全 文 ：江西农业大学学报 2013，35(1) :0184 － 0188 http:/ / xuebao． jxau． edu． cn
Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E － mail:ndxb7775@ sina． com
一株产紫杉醇的南方红豆杉
内生菌的分离与鉴定
李昆太，彭卫福，周 佳，黄 林，程 新*
(江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045)
摘要:以南方红豆杉植株为材料，采用组织块法从中开展内生菌的分离筛选，并借助薄层层析和高效液相色谱
对内生菌的发酵产物进行分析，最终获得 1株具有产紫杉醇能力的内生菌。根据菌株形态学观察以及 18S rRNA序
列分析，结果表明该菌株属于间座壳属(Diaporthe sp．) ，间座壳属内生菌产紫杉醇尚属首次报道。
关键词:南方红豆杉;内生菌;间座壳属;紫杉醇
中图分类号:S791． 49． 02 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2286(2013)01 － 0184 － 05
Isolation and Identification of a Paclitaxel-producing Endophyte
from Taxus chinensis var． mairei
LI Kun-tai，PENG Wei-fu，ZHOU Jia，HUANG Lin，CHENG Xin*
(College of Biological Science and Engineering，Jiangxi Agriculture University，Nanchang 330045，China)
Abstract:The endophytic strains were isolated and screened from Taxus chinensis var． mairei by the tis-
sue separating method，as a result a paclitaxel － producing endophyte was obtained by thin － layer chromatog-
raphy (TLC)and high performance liqiud chromatography (HPLC)analysis． Based on the morphological
characteristics and 18S rRNA sequences analysis，this endophyte belonged to Diaporthe sp． ． Worth notice，it
is the first report that Diaporthe sp． can produce paclitaxel．
Key words:Taxus chinensis var． mairei;endophyte;Diaporthe sp．;paclitaxel
紫杉醇(paclitaxel，商品名 taxol)系三环二萜类生物碱［1］，是当今世界公认的广谱、疗效确切的天然
抗癌药物。早在 1971 年，美国化学家 Wani等［2］最先从太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分
离提取到紫杉醇。由于紫杉醇在树皮中的含量极低(平均产量约 0． 015%)［3］，使得传统的从红豆杉植
株中直接提取紫杉醇的方式受到了极大的限制和挑战。因此，如何寻求到新的药源途径来生产紫杉醇，
成为了国内外药学界急需解决的课题。
植物内生菌在与宿主植物长期共进化过程中，可产生一系列具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫等作用
的生物活性物质［4 － 6］。因此，从植物内生菌中寻找并开发新的生物活性物质，正成为国内外学者研究的
热点。1993 年，Stierle等［7］首次从短叶红豆杉中分离到一株能产紫杉醇的内生真菌紫杉霉(Taxomyces
