0 /G1 期，给药组与空白组比较 DNA
含量基本不变;在 S 期，给药组与空白组比较 DNA 含量明显增
加，高、低剂量组较空白组均有显著差异 P ＜ 0． 001;在 G2 /M 期，
给药组与空白组比较 DNA含量明显降低，高、低剂量组较空白组
均有显著差异 P ＜ 0． 001。说明白茅根提取物能抑制 G2 /M 期细
胞比例，将细胞周期阻滞在 S期。
3． 3 不同浓度白茅根水提物对人肝癌细胞株 SMMC －7721 细胞
凋亡的影响 见表 3。
如表 3 所示，当药物作用细胞 22 h后，高、中、低剂量组与对
照组比较，晚期凋亡比例及凋亡总比例均有显著差异(P ＜
0． 001) ，早期凋亡时只有高剂量组表现出了显著性差异(P ＜
0． 01) ;当药物作用细胞 46h后，高、中、低剂量组与对照组比较早
期凋亡比例、晚期凋亡比例及凋亡总比例均有显著差异(P ＜ 0．
001) ;且随着作用时间的延长和药物浓度增高，细胞凋亡率也随
之增大，实验结果表明，白茅根水提物具有明显的促进 SMMC －
772l细胞凋亡的作用。
表 3 不同时间不同剂量白茅根水提物对细胞凋亡率的影响
时间 /h 样品 晚期凋亡比例 UＲ 早期凋亡比例 LＲ 凋亡总比例(%)
24 对照 0． 49 ± 0． 23 4． 85 ± 1． 22 5． 34 ± 1． 24
高剂量 56． 52 ± 1． 15＊＊＊ 3． 05 ± 0． 44＊＊ 59． 57 ± 1． 87＊＊＊
中剂量 55． 46 ± 1． 37＊＊＊ 5． 87 ± 1． 19 61． 33 ± 2． 31＊＊＊
低剂量 48． 37 ± 1． 29＊＊＊ 5． 71 ± 0． 88 54． 08 ± 2． 05＊＊＊
48 对照 2． 71 ± 0． 94 3． 98 ± 1． 72 6． 69 ± 2． 50
高剂量 60． 33 ± 1． 44＊＊＊ 30． 20 ± 1． 69＊＊＊ 90． 53 ± 2． 79＊＊＊
中剂量 61． 22 ± 1． 72＊＊＊ 24． 97 ± 2． 42＊＊＊ 89． 66 ± 1． 83＊＊＊
低剂量 44． 39 ± 1． 49＊＊＊ 20． 01 ± 1． 57＊＊＊ 65． 44 ± 2． 33＊＊＊
与阴性对照组比较，＊＊P ＜0． 01，＊＊＊P ＜0． 001
4 讨论
本实验通过 MTT法检测白茅根水提物对人肝癌细胞 SMMC
－7721 的生长抑制率，考察了不同给药剂量 2． 5 ～ 40 mg·ml －1，
不同给药时间 24，48，72，96 h的细胞生长抑制率，发现相同给药
时间下，随着药物浓度的增大，细胞抑制率均呈线性增大，表现出
了明显的剂量 －效应关系，且在给药浓度为 40 mg·ml －1时均可
达到 90%以上。在相同给药剂量下，随着给药时间的延长，细胞
抑制率也呈现出增长趋势，表现出了明显的时间 －效应关系，且
在给药 72h达到最佳状态。
根据 IC50计算结果，配制适当浓度药物进行细胞周期试验，
在 G0 /G1 期，各给药组与空白组比较 DNA 含量基本不变;在 S
期，高、低剂量组与空白组比较 DNA含量明显增加;在 G2 /M 期，
高、低剂量组与空白组比较 DNA含量明显降低，说明白茅根提取
物对 SMMC －7721 细胞的抑制作用是通过抑制 G2 /M 期细胞比
例，将细胞周期阻滞在 S期实现的。
细胞凋亡在肿瘤的发生发展中起重要作用，本实验结果显
示，随着药物浓度与给药时间的增加，细胞凋亡的比率逐渐上升，
呈现出明显的时间和剂量依赖效应。提示白茅根抗肝肿瘤的作
用机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，为抗肝癌药物的新
药开发研究提供了良好的实验基础与理论依据。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 中国药典，一部［S］． 北京:化学工业出版社，
2010:99．
［2］ 李立顺，时维静，王甫成，等． 白茅根化学成分、药理作用及在保健
品开发中的应用［J］．安徽科技学院学报，2011，25(2) :61．
［3］ 焦 坤，陈佩东，和颖颖，等． 白茅根研究概况［J］． 江苏中医药，
2008，40(1) :91．
［4］ 王 莹，孟宪生，包永睿，等． 白茅根水提物中绿原酸的含量测定
［J］．亚太传统医药，2011，7(3) :22．
［5］ 李 劲，孟宪生，包永睿．四味肝泰纳米颗粒对黄曲霉毒素 B1 诱导
大鼠肝癌的影响［J］．中国新药杂志，2012，21(5) :481，542．
［6］ 何冬梅，袁希福，李江滨，等．复方苦参胶囊对宫颈癌细胞增殖和细
胞周期的影响［J］．时珍国医国药，2012，23(7) :1737．
［7］ 张 艳，韩鹏黎，徐 霞，等．新型金属铜络合物对 SMMC － 7721 细
胞增殖与凋亡的影响［J］．中国药理学通报，2012，28(3) :417．
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