全 文 ：湖南林业科技　2008年第 35卷第 2期 研究报告
收稿日期:2008— 02 — 14
修订日期:2008— 03 — 01
外植体的选择和消毒对大叶榉组织培养的影响
汪灵丹 , 张日清 , 金晓玲
(中南林业科技大学资源与环境学院 , 湖南 长沙　410004)
摘　要:以大叶榉的顶芽 、腋芽 、茎段 、叶片等为外植体材料 ,进行组织培养 , 结果表明:在其他条件一致的情况下 ,不
同消毒方式 、不同采样时期 、不同外植体类型对大叶榉组织培养的影响不同。
关键词:外植体;大叶榉;组织培养;影响
中图分类号:S792.189.04　　　文献标识码:A　　　文章编号:1003— 5710(2008)02— 0021— 03
Efectofselectionanddisinfectionprocesingonexplantoftissue
cultureofZelkovaschneideriana
WANGLingdan, ZHANGRiqing, JINXiaoling
(ResourceandEnvironmentColege, CentralSouthUniversityofForestryandTechnology, Changsha　410004, China)
Abstract:UsingdissimilarityexplantofZelkovaschneiderianaHand.-Mazz.asaexperimentmaterialfortissueculture.Theresultsin-
dicate:Underthesistuationthatotherconditionsisconsistent, diferentdisinfectionmethod, diferentgenotype, differentgrowthstage,
differentphysiologyleaddiferentresultsintissuecultureofZelkovaschneiderianaHand.-Mazz.
Keywords:explant;ZelkovaschneiderianaHand.-Mazz.;tissueculture;effect
　　大叶榉(ZelkovaschneiderianaHand.-Mazz.)属
榆科(Ulmaceae)榉属(ZelkovaSpach),为落叶乔木 ,
主要分布江苏 、浙江 、湖南 、安徽 、广东 、广西 、云南等
地 ,是国家二级保护树种。榉属共 6种 , 我国产 4
种 ,即大叶榉 ,大果榉 、光叶榉 、台湾榉 。其中大叶榉
材质最优 ,木材黄褐色或红褐色 ,纹理直 ,结构细 ,质
地硬 ,少伸缩 ,抗压力强 ,耐水湿 ,耐腐朽 ,刨面光滑 ,
油漆后光亮度好 ,胶粘性能好 ,广泛用于造船 、高级
建筑 、高档家具 、胶合板高级饰面材等 ,被国家有关
部门列为家具用材一类材 、特级原木。大叶举抗风
抗烟尘 ,耐二氧化硫的性能强 ,有防风 、净化空气的
作用 ,是绿化 、营造防风林的好树种。由于其具有较
高经济 、生态和景观利用价值 ,故被大量的开发和利
用 ,现存大叶榉资源面临濒危 , 亟待保护和发
展 [ 1-3] 。组织培养是促进优良种苗快速繁殖与应
用 ,保护濒危物种等的有效方式。目前关于大叶榉
组织培养方面的研究比较少 ,据文献记载 ,国外只有
日本福冈县林业中心成功地进行了榉树组织培养研
究 ,而国内只有金晓铃 [ 4]等对榉树的生物学特性和
微繁技术进行了系统研究 ,榉树组培仍处于初期阶
段。本研究旨在在前人的基础上 ,就大叶榉的外植
体消毒和选择方面进行实验 ,对保护我国珍贵 、匮乏
的大叶榉资源在理论研究和实际应用中都具有参考
意义 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
实验材料来源于中南林业科技大学生态实验站
的成年大叶榉和本实验室 3月上旬播种的实生幼苗
大叶榉 ,所选外植体种类有成年大叶榉的腋芽 、茎段
和叶片 ,实生幼苗大叶榉的顶芽 、茎段 、叶片 。
1.2　实验方法
1.2.1　外植体的消毒方式对大叶榉组织培养的影
响
(1)先用自来水将外植体表面冲洗干净 ,再用
洗涤剂 (如洗衣粉 、洗涤灵等 )溶液浸泡 15 ～
30min,同时用毛刷不断搅动 ,并用毛刷蘸洗涤剂溶
汪灵丹 ,等:外植体的选择和消毒对大叶榉组织培养的影响
液仔细轻轻的刷洗 ,以将外植体表面污垢清洗干净
为准 ,最后用流动的清水冲洗 30 ～ 60min。
(2)在超净台上进行外植体的表面消毒和接种
工作。于每个无菌三角瓶(100mL,以下同)中放置