andreanae) ，该发现极大地激发了国内外学者开展产紫杉醇内生菌的研究热潮。
本文以南方红豆杉(Taxus chinensis var． mairei)植株为材料，从中分离筛选到 1 株具有产紫杉醇能
力的内生真菌，并通过菌株形态学观察以及 18S rRNA序列分析对该菌株进行了鉴定。
收稿日期:2012 － 07 － 27 修回日期:2012 － 10 － 22
基金项目:江西省科技支撑计划(20121BBG70017)和江西农业大学博士科研启动基金资助项目(08 － 2064)
作者简介:李昆太(1978—) ，男，副教授，博士，主要从事微生物学研究;* 通讯作者:程新，E －mail:xinch27@ sina． com。
DOI:10.13836/j.jjau.2013033
第 1 期 李昆太等:一株产紫杉醇的南方红豆杉内生菌的分离与鉴定
1 材料和方法
1． 1 主要仪器
摇床、离心机、培养箱、电子天平、高效液相色谱仪、超声波细胞破碎仪等。
1． 2 材料
供试植物为采自于江西农业大学中药园的南方红豆杉新鲜树枝，紫杉醇标准品(上海源叶生物工
程有限公司) ，牛肉膏(北京奥博星生物技术有限公司) ，蛋白胨(北京奥博星生物技术有限公司) ，其它
试剂均为国产分析纯。
1． 3 培养基
1． 3． 1 内生菌分离平板培养基 PDA培养基(g /L) :马铃薯(去皮煮汁，过滤取液)200;葡萄糖 20;琼
脂 20;pH自然。牛肉膏蛋白胨培养基(g /L) :牛肉膏 5;蛋白胨 10;氯化钠 5;琼脂 20;pH 7． 0 ～ 7． 2。高
氏一号培养基(g /L) :可溶性淀粉 20;KNO31;K2HPO4 0． 5;MgSO4·7H2O 0． 5;NaCl 0． 5;FeSO4·7H2O
0． 01;琼脂 20;pH 7． 2 ～ 7． 4。
1． 3． 2 内生菌发酵培养基(g /L) 马铃薯(去皮煮汁，过滤取液)200;葡萄糖 10;蔗糖 10;硫酸镁 0． 15;乙
酸钠 1． 0;苯丙氨酸 0． 02;pH自然。
1． 3． 3 内生菌鉴定培养基 察氏培养基(g /L) :硝酸钠 3． 0;磷酸氢二钾 1． 0;硫酸镁 0． 5;氯化钾 0． 5;
硫酸亚铁 0． 01;蔗糖 30;琼脂 20;pH自然。
1． 4 内生菌的分离纯化
采用组织块法对南方红豆杉内生菌进行分离［8］。将采集的新鲜南方红豆杉茎表面以无菌水冲洗
干净，在无菌操作室中用体积分数 75%的酒精溶液浸泡 3 min，以无菌水冲洗 4 至 5 次，然后用体积分
数 0． 1%升汞溶液浸泡 3 min，再用无菌水冲洗 4 ～5次。将经上述处理的材料按无菌操作技术，切成 0． 5 cm
× 0． 5 cm的小段，分别覆盖接种至 PDA、牛肉膏蛋白胨、高氏一号等分离培养基平板上，然后置于
28 ℃恒温培养箱中培养。当观察到组织块边缘有丝状真菌长出后，及时将边缘菌丝转接到新鲜的培养
基平板上进行划线纯化。
1． 5 内生菌产紫杉醇的鉴定
1． 5． 1 内生真菌的发酵培养方法 每支内生真菌的新鲜斜面以 10 mL 无菌水洗下菌丝体，打碎均匀
制成菌悬液。吸取 1 mL菌悬液接至装量为 50 mL/250 mL三角瓶的发酵培养基中，28 ℃振荡(150 r /min)
培养 7 d。
1． 5． 2 内生真菌发酵液的预处理［9］ 摇瓶发酵结束后，用干净的 4 层纱布过滤发酵液，分别收集滤液
和菌丝体。滤液用等体积的二氯甲烷萃取 2 次，每次 1 h，合并二氯甲烷萃取相，加入无水硫酸钠干燥，
过滤后 35 ℃下以旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到粗提物Ⅰ;菌丝体反复冻融 3 次后，用超声波细胞破碎
仪破碎菌体(可涂片在显微镜下观察菌丝破碎与否) ，加入 30 mL甲醇浸提 1 h，过滤后，35 ℃下以旋转
蒸发仪除去有机溶剂，得到粗提物Ⅱ;粗提物Ⅰ和Ⅱ合并，以 5 mL 甲醇溶解后，用薄层层析和 HPLC 法
进行紫杉醇的鉴定。
1． 5． 3 薄层层析(TLC)鉴定法 用毛细吸管吸取内生真菌发酵液的处理液，点样于硅胶 G 板(50 mm