约 10个外植体准备消毒。先将外植体用 75%的酒
精浸泡 30s左右 ,再用 0.1%HgCl2对外植体进行消
毒 ,处理时间分别为 6 min、8 min、10min、12min,接
种在 WPM+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L的培养
基上 ,诱导愈伤组织 ,培养基的 pH值为 5.8,糖浓度
20g/L,琼脂浓度 6.7g/L,培养温度 25±2℃,光照
2 000 lx,每天光照 12 ～ 14 h(如下同),每种处理 20
个样本 ,重复 3次 。对实验结果进行观察 ,统计外植
体的污染率 、死亡率 、存活率 ,寻找最佳的大叶榉组
织培养的外植体消毒时间 。
1.2.2　外植体的采样时期对大叶榉组织培养的影
响　选择 3月 、5月 、8月 、11月不同时期采集的外
植体 ,在相同培养基 、培养时间和培养条件下进行愈
伤组织诱导 。每处理样本 20个 ,重复 3次。同时 ,
对实验结果进行观察 ,统计外植体污染率 、愈伤组织
诱导率及愈伤组织生长情况。
1.2.3　外植体的类型对大叶榉组织培养的影响　
选择大叶榉实生幼苗的顶芽 、茎段和叶片以及成年
大叶榉当年萌发的腋芽 、嫩茎和叶片 ,在相同培养
基 、培养时间和培养条件下进行愈伤组织诱导培养 。
每处理样本 20个 ,重复 3次 。同时 ,对实验结果进
行观察 ,统计接种数 ,诱导愈伤组织数 、愈伤组织诱
导率 、污染率和褐变率 。
2　结果与分析
2.1　外植体的消毒方式对大叶榉组织培养的影响
由表 1可以看出 ,成年大叶榉腋芽的消毒以
0.1% HgCl2处理 10 ～ 12min效果最佳 ,其污染率
低 ,萌芽率最高。其中 ,用 0.1% HgCl2消毒处理
12 min时 ,芽组织的存活率最高 ,达 72%,污染率较
低 ,为 15%,用 0.1% HgCl2消毒处理 10 min时 ,腋
芽芽组织的成活率为 68%,污染率为 20%。而当
0.1% HgCl2处理 6 ～ 8min时 ,虽然对外植体伤害不
大 ,但污染率很高 。所以 ,对成年大叶榉腋芽的消毒
液宜选择 0.1% HgCl2消毒 12min。而幼年大叶榉
顶芽消毒以 0.1% HgCl2消毒 10 min效果最佳 ,存
活率为 83%,污染率为 5%。由表 2可以看出 ,大叶
榉茎段和叶片的消毒 ,以 0.1% HgCl2处理 10min
最为适宜。其污染率 、死亡率较低 ,萌芽率最高 。其
表 1　消毒处理对腋芽(成)和顶芽(幼)的影响
0.1% HgCl2
处理时间(min)
腋芽
污染率
(%)
死亡率
(%)
存活率
(%)
顶芽
污染率
(%)
死亡率
(%)
存活率
(%)
6 45 5 50 35 8 57
8 34 5 61 15 10 75
10 20 12 68 5 12 83
12 15 13 72 2 34 64
表 2　消毒处理对叶片和茎段的影响
0.1% HgCl2
处理时间(min)
茎段
污染率
(%)
死亡率
(%)
存活率
(%)
叶片
污染率
(%)
死亡率
(%)
存活率
(%)
6 33 8 59 27 7 66
8 15 11 74 12 10 78
10 5 10 85 5 13 80
12 3 27 67 2 37 58
中茎段用 0.1% HgCl2消毒 10min,污染率为 5%,
存活率达 85%;叶片用 0.1HgCl2消毒 10 min,污染
率为 5%,存活率达 80%。可见 ,成年大叶榉的外植
体消毒所需时间相对较长 ,原因可能是生长于野外
的自然环境 ,带有的杂菌较多;而所采集于组培室的
幼嫩实生苗 ,一方面外植体生长环境由人工控制 ,污
染较少;另一方面外植体刚刚长出来 ,感染杂菌的机
率也低 ,所以所需的消毒时间较短 。
2.2　外植体采样时期对大叶榉组织培养的影响
一年内的不同时期采集外植体 ,其诱导率 、污染
率和生长情况均有较大差异 ,由表 3可知 , 3月是大
叶榉最好的采样时期 ,愈伤组织诱导率最高 , 为
95.8%,污染率最低 ,为 3%,且生长良好。5月和 8
月外植体愈伤组织诱导率较高 ,但污染率也高 。而
在 11月份采样 ,愈伤组织诱导率高达 93.1%,且污
染率也较低。方差分析结果表明 , 8月采集的外植
体 ,其愈伤组织诱导率与 3月份的存在极显著差异
(a), 5月和 11月的也存在显著差异(b)。可能的
原因是:3月是大叶榉的萌芽生长季节 , 生命力比
较旺盛 ,抽出的新枝幼嫩且带菌少 ,而且此时大部分
病菌还未到发生季节 ,所以污染率低 ,萌芽率高;而