×100 mm，使用前放入 105 ℃烘燥箱中活化 30 min)的底部，以紫杉醇标准品溶液为对照。点样后，用
甲醇∶氯仿 = 1∶ 7(V /V)的混合液为展开剂进行展层，展层结束后以饱和碘蒸气进行斑点的显色。
1． 5． 4 HPLC 鉴定法 高效液相系统:Aglient 1100 HPLC;色谱柱:Kromasil C18 column (4． 6 mm ×
250 mm，5 μm) ;流动相:H2O /乙腈 = 5 /5(v / v) ;流速:1 mL /min;检测波长:227 nm;柱温:25 ℃;进样
量:20 μL。
1． 6 内生菌的分类鉴定
1． 6． 1 菌株形态特征观察［10］ 经薄层层析与 HPLC 法确定产紫杉醇类物质的内生真菌，在察氏培养
基上分别采用点植培养法、载片培养观察法以及插片法观察菌落、菌丝体和孢子的形态特征，该菌株进
行初步鉴定。
1． 6． 2 18S rRNA 序列测定及系统进化分析 以内生真菌的基因组 DNA为模板，用 NS1(5 － GTAGT-
CATATGCTTGTCTC －3)和 NS6(5 － GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC －3)为 18S rRNA上下游引物
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江 西 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
图 1 红茎 －3发酵液处理物与紫杉醇标准品的薄层层析比较
Fig． 1 The TLC comparison between Red stem －3 fermentation
broths with standard paclitaxel
图 2 紫杉醇标准品(a)与红茎 － 3 发酵液处理物(b)的 HPLC图谱
Fig． 2 The HPLC figures of standard paclitaxel (a)and Red stem － 3 fermentation broths (b)
进行 PCR扩增。PCR产物经纯化后由上海生工生物工程有限公司测序。将得到的 18S rRNA 序列与
GenBank数据库中的序列进行 BLAST相似性比对，下载同源性较高的序列，保存成 FASTA格式的文件，
利用 MEGA 4． 0 软件构建系统进化树。
2 结果与分析
2． 1 南方红豆杉内生菌的分离及其发酵产物的初步鉴定
以南方红豆杉植株的茎部为材料，从中分离纯化得到 5 株内生真菌，初步命名为红茎 － 1、红茎 － 2、
红茎 － 3、红茎 － 4、红茎 － 5。将这 5 株内生真菌的发酵液处理物首先进行 TLC 分析，结果发现红茎 － 3
的发酵液处理物与紫杉醇标准品具有相同的比移
值(Rf≈ 0． 93)和颜色相近的显色斑点(图 1) ，这
初步表明红茎-3 可能具有产紫杉醇的能力。
为了进一步验证红茎 － 3 能否产紫杉醇，将
其发酵液处理物与紫杉醇标准品进行 HPLC 分
析，二者的 HPLC图谱如图 2 所示。
由图 2 可以看出，紫杉醇标准品和红茎-3 的
发酵液浸提物具有相同保留时间的洗脱峰，二者
均在 3． 1 min左右。综合红茎 － 3 发酵液浸提物
以及紫杉醇标准品的 TLC 和 HPLC 分析，可以初
步判定红茎 － 3 具有发酵产紫杉醇的能力。需要
说明的是，尽管初步判定了红茎 － 3 具有产紫杉
醇的能力，但是还需进一步对其发酵产物进行分
离纯化，并借助紫外光谱、质谱、红外光谱、核磁共振等技术手段进行结构解析。
2． 2 红茎 －3 的菌种鉴定
2． 2． 1 红茎 － 3 的菌株形态特征观察 红茎 － 3 菌株点植于察氏培养基平板上，菌丝生长速率快，培养
2 d后菌落直径可达 6 cm左右，3 d可长满整个培养皿。菌落在前 3 d 呈白色绒毛状，后期转变成深褐
色，如图 3 所示。借助插片法和载片法对红茎 － 3 的菌丝和分生孢子形态进行显微观察，可以看出红茎
－ 3 菌丝发达呈交织的分支状(图 4a) ，菌丝有横隔(图 4b) ，分生孢子呈椭圆形且紧密聚集形成子囊壳
结构(图 4c)。
根据以上形态特征观察，可初步鉴定红茎 － 3 为子囊菌亚门的核菌纲。
2． 2． 2 红茎 － 3 的 18S rRNA 序列测定及系统进化分析 将红茎 － 3(IS279)的 18S rRNA 序列与 Gen-
Bank 数据库序列进行 BLAST 相似性搜索，收集相似性较高的序列，利用 MEGA 4． 0 软件，Neighbor －
Joining法构建系统进化树，结果如图 5 所示。
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第 1 期 李昆太等:一株产紫杉醇的南方红豆杉内生菌的分离与鉴定
图 3 红茎-3 的菌落形态特征
Fig． 3 The morphologic colony of Red stem-3 (culture for 48 h)
图 4 红茎-3 的菌丝体及孢子形态图
Fig． 4 The morphologic hyphal and acervulus of endophyte Red stem-3
由图 5 可以看出，红茎 － 3 与间座壳
属 2 个菌株 (Diaporthe sp． MI 02 和
Diaporthe sp． MI 03)聚类在同一个分支
上，序列同源性为 99%。根据红茎 － 3 的
形态和生物学特征，及其序列同源性比较
的结果，内生菌红茎 － 3 菌株可鉴定为间
座壳属(Diaporthe sp．) ，并初步命名为 Di-
aporthe sp． H-3。
3 讨 论
目前的紫杉醇生产技术，即从红豆杉
原料中直接提取紫杉醇或其中间体的方法，已远远不能满足市场需求。由于微生物发酵法具有菌体生
长快、发酵周期短、产物产率高、生产成本低且发酵过程易实现自动化控制等诸多优势，因此利用植物内
生真菌工业化发酵产紫杉醇或中间体，是解决这个问题的有效途径。
到目前为止，国内外已报道的从红豆杉属植物中分离到的产紫杉醇内生真菌多达 20 多个属，且多
以霉菌为主，如 Taxomyces andreanae(紫杉霉属)、Fusarium lateritum(镰刀霉属)、Alternariu sp．(交链霉
属)、Pestalotiopsis micropora(盘多拉毛霉属)、Nodulisporium sylviform(多节孢属)等［11 － 12］。除了红豆杉属
植物外，从非红豆杉属植物中，如木橘［13］、榧树［14］、夹竹桃［15］、柏树［16］等，也分离筛选到了可产紫杉醇
的各种内生真菌。这充分说明了紫杉醇产生菌具有生物多样性，同时也显示了紫杉醇产生菌宿主的生
物多样性。
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江 西 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
图 5 红茎-3 的 18S rRNA序列系统进化树
Fig． 5 The phylognetic tree of Red stem-3 18S rRNA sequences
迄今，国内外许多学者不
仅在产紫杉醇内生菌的分离
筛选方面做了大量的工作，而
且就产紫杉醇内生菌的菌种
选育及其发酵工艺优化等方
面也进行了大量研究［17 － 19］。
尽管利用内生真菌进行紫杉
醇的发酵生产已显示出诱人
的前景和巨大的潜力，而且借
助高产菌种的选育、发酵条件
的优化等手段使得内生菌产
紫杉醇的能力得到了大幅度
的提高，但是这些研究大多停
留在实验室阶段，目前仍难以
实现中型或大型工业化规模
的发酵生产［20］。究其原因，
还在于缺乏适合于工业化的
高产菌株。因此，寻找高产紫杉醇的内生菌株并建立合适的发酵工艺控制路线，仍然是今后的重点研究方向。
本文以南方红豆杉植株为材料开展了内生菌的分离筛选，并最终获得一株具有产紫杉醇能力的内
生真菌 Diaporthe sp． H-3。值得注意的是，目前有关间座壳属内生菌产紫杉醇的报道尚属首次，但 Dia-
porthe sp． H-3 发酵产紫杉醇的潜能还有待进一步的研究。
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