5月和 8月正是高温高湿的季节 ,此时外植体的表
面滋生有大量的微生物 ,而且生长繁育快 ,所以污染
率比初春高 ,但这时也是植物旺盛生长的时期 ,植物
本身积累了大量的营养物质和内源激素 ,所以萌芽
率也较高;11月份大叶榉冬季枝取于休眠期 ,此时
气温低 、雨水少 、病菌等不易滋生 、材料不易污染 。
此结论与金晓玲等 [ 4]的研究结论一致。但与大多
数研究者得出的在生长末期 ,或已进入休眠期取材 ,
外植体对诱导反应迟钝或无反应而应在生长季节开
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研究报告　　　
表 3　采样时期对大叶榉组织培养的影响
采样时期(月) 愈伤组织诱导率(%) 污染率(%) 生长情况
3 95.8±1.43a 3 出愈时间较快 ,长势好 ,黄绿色
5 90±2.13b 15 出愈时间较快 ,长势好 ,黄绿色 ,易褐化
8 79.1±0.93 35 出愈时间慢 ,长势弱 ,黄色 ,易褐化
11 93.1±1.14b 5 出愈时间较慢 ,长势好 ,黄绿色
　　注:培养基 WPM;a表示 0.01水平的极显著差异 , b表示 0.05水平的显著差异。
始取材的结论不一致 ,其原因可能与大叶榉的生理
特性有关 ,尚待进一步研究 [ 5-6] 。
2.3　外植体类型对大叶榉组织培养的影响
由表 4可以得出 ,大叶榉幼年型外植体材料的
愈伤组织诱导率明显高于成年型材料 ,而污染率和
褐变率低于成年型材料 。幼年型材料实生苗的顶
芽 、茎段和叶片的愈伤组织诱导率分别是 98.0%、
80%、66.7%,明显高于成年型材料。而污染率和褐
变率 ,幼年型外植体材料明显低于成年型外植体材
料 ,特别是褐变率 , 幼年型材料的褐变率未超过
5%,而成年大叶榉外植体的褐变率高达 30% ～
40%。可能的原因是:成年型外植体的树龄较老 ,
木质化程度高 ,内源激素也不同 ,加之生长于外界自
然条件下 ,所以容易污染和褐化。根据外植体选取
的污染少易启动原则 [ 7-8] ,综合以上的实验结果得
出 ,幼年型的大叶榉实生苗的顶芽 、茎段和叶片在大
叶榉组织培养中都是很好的外植体 ,而成年型大叶
榉的外植体材料易污染和褐变 ,组培不易成功 ,所
以 ,在后期的组织培养过程中主要采用幼年型大叶
榉的外植体作为实验材料 。
表 4　外植体类型对大叶榉组织培养的影响
外植体 接种数(块)
出愈数
(块)
诱导率
(%)
污染率
(%)
褐变率
(%)
顶芽(幼) 50 49 98.0 5 3
茎段(幼) 48 47 80.0 5 3
叶片(幼) 30 23 66.7 6 5
腋芽(成) 25 23 92.0 15 35
茎段(成) 40 38 71.4 9 38
叶片(成) 40 30 42.3 10 45
3　结论与讨论
外植体的消毒和选择对组织培养快速繁殖是非
常重要的。不同的消毒方式 、不同采样时期 、不同外
植体类型对大叶榉组织培养的影响不同。外植体取
样时植株的年龄 、发育阶段和生长季节不同 ,可导致
外植体生理生化状态差异 ,从而影响组织培养的形
态发生 ,如外植体大小 、极性状况及其腋芽在母枝上
所处的段位等对外植体的诱导 、生长与发育都有影
响 。
(1)外植体消毒时 ,消毒药剂浓度太低 ,时间太
短 ,不利于污染的控制;消毒药剂浓度太高 ,时间太
长 ,会破坏外植体的细胞 ,由于细胞对自身的保护 ,
细胞就不断的产生大量次生物质 ,从而引起细胞毒
害 ,产生褐化甚至死亡 ,导致外植体的存活率下降 。
在本实验中 ,采用 70%酒精 30s, 0.1%升汞消毒 10
～ 12 min左右 ,基本上能达到较好的消毒效果 。
(2)外植体采集的季节不同 ,组织培养效果不
同。我们分别于 3月 、5月 、8月 、11月进行外植体
采集 ,实验结果表明 ,大叶榉较适宜的采样季节是 3
月 ,萌芽率较高 ,达 95.8%,组织培养容易成功。
(3)培养条件相同 ,不同类型的外植体愈伤组
织诱导率不同 。从实验结果看 ,幼年型材料的愈伤
组织诱导率明显高于成年型材料;幼年型材料中 ,
不同类型的外植体诱导率也不同 ,按愈伤组织诱导
率大小排序依次为:顶芽 >茎段 >叶片 ,结果与杨
乃博 [ 9-10]等人研究结论一致 ,这说明同一植株不同
器官虽然携带着相同的全套基因 ,但其组织培养结
果不一样 ,可能是与植物激素的分布有关 ,因植物体
内内源激素分布不均 ,导致了基因表达不一致。
参考文献:
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